左婭薇，莫春柏，李光，耿潔，王玉亮△

器官移植已成為治療多種器官終末期疾病的最有效手段。盡管近年來隨著器官保存、組織配型技術(shù)的發(fā)展，以及新型免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用，腎移植患者所移植腎臟短期存活率獲得很大的提高，但遠(yuǎn)期效果并沒有得到相應(yīng)的改善。急性排斥是導(dǎo)致移植腎功能喪失的最主要的因素之一［1］。腫瘤壞死因子受體超家族成員-OX40（CD134）作為一種共刺激分子，對(duì)于維持CD4+T細(xì)胞的活化、增殖、存活以及記憶T細(xì)胞的形成起到關(guān)鍵作用［2］。本研究探討腎移植急性排斥患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）中OX40 mRNA表達(dá)水平以及外周血CD3+CD8-T輔助細(xì)胞（Th）1、Th2在預(yù)測(cè)腎移植急性排斥反應(yīng)中的應(yīng)用價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2016年1月—2017年1月在天津市第一中心醫(yī)院器官移植中心接受腎移植手術(shù)的急性排斥受者20例，男14例，女6例，平均年齡（43±10）歲。急性排斥反應(yīng)診斷標(biāo)準(zhǔn)：尿量減少，發(fā)熱（體溫可＞38℃），血壓升高，實(shí)驗(yàn)室檢查肌酐升高、蛋白尿、尿比重下降，尿脫落細(xì)胞檢查發(fā)現(xiàn)集合小管、核殘余細(xì)胞碎片及纖維蛋白原沉著增多，彩超顯示移植腎體積增大、血流減少、血管阻力增加。另選取同期術(shù)后腎功能穩(wěn)定受者20例為腎功能穩(wěn)定組，男13例，女7例，平均年齡（40±12）歲。腎功能穩(wěn)定判斷依據(jù)：術(shù)后7 d內(nèi)移植腎功能恢復(fù)正常，B型超聲檢查顯示移植腎體積、結(jié)構(gòu)和血流均正常。以20例本院健康志愿者作為對(duì)照組，男15例，女5例，平均年齡（44±11）歲。所有研究對(duì)象均簽訂知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器 聚蔗糖-泛影葡胺淋巴細(xì)胞分離液（天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司），TRIzol RNA提取試劑（美國Invitrogen公司），引物及TaqMan熒光探針（美國Applied Biosystems公司），抗人CD3-PE-Cy5、CD8-FITC、IFN-γ-PE和IL-4-PE單克隆抗體（美國eBioscience公司），F(xiàn)ACS溶血素、FACS通透液（美國BD公司），佛波酯、離子霉素、莫能酶素（美國Sigma公司），RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清（美國Gibco公司），ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀（美國Applied Biosystems公司），F(xiàn)ACS Calibur流式細(xì)胞儀（美國BD公司）。

1.3 方法

1.3.1 OX40 mRNA水平檢測(cè) 清晨采集研究對(duì)象的空腹外周靜脈血5 mL，乙二胺四乙酸抗凝。用淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法常規(guī)分離PBMCs。TRIzol法提取細(xì)胞總RNA。按逆轉(zhuǎn)錄酶說明書操作合成cDNA，產(chǎn)物于-80℃保存。OX40引物上游 5′-ACGACGTGGTCAGCTCCAA-3′，下游5′-TCCGCTCACTCCCACTTCTG-3′，探針序列：5′-FAMAAGCCCTGCACGTGGTGTAACC-TAMRA-3′；內(nèi)參基因βactin 引物上游 5′-GATGGCCACGGCTGCTT-3′，下游 5′-ACCGCTCATTGCCAATGGT-3′，探針序列：5′-FAMCTACGAGCTGCCTGACGGCCAGG-TAMRA-3′。熒光定量PCR反應(yīng)條件：50℃ 2 min；95℃ 5 min；95℃ 20 s，55℃ 30 s，72℃1 min，共35個(gè)循環(huán)。在PCR反應(yīng)結(jié)束后，設(shè)定基線水平和閾值，儀器自動(dòng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣本基因拷貝數(shù)［3］。

1.3.2 Th1、Th2細(xì)胞因子檢測(cè) 將1 mL肝素抗凝血加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基1 mL混勻，然后加入佛波酯（25 ng/mL）、離子霉素（1μmol/L）刺激劑，及蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑莫能酶素（2μmol/L），將培養(yǎng)瓶置于培養(yǎng)箱，37℃、5%CO2培養(yǎng)4 h。將刺激好的標(biāo)本加入Falcon管中，200μL/管。加入20μL胞外抗體CD3-PE-Cy5和CD8-FITC混勻，室溫避光15 min，經(jīng)洗滌、固定、通透細(xì)胞后樣品管加入胞內(nèi)染色的抗體（IFN-γ-PE和IL-4-PE）10μL，對(duì)照管中加入相應(yīng)的同型對(duì)照10μL，混勻，室溫避光30 min并洗滌后，以1%多聚甲醛懸浮細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分析測(cè)定CD3+CD8-T淋巴細(xì)胞中IFN-γ（Th1）和IL-4（Th2）表達(dá)率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，繪制受試者工作特征（ROC）曲線評(píng)價(jià)OX40及Th1的預(yù)測(cè)價(jià)值并計(jì)算ROC曲線下面積（AUC），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PBMCs中OX40 mRNA表達(dá)水平 腎移植術(shù)后急性排斥組PBMCs中OX40 mRNA表達(dá)水平明顯高于腎功能穩(wěn)定組和健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=27.005，P＜0.01），腎功能穩(wěn)定組 PBMCs中OX40 mRNA水平與健康對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；見圖1。TaqMan實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)樣本OX40擴(kuò)增曲線見圖2。

2.2 Th1、Th2表達(dá)率 急性排斥組Th1表達(dá)率（14.6%±7.3%）明顯高于腎功能穩(wěn)定組（8.5%±4.1%）和健康對(duì)照組（9.8%±4.2%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7.026，P＜0.01）。3組患者Th2表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.207，P＞0.05）；見圖3。Th細(xì)胞流式結(jié)果見圖4。

Fig.2 PCR positive amplification curve of OX40圖2 OX40 PCR陽性標(biāo)本擴(kuò)增曲線

Fig.3 The expression percentage of Th1 and Th2 in three groups圖3 各組Th1、Th2細(xì)胞表達(dá)率

2.3 ROC曲線分析 OX40 mRNA診斷急性排斥反應(yīng)的 ROC 曲線下面積（AUC）為 0.903（95%CI：0.825～0.980）；Th1診斷急性排斥反應(yīng)的ROC曲線下面積（AUC）為 0.731（95%CI：0.587～0.874）；OX40 mRNA聯(lián)合Th1診斷急性排斥反應(yīng)的ROC曲線下面積（AUC）為0.930（95%CI：0.859～1.001）；見圖5。

3 討論

3.1 OX40生物學(xué)特性 移植排斥反應(yīng)的本質(zhì)是體內(nèi)免疫系統(tǒng)對(duì)外來抗原的免疫應(yīng)答，受體T細(xì)胞作為同種異體免疫排斥反應(yīng)的主要效應(yīng)細(xì)胞，其活化需要“雙信號(hào)”刺激。第一信號(hào)包括T細(xì)胞接受抗原遞呈細(xì)胞提供的外來抗原，第二信號(hào)則是共刺激信號(hào)通路。OX40作為促進(jìn)T淋巴細(xì)胞活化、增殖和細(xì)胞因子分泌的共刺激信號(hào)之一，主要在活化的CD4+T細(xì)胞表面表達(dá)，對(duì)于維持CD4+T細(xì)胞的活化、增殖、遷移,促進(jìn)生發(fā)中心的形成和樹突狀細(xì)胞（DC）的分化成熟起到關(guān)鍵作用。在小鼠中OX40在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）上表達(dá)，然而，在人類中OX40表達(dá)在外周血Treg上低表達(dá)或不表達(dá)，但在從炎癥部位（例如惡性腫瘤）分離的Treg中表達(dá)較高。OX40配體（OX40L）主要存在于活化的抗原呈遞細(xì)胞（例如樹突細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞）上，但也可以表達(dá)在活化的T細(xì)胞表面。OX40/OX40L共刺激信號(hào)通路主要在免疫應(yīng)答的后期起維持和調(diào)節(jié)共刺激信號(hào)的作用，上調(diào)IL-2的表達(dá)，促進(jìn)T細(xì)胞的活化、增殖和細(xì)胞因子分泌，能打破外周免疫耐受，延長T細(xì)胞的存活時(shí)間［4-5］。本研究結(jié)果顯示，急性排斥受者PBMCs中OX40 mRNA表達(dá)水平明顯高于腎功能穩(wěn)定受者，腎移植受者術(shù)后服用免疫抑制劑可使機(jī)體免疫力受到抑制，OX40分子的低表達(dá)抑制淋巴細(xì)胞活化，而OX40分子的高表達(dá)可促進(jìn)Bcl-2、Bcl-xL等一系列抗凋亡分子高表達(dá)，從而減少T細(xì)胞凋亡并維持CD4+T細(xì)胞的存活，進(jìn)一步促進(jìn)CD4+T細(xì)胞穿過血管內(nèi)皮在炎癥位點(diǎn)的募集［6］，因此，腎移植術(shù)后PBMCs中OX40 mRNA表達(dá)水平在一定程度上可以反映受者當(dāng)前的免疫狀態(tài)。

Fig.4 Flow cytometry of Th cells圖4 Th細(xì)胞流式細(xì)胞圖

Fig.5 ROC curves of OX40 mRNA and Th1 for predicting acute rejection圖5 OX40 mRNA及Th1預(yù)測(cè)急性排斥的ROC曲線

3.2 Th細(xì)胞亞群 細(xì)胞因子作為T細(xì)胞分泌的具有生物活性的成分，具有通過結(jié)合相應(yīng)受體來調(diào)節(jié)T細(xì)胞分化、調(diào)控免疫應(yīng)答等多種作用。研究證實(shí)，腎移植術(shù)后發(fā)生細(xì)胞介導(dǎo)的急性排斥反應(yīng)是一種Th1型細(xì)胞因子占優(yōu)勢(shì)的免疫反應(yīng)，而Th2型細(xì)胞因子可以誘導(dǎo)移植物形成免疫耐受，利于移植物長期存活。大量研究證實(shí)，檢測(cè)移植術(shù)后Th細(xì)胞對(duì)于了解移植受者術(shù)后免疫功能狀態(tài)以及免疫抑制劑合理應(yīng)用具有一定意義［7-8］。本研究結(jié)果顯示，腎移植術(shù)后急性排斥受者外周血中CD3+CD8-T淋巴細(xì)胞中IFN-γ表達(dá)率較腎功能穩(wěn)定受者顯著升高，而CD3+CD8-T淋巴細(xì)胞中IL-4表達(dá)率與腎功能穩(wěn)定受者相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IFN-γ主要由活化的T細(xì)胞和自然殺傷（NK）細(xì)胞產(chǎn)生，能促進(jìn)Th0細(xì)胞分化為Th1細(xì)胞，并抑制Th2細(xì)胞增生，激活中性粒細(xì)胞功能和NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞殺傷活性，同時(shí)激活的T細(xì)胞還可誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞（APC）產(chǎn)生IL-12，進(jìn)一步上調(diào)IFN-γ［9］，是急性排斥反應(yīng)的重要介質(zhì)，其促炎功能提示Th1而不是Th2細(xì)胞在排斥反應(yīng)發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［10］。

3.3 OX40 mRNA、Th1細(xì)胞聯(lián)合檢測(cè) 目前在腎移植領(lǐng)域及時(shí)、準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)急性排斥反應(yīng)仍是移植中心的重要研究方向。本研究進(jìn)一步對(duì)檢測(cè)指標(biāo)行ROC分析，結(jié)果表明OX40 mRNA、Th1細(xì)胞對(duì)預(yù)測(cè)診斷急性排斥反應(yīng)的AUC值分別為0.903和0.731，兩者聯(lián)合預(yù)測(cè)急性排斥反應(yīng)的AUC值提升至0.930，這提示聯(lián)合檢測(cè)這兩個(gè)指標(biāo)對(duì)預(yù)測(cè)腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)診斷價(jià)值較高。進(jìn)一步特異性阻斷該OX40/OX40L共刺激信號(hào)通路將有利于誘導(dǎo)免疫耐受［11］。

綜上所述，腎移植術(shù)后急性排斥患者共刺激分子OX40水平上調(diào)同時(shí)引起Th1增加，監(jiān)測(cè)腎移植受者外周血OX40 mRNA及Th1可以預(yù)測(cè)急性排斥反應(yīng)。