王秀娟，孫明玲，劉穎，王蕾，王新有，劉洋，趙芳，秦玉婷，郭新紅

原發(fā)免疫性血小板減少癥（primary immune thrombocytopenia,ITP）是一組以血小板計(jì)數(shù)減少，伴或不伴皮膚黏膜出血為特點(diǎn)的自身免疫性出血性疾病。該病的成人年發(fā)病率為（2～4）/10萬(wàn)［1］。目前，研究認(rèn)為多種細(xì)胞免疫功能異常參與了該病的發(fā)病機(jī)制［2］。既往大量研究表明，Th1/Th2亞群失衡可能參與了ITP的發(fā)病過(guò)程［3］。隨著研究的深入發(fā)現(xiàn)，Th17和Treg細(xì)胞間紊亂也參與了ITP的發(fā)病過(guò)程［4］。白細(xì)胞介素（IL）-33是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的IL-1家族的新成員，ST2是其特異性受體，有可溶型（sST2）和跨膜型（ST2L）兩種形式，IL-33可與受體ST2通過(guò)輔助蛋白相互作用，而sST2則作為誘騙受體結(jié)合IL-33，可阻斷ST2L/IL-33信號(hào)通路，介導(dǎo)Th17/Treg細(xì)胞免疫失衡，在自身免疫性疾病機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用［5］。目前，對(duì)sST2/IL-33的研究主要集中在干燥綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾?。?］，但兩者在ITP疾病中的作用機(jī)制尚不明確。本研究通過(guò)檢測(cè)初治ITP患者血清sST2/IL-33與Th17/Treg相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)水平，探討其在ITP發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2015年1月—2017年6月于新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液病中心就診的30例ITP患者為研究對(duì)象（研究組），男11例，女19例，年齡16～66歲，平均（41.80±14.48）歲），血小板計(jì)數(shù)（platelet,PLT）為（3～28）×109/L。所有患者均符合《成人原發(fā)免疫性血小板減少癥診斷與治療中國(guó)專家共識(shí)（2012年版）》，在確診前均未接受相關(guān)治療。選取同期20例健康體檢者為對(duì)照組，男8例，女12例，年齡16～65歲，平均（42.16±14.55）歲，血小板計(jì)數(shù)（114～256）×109/L。2組年齡（t=0.086）、性別（χ2=0.057）差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究方案在實(shí)施前，通過(guò)了新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試對(duì)象均知情同意，并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本收集 采集2組空腹靜脈血3 mL，2 500 r/min離心10 min，取上清血清置于1.5 mL EP管中，標(biāo)記編號(hào)后置于-80℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆?，用于?xì)胞因子的檢測(cè)。

1.2.2 標(biāo)本檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)血清中IL-33、sST-2、IL-17及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）水平，上述細(xì)胞因子的ELISA試劑盒均購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作。將需要檢測(cè)標(biāo)本放置于室溫20 min，將50μL稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品、血清標(biāo)本分別加入包被過(guò)夜的各反應(yīng)孔中，置37℃孵育1 h后洗滌。將親和鏈霉素-HRP 80μL加入各反應(yīng)孔中，振蕩混勻后于37℃孵育0.5～1 h后再次洗滌。每孔加入100μL TMB，振蕩混勻后于37℃避光溫育10 min，取出酶標(biāo)儀，于各反應(yīng)孔中加入2 mol/L硫酸50μL終止反應(yīng)，讀取酶標(biāo)儀450 nm處讀光密度（OD）值，根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算2組標(biāo)本中IL-33、sST2、IL-17及TGF-β的濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，滿足正態(tài)分布且方差齊性時(shí)，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，反之采用秩和檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組血清中IL-33、sST2、IL-17、TGF-β的表達(dá)水平比較 ITP組sST2、IL-17水平高于對(duì)照組，TGF-β表達(dá)水平低于對(duì)照組（P＜0.01），而IL-33表達(dá)水平與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of serum levels of sST2,IL-33,IL-17 and TGF-βbetween two groups表1 2組血清中sST2、IL-33、IL-17、TGF-β水平比較（ng/L，±s）

Tab.1 Comparison of serum levels of sST2,IL-33,IL-17 and TGF-βbetween two groups表1 2組血清中sST2、IL-33、IL-17、TGF-β水平比較（ng/L，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別n sST2IL-33IL-17TGF-β對(duì)照組ITP組t 20 30 189.2±23.7 222.8±32.6 3.958＊＊1 273.6±344.3 1 154.7±450.9 1.046 7.88±2.53 10.81±3.20 3.211＊＊3 121.6±938.8 2 489.8±703.8 2.763＊＊

2.2 ITP組血清中sST2的表達(dá)水平與IL-17、TGF-β的相關(guān)性分析 ITP組中sST2與TGF-β呈負(fù)相關(guān)（r=-0.471，P＜0.01），sST2與IL-17無(wú)相關(guān)性（r=0.189，P＞0.05）。

3 討論

ITP發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣，除體液免疫機(jī)制參與該病的發(fā)病外，多種免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子分泌異常也可導(dǎo)致自身免疫紊亂，致使ITP的發(fā)生［7］。Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞是新發(fā)現(xiàn)的CD4+T細(xì)胞亞群，在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用。IL-17是Th17細(xì)胞分泌的特征性細(xì)胞因子，是發(fā)揮炎癥效應(yīng)及介導(dǎo)自身免疫性疾病的關(guān)鍵因子。既往研究顯示，在ITP患者外周血清中IL-17表達(dá)水平增高，表明IL-17可能促進(jìn)炎癥反應(yīng)，參與ITP的發(fā)病機(jī)制［8］。本研究也發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，ITP組血清中IL-17表達(dá)升高，與上述結(jié)果相符。與Th17細(xì)胞作用相反，Treg細(xì)胞可分泌TGF-β，發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)和維持自身免疫耐受的作用，二者相互抑制與調(diào)節(jié)，若失衡會(huì)導(dǎo)致多種自身免疫性疾病的發(fā)生［9］。孫志強(qiáng)等［4］研究發(fā)現(xiàn)，ITP患者中Th17細(xì)胞數(shù)量增加，Treg細(xì)胞數(shù)量下降，認(rèn)為在ITP發(fā)病過(guò)程中可能存在Treg/Th17的免疫調(diào)節(jié)失衡。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，ITP組血清中TGF-β水平降低，提示Treg細(xì)胞的減少可能會(huì)打破機(jī)體的免疫平衡，導(dǎo)致機(jī)體免疫抑制功能減弱，T細(xì)胞異常激活，Th17/Treg比例失衡可能在ITP的發(fā)病中發(fā)揮一定作用。

IL-33是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的IL-1家族的新成員，可與ST2L結(jié)合，從而調(diào)節(jié)多種免疫細(xì)胞的活化、增殖及細(xì)胞因子的分泌，在機(jī)體免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用［10］。研究顯示，ST2L可表達(dá)于Treg細(xì)胞，IL-33與其結(jié)合可促進(jìn)Treg細(xì)胞的增殖，發(fā)揮免疫抑制作用［11］。sST2則作為誘騙受體結(jié)合IL-33，可阻斷ST2L/IL-33信號(hào)通路，對(duì)該通路起到負(fù)性調(diào)節(jié)作用［12］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，與正常健康者相比，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）患者血清中IL-33、sST2水平表達(dá)升高，IL-33與IL-17/IL-10的比值呈正相關(guān)，提示IL-33可促使Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞失衡，參與了RA的發(fā)病過(guò)程［13］；在抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體相關(guān)性血管炎中sST2水平升高，且在疾病活動(dòng)時(shí)升高更為顯著，但未見IL-33表達(dá)水平升高，考慮可能的原因是IL-33在體內(nèi)濃度較低，并能快速被水解所致［14］。目前，關(guān)于ST2L/IL-33在ITP中的研究甚少。本研究發(fā)現(xiàn)，在ITP患者中sST2表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高，且與TGF-β呈負(fù)相關(guān)，但I(xiàn)L-33水平與對(duì)照組比較差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而Li等［15］研究結(jié)果顯示，ITP組較健康對(duì)照者IL-33表達(dá)水平降低，sST2表達(dá)水平升高，與本研究結(jié)果不完全一致，筆者推測(cè)在ITP患者中，ST2L/IL-33信號(hào)通路對(duì)Treg細(xì)胞的調(diào)控可能不是IL-33，亦可能是通過(guò)ST2L和sST2的表達(dá)發(fā)揮作用，增高的sST2可阻斷Treg細(xì)胞的ST2L/IL-33信號(hào)通路，抑制Treg細(xì)胞增殖，導(dǎo)致TGF-β分泌減少，從而對(duì)Th17細(xì)胞抑制作用減少，致使IL-17分泌增多，最終出現(xiàn)Th17/Treg細(xì)胞失衡。

綜上所述，ITP患者體內(nèi)存在Th17/Treg細(xì)胞失衡、sST2表達(dá)水平升高的現(xiàn)象，增高的sST2通過(guò)抑制ST2L/IL-33信號(hào)通路，可抑制淋巴細(xì)胞向Treg細(xì)胞亞群分化，促進(jìn)其向Th17細(xì)胞亞群分化，導(dǎo)致ITP中的T淋巴細(xì)胞亞群的失衡，進(jìn)而參與該疾病的免疫反應(yīng)。至于sST2對(duì)ST2L/IL-33信號(hào)通路如何發(fā)揮作用，其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究探討。