宋代富，郭國鋒，龍海權(quán)，陳盛強，黃炯華△，陳晞明△

心肌肥厚是心臟應(yīng)對各種因子長期刺激所致心力衰竭的早期病理過程。既往研究證實，心肌肥厚患者心房纖顫、惡性心律失常、心源性猝死的發(fā)病風險明顯升高［1］。雖然腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)軸抑制劑和β-受體阻滯劑在心肌肥厚向心力衰竭進展早期有良好的抗心肌肥大效應(yīng)，但無論是單用或合用這兩類藥物均不能完全逆轉(zhuǎn)病理性心肌肥厚的進展，患者并發(fā)心衰入院率仍很高［2］。隨著研究深入，一些通過降低壓力負荷延緩心肌肥厚進展的技術(shù)及器械裝置正用于臨床試驗［3-5］，而其安全性和有效性仍不明確，是否有臨床應(yīng)用前景尚不清楚。究其原因是目前對心肌肥厚的分子生物學發(fā)病機制尚不明確，防治心力衰竭的手段仍有限。因此，延緩或逆轉(zhuǎn)病理性心肌肥厚有望成為防治心力衰竭的新策略與靶點。近年來動物體內(nèi)外研究證據(jù)顯示，病理性心肌肥厚存在心肌自噬的異常改變［6-7］，筆者既往研究結(jié)果提示，調(diào)控自噬有望成為逆轉(zhuǎn)心肌肥厚、防治心力衰竭的新策略［8］。然而，自噬在病理性心肌肥厚中的具體作用尚未明確。目前，尚鮮見通過自噬誘導藥物治療異丙腎上腺素（isoproterenol，ISO）介導病理性心肌肥厚的相關(guān)研究。為此，本研究旨在通過誘導動物體內(nèi)心肌自噬的改變，明確自噬在ISO介導心肌肥厚中的作用，為藥物靶向自噬逆轉(zhuǎn)病理性心肌肥厚和防治心力衰竭提供實驗基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 體質(zhì)量180～220 g的SPF級SD大鼠29只，購自南方醫(yī)科大學實驗動物中心。ISO購自上海TCI公司、水合氯醛購自天津市大茂化學試劑廠，雷帕霉素（rapamycin，RAP）購自LC Laboratories公司，SQSTM1/p62、LC3和β-actin抗體購自英國Abcam公司；細胞裂解液NP-40、辣根過氧化物酶標記的二抗購自上海碧云天公司；PVDF膜購自美國Millipore公司；HE和Masson染色試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。主要儀器：動物心臟彩超儀（ie33型號）及7.5 MHz高頻線控探頭購自荷蘭PHILIPS公司；病理切片顯微鏡購自德國Leica公司，蛋白電泳儀及Western發(fā)光試劑購自Bio-Rad公司，透射電鏡檢測儀購自日本日立公司。

1.2 實驗分組 將29只大鼠隨機數(shù)字表法分為3組：（1）對照（Con）組9只。皮下聯(lián)合腹腔注射生理鹽水。（2）ISO組10只。皮下注射ISO，注射劑量參照文獻［9-10］，聯(lián)合腹腔注射生理鹽水。（3）ISO+RAP組10只。皮下注射ISO，聯(lián)合腹腔注射RAP，注射劑量參照文獻［11］。干預治療14 d，將存活各組大鼠（Con組，n=9；ISO組，n=8；ISO+RAP組，n=10）進行下一步實驗檢測。

1.3 心臟超聲儀檢測左室壁厚度和左室射血分數(shù) 在異氟烷麻醉下，備皮，應(yīng)用超聲心動儀檢測Con組和ISO組大鼠左心室舒張末期前壁厚度（left ventricular anterior wall enddiastolic thickness，LVAWd）、左心室收縮末期前壁厚度（left ventricular anterior wall end-systolic thickness，LVAWs）、左心室舒張末期后壁厚度（left ventricular posterior wall enddiastolic thickness，LVPWd）、左心室收縮末期后壁厚度（left ventricular posterior wall end-systolic thickness，LVPWs）、左室射血分數(shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF），評價ISO構(gòu)建病理性心肌肥厚的模型效果。超聲檢查主要目的是為了實時動態(tài)檢驗ISO誘導心肌肥厚效果，且為了更加客觀地評價心肌肥厚改變，筆者進一步采用微觀病理切片和心臟體質(zhì)量指數(shù)，故ISO+RAP組未使用主觀性較強的超聲檢查。

1.4 獲取心臟組織計算心臟體質(zhì)量指數(shù)（heart weight/body weight index，HWI） 完成超聲心動圖后，每只大鼠稱體質(zhì)量（body weight，BW）后以腹腔內(nèi)注射過量的10%水合氯醛處死，開胸，剪取大鼠心臟置入預冷磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）沖洗數(shù)次，迅速用濾紙吸干PBS后稱心臟質(zhì)量（heart weight，HW），計算HWI（HWI=HW/BW）。

1.5 顯微鏡觀察心肌組織病理變化 獲取心臟用10%福爾馬林固定，石蠟包埋，心臟橫向切片（6μm），常規(guī)蘇木精＆伊紅（HE）及Masson染色。組織切片顯微鏡（HE染色，×400；Masson染色，×5）觀察并拍照。

1.6 Western blot檢測自噬活性標志蛋白變化 采用NP-40裂解液抽提心肌組織總蛋白并通過BCA法測定蛋白濃度。取40μg蛋白進行電泳分離和轉(zhuǎn)膜。將承載有目的蛋白的PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入抗體p62（1∶6 000）、LC3（1∶5 000）和β-action于4℃孵育過夜。孵育過夜的蛋白膜用PBS-Tween 20洗滌后加入免疫二抗進行免疫共沉淀反應(yīng)。免疫復合物曝光獲取底片。使用Image J 18.0進行分析，各蛋白表達量用內(nèi)參蛋白β-actin標準化。

1.7 透射電鏡觀察心肌組織自噬泡 每組隨機選3只大鼠取左室心肌組織約1 mm×1 mm×1 mm，置入預冷電鏡固定液（2.5%戊二醛），室溫2 h后轉(zhuǎn)4℃冰箱固定12 h，取出標本用PBS漂洗后2%鋨酸固定2 h，環(huán)氧樹脂包埋后，每只大鼠隨機抽取1張切片，采用掃描電鏡任意讀取3個不同視野計數(shù)自噬泡數(shù)量，即每組共9個不同視野下自噬泡的數(shù)量。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學處理。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，2組間比較采用t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較用LSD-t法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ISO組與Con組大鼠左室結(jié)構(gòu)和功能變化的比較 與Con組比較，ISO組的LVAWd、LVAWs、LVPWd、LVPWs和LVEF均增大（P＜0.01），見表1。

Tab.1 Comparison of the left ventricular wall thickness and LVEF between Con group and ISO group表1 Con組與ISO組組左室壁厚度和射血分數(shù)的比較（±s）

Tab.1 Comparison of the left ventricular wall thickness and LVEF between Con group and ISO group表1 Con組與ISO組組左室壁厚度和射血分數(shù)的比較（±s）

＊＊P＜0.01

組別Con組ISO組t n7 8 LVAWd（10-3cm）178.14±20.33 265.14±30.86 6.338＊＊LVAWs（10-3cm）291.07±29.62 441.17±37.31 8.535＊＊組別Con組ISO組t n7 8 LVPWd（10-3cm）165.29±21.52 230.84±21.21 5.925＊＊LVPWs（10-3cm）273.32±17.60 389.99±32.71 8.407＊＊LVEF 0.75±0.06 0.91±0.05 5.452＊＊

2.2 各組心臟體質(zhì)量指數(shù)變化情況比較 與Con組比較，ISO組和ISO+RAP組HW增加、BW減輕、HWI增加（均P＜0.01）；與ISO組比較，ISO+RAP組的HW下降、BW減輕、HWI減?。ň鵓＜0.01），見表2。

2.3 各組心肌組織病理變化 與Con組比較，ISO組和ISO+RAP組心肌組織橫切面Masson染色可見心內(nèi)膜纖維化明顯，室壁增厚，心腔變小，向心性肥厚明顯，而局部組織HE染色可見心肌細胞肥大、細胞核混亂、染色不均、心肌纖維化增多；與ISO組比較，ISO+RAP組病理性心肌肥厚特征明顯改善，見圖1。

Tab.2 Comparison of heart weight/body weight index between three groups表2 3組大鼠心臟體質(zhì)量指數(shù)的比較 （±s）

Tab.2 Comparison of heart weight/body weight index between three groups表2 3組大鼠心臟體質(zhì)量指數(shù)的比較 （±s）

＊＊P＜0.01；a與Con組比較，b與ISO組比較

組別n HW（g）BW（g）HWI（%）Con組ISO組ISO+RAP組F 9 8 1 0 0.88±0.04 1.30±0.07a 0.97±0.08ab 96.910＊＊312.00±12.94 285.88±12.88a 234.80±19.30ab 60.314＊＊0.28±0.01 0.45±0.03a 0.41±0.01ab 189.320＊＊

2.4 各組心肌自噬活性比較 與Con組比較，ISO組LC3Ⅱ/Ⅰ比值下調(diào)，而p62表達上調(diào)（P＜0.01）；與ISO組比較，ISO+RAP組LC3Ⅱ/Ⅰ比值上調(diào)，而p62表達下調(diào)（P＜0.01），見表3、圖2。

Tab.3 Comparison of the ratio of LC3Ⅱ/Ⅰ and the expression level of p62 in cardiac tissues between the three groups表3 各種心肌組織LC3Ⅱ/Ⅰ比值和p62相對表達水平的比較 （±s）

Tab.3 Comparison of the ratio of LC3Ⅱ/Ⅰ and the expression level of p62 in cardiac tissues between the three groups表3 各種心肌組織LC3Ⅱ/Ⅰ比值和p62相對表達水平的比較 （±s）

＊＊P＜0.01；a與Con組比較，,b與ISO組比較

組別n LC3Ⅱ/Ⅰp62 Con組ISO組ISO+RAP組F 3 3 3 1.00±0.04 0.43±0.10a 1.00±0.24b 14.225＊＊1.00±0.29 1.80±0.22a 0.71±0.09b 21.095＊＊

2.5 各組心肌組織自噬泡數(shù)量比較 Con組、ISO組、ISO+RAP組的心肌組織自噬泡數(shù)量分別為（1.44±0.51）個、（0.56±0.20）個及（2.89±0.51）個，組間差異有統(tǒng)計學意義（n=3，F(xiàn)=22.315，P＜0.01），其中ISO組較Con組的心肌組織自噬泡數(shù)量明顯減少（P＜0.05），ISO+RAP組較ISO組的心肌組織自噬泡數(shù)量顯著增多（P＜0.01），見圖3。

Fig.1 The pathological morphology of cardiac tissues for three groups圖1 各組心肌組織病理形態(tài)

Fig.2 Comparison of the ratio of LC3Ⅱ/Ⅰand the expression level of p62 in cardiac tissue between the three groups圖2 各組大鼠心肌組織LC3和p62蛋白表達水平

3 討論

β腎上腺素能受體與兒茶酚胺類激素結(jié)合而被激活，進而促進心電傳導，可提高心率、增強心肌收縮力。在兒茶酚胺類激素的持續(xù)作用下，心臟會逐漸出現(xiàn)心肌細胞肥大和心肌纖維化，即心肌肥厚樣改變。ISO可激活β腎上腺能受體，通過絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、鳥苷酸結(jié)合蛋白-腺苷酸環(huán)化酶-環(huán)磷腺苷-蛋白激酶A（G蛋白-AC-cAMP-PKA）通路、Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活子（JAK/STAT3）信號通路、Ca2+信號通路、氧化應(yīng)激信號通路、核因子κB（NF-κB）相關(guān)通路促進心肌肥厚［12］。本研究結(jié)果顯示，與Con組比較，ISO組的大鼠左室壁厚度增加、LVEF升高、HWI增高、心肌組織呈肥厚樣病理改變，且自噬活性標志蛋白p62表達上調(diào)、LC3Ⅱ/Ⅰ比值下調(diào)，心肌組織自噬泡數(shù)量明顯減少，表明ISO可誘導大鼠心肌肥厚，同時抑制心肌自噬的活性，與相關(guān)研究結(jié)果相近［13］。因此，上調(diào)心肌自噬有望逆轉(zhuǎn)ISO誘導的病理性心肌肥厚。近年來，越來越多的證據(jù)顯示，自噬參與了心肌肥厚的發(fā)生和發(fā)展，自噬調(diào)控有望成為逆轉(zhuǎn)心肌肥厚的新策略［14-15］。

目前，普遍認為自噬是一種通過清除細胞內(nèi)錯誤折疊蛋白質(zhì)、受損和老化細胞器、并為細胞提供各種養(yǎng)分和能量物質(zhì)的自我保護機制［16］。越來越多的研究結(jié)果顯示，基礎(chǔ)水平的自噬是維持機體穩(wěn)態(tài)所必需的，自噬的過渡激活或不足均會促進或抑制疾病的發(fā)生和發(fā)展［17］。然而，自噬在心肌肥厚發(fā)生發(fā)展過程中的確切作用尚不明確。部分研究認為，心肌細胞自噬在心肌肥厚過程中起保護作用，如心肌特異性過表達DDiT4L或Sestrin1均可增強心肌自噬，改善病理性心肌肥厚和心功能［18-19］。另外，通過上調(diào)miR-222或miR-199a靶向抑制心肌自噬活性，誘發(fā)和加重心肌肥厚，促進心肌肥厚向心力衰竭轉(zhuǎn)變［20-21］。但也有研究顯示，心肌自噬在心肌肥厚中扮演了負面角色。如Li等［22］研究顯示，在心肌中過表達ATG5可增強心肌自噬，加重血管緊張素Ⅱ誘導心肌肥大。Huang等［23］證實，腎臟去交感神經(jīng)節(jié)術(shù)可通過抑制心肌自噬活性，顯著改善自發(fā)性高血壓大鼠心肌肥厚程度。

本研究結(jié)果顯示，與ISO組比較，ISO+RAP組心肌自噬標志蛋白p62表達下調(diào)、LC3Ⅱ/Ⅰ比值上調(diào)，心肌組織自噬泡數(shù)量明顯增多，且HWI減少、心肌組織病理性肥厚改善，表明RAP誘導心肌自噬可抑制ISO介導的病理性心肌肥厚。同時，本研究結(jié)果顯示，與Con組比較，ISO+RAP組大鼠的心臟質(zhì)量有所增加，但較ISO組顯著降低；同時ISO+RAP組大鼠體質(zhì)量也較ISO組顯著減少。既往研究表明，RAP可增強心肌自噬，但對大鼠體質(zhì)量無顯著影響［11］。然而也有研究顯示。RAP可使大鼠體質(zhì)量顯著減輕［24］。本研究結(jié)果表明，ISO+RAP組大鼠體質(zhì)量雖較ISO組顯著減小，但心臟質(zhì)量減小的程度更大，故ISO+RAP組大鼠HWI較ISO組顯著減小。因此，筆者認為RAP可通過增強心肌自噬改善ISO誘導的病理性心肌肥厚。

Fig.3 Comparison of the number of autophagic vacuoles by inducing cardiac autophagy between three groups（×13 500）圖3 各組誘導心肌自噬對心肌自噬泡數(shù)量的比較（×13 500）

綜上所述，ISO誘導心肌肥厚中存在心肌自噬的抑制；上調(diào)心肌自噬活性可逆轉(zhuǎn)ISO介導的病理性心肌肥厚。