辛志敏，楊曉葵，余蘭，宋蕊，王芹，王樹玉

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院生殖科，北京 100026)

隨著胚胎培養(yǎng)基的改善，使卵裂期胚胎移植逐漸趨向于囊胚期移植。將移植日推遲到較晚的階段可以更好地進(jìn)行胚胎選擇，并可能顯著提高著床率和降低多胎率[1]。在體內(nèi)，胚胎在發(fā)育的第4天從輸卵管進(jìn)入子宮，這個(gè)時(shí)期已被證明是哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育的一個(gè)關(guān)鍵窗口。在這個(gè)階段，胚胎已經(jīng)融合，而且也激活了自身的基因組，使精確的體內(nèi)平衡控制成為可能。但是，同取卵后第五天移植相比，第四天移植的胚胎在體外少培養(yǎng)一天，這是否會(huì)對(duì)胚胎的篩選優(yōu)化產(chǎn)生不利影響？因此，本文回顧性分析了第4天桑葚胚或第5天囊胚移植對(duì)妊娠結(jié)局的影響，進(jìn)一步探討第4天桑葚胚移植的可行性。

資料與方法

一、研究對(duì)象

回顧性分析2016年1月至2016年12月在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院生殖科行IVF-ET治療的患者資料。

納入/排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)女方基礎(chǔ)FSH水平<10 U/L；(2)女方體重指數(shù)(BMI)<28 kg/m2；(3)夫婦雙方染色體檢測(cè)均正常；(4)女方無(wú)子宮畸形、子宮內(nèi)膜異位癥、單側(cè)或雙側(cè)輸卵管積水及其他免疫性不孕或內(nèi)分泌疾??；(5)胚胎發(fā)育天數(shù)為 D4 或 D5。

共納入182例患者的182個(gè)周期。其中桑葚胚移植組(D4 組)102個(gè)周期，囊胚移植組(D5組)80 個(gè)周期。

二、研究方法

1.控制性超排卵：按本中心常規(guī)促排卵方案進(jìn)行，Gn啟動(dòng)劑量根據(jù)患者年齡、基礎(chǔ)FSH水平、竇卵泡數(shù)和既往促排卵卵巢反應(yīng)情況決定，啟動(dòng)后根據(jù)卵巢反應(yīng)情況調(diào)整劑量。當(dāng)有1個(gè)卵泡直徑≥18 mm或2個(gè)卵泡直徑≥17 mm時(shí)注射HCG(艾澤，默克雪蘭諾，瑞士)250 μg，HCG后34～36 h陰道B超引導(dǎo)下穿刺取卵。

2.胚胎培養(yǎng)與移植：卵子及胚胎的培養(yǎng)采用澳大利亞COOK系列序貫培養(yǎng)基，精液處理采用上游法。獲得的卵冠丘復(fù)合物體外培養(yǎng)4～6 h后行常規(guī)IVF受精，受精后16～20 h觀察原核情況，出現(xiàn)兩原核(2PN)為正常受精。取卵后D4或D5選擇優(yōu)質(zhì)桑葚胚或囊胚行胚胎移植，移植術(shù)后予以黃體支持。

3.胚胎質(zhì)量評(píng)估：第4天的評(píng)分系統(tǒng)參照Tao等[2]評(píng)分系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)(1～4級(jí))：4級(jí)胚胎被認(rèn)為是最好的，胚胎為幾乎完全融合的；3級(jí)胚胎呈球形，75%以上的卵裂球融合，碎片<25%；2級(jí)胚胎形狀不規(guī)則，50%左右的卵裂球融合，25%<碎片<50%；1級(jí)是最差的，1級(jí)桑葚胚顯示不到30%的卵裂球處于融合過程中，碎片>50%。最佳的桑葚胚為卵裂球融合率超過75%的胚胎，3級(jí)和4級(jí)定義為優(yōu)質(zhì)桑葚胚。第5天的胚胎評(píng)分參考Gardner囊胚評(píng)分系統(tǒng)[3]，優(yōu)質(zhì)囊胚定義為4BB以上的囊胚。

4.觀察指標(biāo)：胚胎移植術(shù)后14 d查血β-HCG>5 U/L確定為妊娠試驗(yàn)陽(yáng)性。移植后35 d行B超檢查見孕囊及胎心搏動(dòng)確定為臨床妊娠。

主要觀察指標(biāo)及各種率的計(jì)算方法：種植率=種植胚胎數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%，臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%，異位妊娠率=異位妊娠數(shù)/臨床妊娠數(shù)×100%，流產(chǎn)率=(早期流產(chǎn)數(shù)+晚期流產(chǎn)數(shù))/臨床妊娠數(shù)×100%，足月分娩率=足月分娩數(shù)/分娩周期數(shù)×100%，活產(chǎn)率=活產(chǎn)的分娩數(shù)/移植周期數(shù)×100%。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、兩組一般情況比較

兩組患者年齡、不孕年限、基礎(chǔ)FSH水平、Gn天數(shù)和用量、HCG日E2水平、HCG日內(nèi)膜厚度和獲卵數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

二、兩組患者妊娠結(jié)局比較

比較兩組患者平均移植胚胎數(shù)、胚胎植入率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率、活產(chǎn)率及足月分娩率和異位妊娠率均無(wú)顯著差異(P>0.05)(表2)。

組 別周期數(shù)平均移植胚胎數(shù)胚胎植入率臨床妊娠率D4組1021.80±0.3234.52(68/197)45.09(46/102)D5組801.79±0.2835.33(53/150)48.75(39/80)組 別周期數(shù)流產(chǎn)率活產(chǎn)率足月分娩率異位妊娠率D4組10219.56(9/46)36.27(37/102)86.48(32/37)0(0/46)D5組8015.38(6/39)41.25(33/80)81.82(27/33)0(0/39)

討 論

在IVF-ET周期中，選擇最有發(fā)育潛能或整倍體的胚胎進(jìn)行移植是提高臨床妊娠率的前提。序貫培養(yǎng)系統(tǒng)的發(fā)明有效地彌補(bǔ)了單一培養(yǎng)液的不足，使獲得高質(zhì)量囊胚進(jìn)行移植成為現(xiàn)實(shí)，這無(wú)疑在很大程度上提高了ART的成功率。囊胚移植改善了胚胎-子宮內(nèi)膜的同步性，同時(shí)由于囊胚染色體異常比例下降，因此有更多的機(jī)會(huì)選擇合適的胚胎進(jìn)行移植[4-5]。然而，至今仍缺乏有效的指標(biāo)判斷卵裂期胚胎發(fā)育成囊胚的能力，即使使用目前最先進(jìn)的序貫培養(yǎng)基，第5天胚胎移植仍然存在因胚胎發(fā)育阻滯或囊胚質(zhì)量差而取消移植的潛在風(fēng)險(xiǎn)。Montag等[6]的研究表明，在發(fā)育后期沒有胚胎選擇的情況下，延長(zhǎng)胚胎培養(yǎng)是無(wú)益的，囊胚移植會(huì)增加移植的周期取消率、降低累積妊娠率。

在IVF-ET周期中，大部分移植的是卵裂期胚胎或囊胚，很少嘗試第4天桑椹胚的移植。卵裂期的優(yōu)質(zhì)胚胎有60%可能為非整倍體，而發(fā)育到桑葚胚及囊胚的非整倍體率可降低到30%左右[7]。研究發(fā)現(xiàn)，在胚胎發(fā)育的早期階段即在受精第3天之前，胚胎基因組轉(zhuǎn)錄處于沉默狀態(tài)，多數(shù)胚胎的合子基因組尚未被激活[8]。而在胚胎基因組活化后，細(xì)胞凋亡系統(tǒng)和細(xì)胞周期檢查點(diǎn)才可能被激活，從而導(dǎo)致桑椹胚到囊胚階段嵌合體胚胎的減少。Hsieh等[9]的研究亦表明在第4天與第5天胚胎中觀察到更高的整倍體率。另外，胚胎過早暴露于子宮環(huán)境不符合生理狀態(tài)，尤其是經(jīng)過卵巢刺激后高雌激素狀態(tài)的子宮內(nèi)膜。在體內(nèi)，胚胎是經(jīng)過輸卵管進(jìn)入宮腔，進(jìn)入宮腔時(shí)已發(fā)育到桑椹胚階段。因此，第4天桑椹胚移植比第2天或第3天移植更接近生理過程。此時(shí)子宮的蠕動(dòng)也明顯的減少，有利于胚胎的植入。由于胚胎著床發(fā)生在受精后 6～7 d，卵裂期移植的胚胎距離子宮內(nèi)膜的窗口期較遠(yuǎn)，與正常生理情況相差較大，但桑葚胚與第5天移植的囊胚時(shí)間較為接近，也可能是本研究結(jié)果妊娠率無(wú)明顯差異的原因。桑葚胚階段還有一些其他積極的方面。例如，輔助孵化更容易也更安全。因?yàn)榕咛ピ谌诤线^程中有一個(gè)較大的卵周間隙，相比而言可以降低囊胚期輔助孵化的風(fēng)險(xiǎn)；與第5天相比，第4天胚胎移植可縮短在體外培養(yǎng)的時(shí)間，而胚胎體外培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)可能會(huì)導(dǎo)致基因后天修飾的異常(基因印記異常)，進(jìn)而可能影響胚胎的發(fā)育及分化過程。另外，將胚胎延長(zhǎng)培養(yǎng)至囊胚階段最大的問題就是囊胚發(fā)育的不可預(yù)測(cè)性，從而顯著增加了胚胎丟失的風(fēng)險(xiǎn)。在囊胚培養(yǎng)時(shí)不能形成可利用囊胚的胚胎，如果在桑葚胚期將其移植，其在體內(nèi)環(huán)境中可能會(huì)繼續(xù)發(fā)育并成功著床[10]。

目前，胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)分仍然是最廣泛應(yīng)用的胚胎選擇方法。盡管卵裂期胚胎(第2天和第3天)和囊胚期胚胎(第5天和第6天)的分級(jí)系統(tǒng)已被廣泛接受，但第4天桑葚胚期的分級(jí)仍然不一致和不確定。到目前為止，關(guān)于這一階段胚胎分級(jí)的研究還很少。在20世紀(jì)早期，Tao等[2]在第4天移植桑葚胚后患者成功懷孕。Fabozzi等[11]也提出了一種桑葚胚評(píng)分系統(tǒng)，觀察兩個(gè)簡(jiǎn)單的參數(shù)(融合和碎片)來(lái)檢驗(yàn)桑椹胚形態(tài)是否可以預(yù)測(cè)囊胚發(fā)育和囊胚質(zhì)量，結(jié)果證明第4天的胚胎選擇可以替代卵裂期或囊胚階段的選擇[12]。Tao等[2]的研究發(fā)現(xiàn)，移植第3天胚胎與第4天桑葚胚的妊娠率無(wú)明顯差異，且第4天胚胎持續(xù)妊娠率高于第3天[7]。對(duì)第4天和第5天單胚胎移植的研究表明：兩組之間的臨床妊娠率沒有顯著差異[13-16]，但囊胚移植有助于篩選出最具發(fā)育潛能的胚胎，單囊胚移植仍然是試管嬰兒治療領(lǐng)域發(fā)展趨勢(shì)。

影響IVF-ET胚胎生長(zhǎng)與妊娠結(jié)局的因素較多，主要包括女方年齡、不孕時(shí)間、移植日子宮內(nèi)膜厚度等。本研究中兩組年齡、不孕年限及移植日子宮內(nèi)膜厚度等比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。獲卵數(shù)是影響IVF-ET妊娠結(jié)局的重要因素，理想的獲卵數(shù)可避免卵巢過度刺激綜合征，獲得較好的妊娠結(jié)局。本研究?jī)山M患者獲卵數(shù)比較，差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

本研究結(jié)果表明，第4天移植組和第5天移植組的平均移植胚胎數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎率、種植率、臨床妊娠率、活產(chǎn)率、足月分娩率及異位妊娠率均無(wú)顯著差異(P均>0.05)，與Li等[14]研究結(jié)果不同的是其研究顯示兩組之間足月分娩率有顯著差異(P<0.05)，兩組足月分娩率的差異可能與第4天移植組縮短胚胎體外培養(yǎng)時(shí)間有關(guān)，也可能是由于研究設(shè)計(jì)和選擇的患者人群之間的差異造成的。Glujovsky等[17]關(guān)于4項(xiàng)隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)的Meta分析顯示，與囊胚相比，卵裂期胚胎移植的累積妊娠率顯著增加。隨著延長(zhǎng)培養(yǎng)累積活產(chǎn)率降低的可能原因是：未形成囊胚的胚胎由于沒達(dá)到移植或冷凍標(biāo)準(zhǔn)被丟棄，但如果其在胚胎階段冷凍并在解凍后成功移植，則有臨床妊娠的可能。這意味著在體外培養(yǎng)中使胚胎損耗最小化可能導(dǎo)致更多懷孕的可能性，累積妊娠率也更高。本研究中由于部分患者尚未解凍剩余保存胚胎，我們未對(duì)納入的研究對(duì)象進(jìn)行累計(jì)妊娠率的統(tǒng)計(jì)，考慮到如果進(jìn)一步觀察隨訪，有可能得到有意義的臨床結(jié)局。

目前，單囊胚移植是一種發(fā)展趨勢(shì)[18]。本研究結(jié)果提示，第4天桑葚胚移植可能是另一種選擇，這一策略在不影響臨床妊娠率的情況下，具有第4天或第5天移植的靈活性。如果由于部分患者自身的特殊情況或者第5天移植會(huì)造成IVF實(shí)驗(yàn)室的非最佳培養(yǎng)條件(如IVF-ET周期過多或其他囊胚培養(yǎng)非最優(yōu))，第4天移植桑葚胚也是一種可行的選擇。