肖凡，曹潔，李鑫

呼吸重疊綜合征（respiratory overlap syndrome，OS）最初由David C.Flenley于1985年提出，用于描述慢性阻塞性肺?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）和阻塞性睡眠呼吸暫停（obstructive sleep apnea，OSA）的共存現(xiàn)象［1］。OSA主要病理特征為睡眠間歇性低氧（intermittent hypoxia，IH），此種低氧模式可以造成人體全身多系統(tǒng)損傷，其中以心血管系統(tǒng)損傷最為常見和嚴重［2］。COPD主要以不完全可逆的氣流受限為特征，中重度患者可引發(fā)慢性持續(xù)低氧（continuous hypoxia，CH），心血管疾病為其最重要的合并癥［3］。OS同時存在IH和CH，與單獨發(fā)生的COPD或OSA相比，OS患者的心血管事件發(fā)生率和死亡率均明顯增加［4］。

內(nèi)皮細胞損傷或活化引起的內(nèi)皮細胞調(diào)節(jié)功能的改變會導致內(nèi)皮功能障礙，而血管性疾病的重要環(huán)節(jié)為血管內(nèi)皮功能障礙。筆者團隊前期研究證實 ，中性 粒 細胞（Polymorphonuclear neutrophlis，PMN）與血管內(nèi)皮細胞（vascular endothelial cell，VEC）共培養(yǎng)后重疊低氧暴露模式與單純IH低氧暴露模式或單純CH低氧暴露模式相比較，炎癥反應及氧化應激更劇烈、內(nèi)皮細胞凋亡加速更明顯，內(nèi)皮損傷更嚴重，提示炎癥反應、氧化應激及凋亡基因共同參與了OS所致血管內(nèi)皮損傷，且具有時間依賴性［5］。本研究將從細胞水平探討PMN與VEC的交互作用在重疊綜合征所致血管內(nèi)皮損傷中的重要作用及與細胞間黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）的作用機制，以進一步探討重疊低氧模式暴露所致內(nèi)皮細胞損傷的可能發(fā)病機制。

1 資料與方法

1.1 主要材料與試劑 混合氣體（天津六方氣體高科技有限公司）；酶標儀（美國Thermo Science公司）；ICAM-1試劑盒、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α試劑盒、白細胞介素（Interleukin，IL）-6試劑盒（美國RD公司）；過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（南京建成生物公司）；梯度聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）儀（美國Bio-Rad公司）；熒光定量PCR儀（美國Roche公司，LC96）；Bak引物、Bcl-xl引物、10×RT（天津南天生物技術(shù)有限公司）；TransScript RT、雙蒸水（double distilled water，ddH2O；天津南天生物技術(shù)有限公司）；RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco）；胰蛋白酶（美國，GIBCO公司）；TRIzol RNA分離試劑（美國，Invitrogen公司）；通用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（M-MLV）逆轉(zhuǎn)錄酶（美國Promega Leiden公司）；SYBR Green（美國，AMBION公司）；實時熒光定量PCR引物（美國，Thermo Fisher公司）；可見光分光光度計（德國，Eppendorf）；可調(diào)到95℃左右的恒溫浴箱（北京市光明醫(yī)療儀器廠）。

1.2 細胞的準備

1.2.1 PMN的提取 選取來源于天津市第三中心醫(yī)院分院健康體檢中心的健康成年體檢者160例，符合以下條件：（1）既往無呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟、腎臟等器質(zhì)性疾病病史。（2）通過病史、體格檢查、胸部X線及肺功能檢查除外COPD。（3）否認睡眠打鼾史、呼吸暫停史，否認白天嗜睡等既往史。每次每人抽取空腹8 h以上外周靜脈血2.5 mL，共16人次，每次取樣共40 mL，先后共進行10次取樣。使用雙層密度梯度離心法從血樣中分離PMN，吉姆薩染色PMN純度大于96%，生存率由臺盼藍染色確定大于99%，健康志愿者均簽署知情同意書。

1.2.2 人VEC的制備 采用人臍靜脈內(nèi)皮細胞系EA.hy926。人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）水浴復蘇后接種于含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于5%CO2、37℃飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。傳2～3代待其穩(wěn)定后取對數(shù)生長期細胞，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細胞，用2.5 g/L胰蛋白酶及2 g/L的EDTA消化，終止消化后吸管反復吹打制成單細胞懸液，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為3×106/mL，按1 mL/孔接種于6孔板，于37℃、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，待細胞貼壁后采用無血清培養(yǎng)基沖洗，調(diào)整無血清培養(yǎng)基至1 mL/孔（培養(yǎng)基厚度約為3 mm），pH值調(diào)至7.4后開始低氧暴露。

1.2.3 細胞培養(yǎng) （1）PMN與VEC直接共培養(yǎng)：純化的PMN在RPMI 1640培養(yǎng)基中重懸，細胞濃度為1×106/mL，按1 mL/孔直接接種于VEC培養(yǎng)皿中（PMN與VEC數(shù)量比為10∶1）。（2）將PMN與VEC直接共培養(yǎng)組的6孔培養(yǎng)板與制備好的單純VEC組培養(yǎng)皿同時置于37℃、5%CO2的飽和濕度細胞培養(yǎng)箱內(nèi)共培養(yǎng)4 h，后進行低氧暴露8 h。

1.3 實驗設(shè)計

1.3.1 暴露裝置 采用天津醫(yī)科大學總醫(yī)院呼吸與危重癥學科呼吸仿真系統(tǒng)1.0，按照編寫程序控制間歇低氧/復氧循環(huán)次數(shù)及循環(huán)時間，根據(jù)單片機的預置程序，對固態(tài)繼電器進行控制，間接控制電磁閥的開關(guān)，然后開啟/關(guān)閉預混氣體流量。細胞培養(yǎng)艙是自行設(shè)計制造，采用恒溫器、加熱加濕器和微孔膜保證培養(yǎng)箱內(nèi)為37℃、45%～70%濕度的無菌環(huán)境；細胞培養(yǎng)艙容量1.8 L，洗脫流速：0.083 L/s，實測洗脫時間約30 s，暴露時間段以前，均含30 s洗脫時間。該暴露裝置已被證實可以模擬多種間歇低氧/再氧合模式的暴露條件，并與低氧相關(guān)疾病的整體水平與細胞水平病生理的真實情況基本一致［6］。

1.3.2 實驗分組 將PMN與VEC直接共培養(yǎng)組設(shè)為實驗組，VEC單獨培養(yǎng)組設(shè)為對照組，將實驗組與對照組均進行8 h間歇伴持續(xù)低氧。低氧暴露方案：1.5%O215 s+10%O23 min 45 s，低氧暴露結(jié)束后收集2組細胞上清液，實驗組及對照組均采用PBS反復沖洗后收集貼壁VEC，收集的上清液和VEC凍存于-80℃冰箱。

1.4 檢測指標 （1）通過雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法按試劑盒說明操作檢測提取的上清液的炎癥因子IL-6、TNF-α及ICAM-1。（2）應用化學試劑法按試劑盒說明檢測上清液的CAT活性和MDA濃度。（3）實時熒光定量PCR（qRTPCR）技術(shù)檢測VEC促凋亡基因Bak和抑凋亡基因Bcl-xlmRNA表達情況。從-80℃冰箱取出VEC，融化后采用TRIzol法提取總RNA，用Thermo Nano Drop 2000測定RNA濃度。將200 ng總RNA用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶進行反轉(zhuǎn)錄反應，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，SYBR GreenⅠ作為熒光染料進行實時熒光定量PCR。Bak引物，上游5′-CCCAGGACACAGAGGAGGTTT-3′，下游 5′-GCCTCCTGTTCCTGCTGATG-3′，擴增片段長度65 bp；Bcl-xl引物，上游5′-TGCGTGGAAAGCGTAGACAA-3′，下游5′-ATTCAGGTAAGTGGCCATCCAA-3′，擴增片段長度75 bp；GAPDH引物，上游5′-AACAGCCTCAAGATCATCAGCA-3′，下游 5′-CATGAGTCCTTCCACGATACCA-3′，擴增片段長度102 bp。以GAPDH作為內(nèi)參照，以未轉(zhuǎn)染的空白對照組細胞作為校正樣本，采用2-ΔΔCt的相對定量方法進行分析 ，ΔΔCt=［ 實 驗 組（目的基因Ct-內(nèi)參對照Ct）- 對照組（目的基因Ct-內(nèi)參對照Ct）］。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，2組間數(shù)據(jù)比較采用獨立樣本t檢驗；將實驗組ICAM-1與各變量進行Pearson相關(guān)性分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 2組炎癥因子及氧化應激指標比較 實驗組IL-6、TNF-α、ICAM-1及MDA水平均高于對照組，而CAT的活力值低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

Tab.1 Comparison of indexes of inflammation and oxidative stress between control group and experimental group表1 對照組與實驗組炎癥因子及氧化應激指標比較（n=10，±s）

Tab.1 Comparison of indexes of inflammation and oxidative stress between control group and experimental group表1 對照組與實驗組炎癥因子及氧化應激指標比較（n=10，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別對照組實驗組t炎癥因子（ng/L）IL-6 22.42±2.27 151.77±35.90 11.370＊＊TNF-α 226.68±4.68 267.46±43.10 2.975＊ICAM-1（μg/L）0.97±0.15 1.64±0.10 11.931＊＊MDA（nmol/L）22.68±3.18 27.04±2.41 3.452＊CAT（U/mL）11.15±0.83 7.55±1.34 7.210＊＊

2.2 2組Bak、Bcl-xlmRNA相對表達水平比較 實驗組Bak和Bcl-xlmRNA相對表達水平均高于對照組，而Bcl-xl/Bak低于對照組（P＜0.05），見表2。

Tab.2 ComparisonofrelativeexpressionlevelsofBakand Bcl-xlmRNAbetweencontrolgroupandexperimentalgroup表2 2組Bak mRNA、Bcl-xl mRNA相對表達水平比較（n=10，±s）

Tab.2 ComparisonofrelativeexpressionlevelsofBakand Bcl-xlmRNAbetweencontrolgroupandexperimentalgroup表2 2組Bak mRNA、Bcl-xl mRNA相對表達水平比較（n=10，±s）

＊＊P＜0.01

組別Bak mRNA Bcl-xl mRNA Bcl-xl/Bak對照組實驗組t 2.04±0.22 3.44±0.62 6.743＊＊1.33±0.09 1.73±0.09 9.968＊＊0.69±0.08 0.34±0.08 10.077＊＊

2.3 ICAM-1與各變量相關(guān)性分析 ICAM-1與IL-6、TNF-α、MDA呈正相關(guān)，而與CAT、Bcl-xl/Bak呈負相關(guān)（均P＜0.05），見表3。

Tab.3 Correlation analysis of ICAM-1 and various variables表3 ICAM-1與各變量相關(guān)性分析

3 討論

細胞交互作用機制在血管內(nèi)皮細胞損傷過程中起重要作用，特別是以PMN為代表的炎癥細胞與VEC間的交互作用成為內(nèi)皮細胞損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［7］。血管內(nèi)皮是全身炎癥反應的主要部位，而血管內(nèi)皮細胞是保證血管正常功能的重要細胞，血管內(nèi)皮功能障礙主要表現(xiàn)為血管內(nèi)皮細胞的損傷［8］。在正常狀態(tài)下，VEC處于未激活狀態(tài)，能對循環(huán)細胞與VEC的聚集和黏附起抵抗作用，VEC與PMN的黏附分子表達也處于基礎(chǔ)水平。研究顯示，當?shù)脱鯐r，VEC會出現(xiàn)功能障礙，進而引發(fā)心腦血管疾病和全身系統(tǒng)性損害的發(fā)生［8］。

現(xiàn)在，學者們已經(jīng)越來越關(guān)注到細胞與細胞間的交互作用與疾病的發(fā)生發(fā)展間的關(guān)系，比如腫瘤、急性肺損傷［9］等。在低氧相關(guān)疾病方面，研究比較多的集中于OSA的IH所致的PMN［10］或淋巴細胞［11］與VEC交互作用，且多處于動物實驗階段。目前尚少見關(guān)于重疊綜合征細胞交互作用的研究，尤其是細胞水平的研究。本研究探索性地將PMN與VEC直接共培養(yǎng)設(shè)為實驗組，單純VEC培養(yǎng)設(shè)為對照組，共同進行重疊模式低氧暴露，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實驗組IL-6、TNF-α、ICAM-1及MDA的表達水平均高于對照組，而抗氧化指標CAT的活力值低于對照組；同時實驗組凋亡相關(guān)基因Bak、Bcl-xlmRNA相對表達水平均高于對照組，而Bcl-xl/Bak低于對照組，表明實驗組無論炎癥反應、氧化應激反應、還是內(nèi)皮細胞凋亡速度均比對照組明顯加快，提示PMN與VEC的交互作用在其中起了重要作用。其機制考慮與Kent等［12］研究相仿：IH激活PMN，ROS產(chǎn)生增加，加強了PMN與VEC的黏附；同時IH亦激活內(nèi)皮細胞，黏附分子、炎癥趨化因子、促炎因子的炎癥通路被激活，進一步趨化PMN向VEC黏附；PMN釋放蛋白溶解酶、白細胞三烯、炎性細胞因子以及增加ROS產(chǎn)生，進而加速VEC損傷和凋亡。同時氧化/抗氧化狀態(tài)失衡，通過接觸依賴的方式，釋放多種炎性介質(zhì)及轉(zhuǎn)錄因子參與VEC損傷及凋亡。但依據(jù)筆者團隊前期研究結(jié)果，重疊低氧模式暴露下PMN與VEC交互作用比IH低氧模式暴露更劇烈［5］。由此，重疊低氧狀態(tài)下PMN與VEC的交互作用可使內(nèi)皮細胞損傷相關(guān)的炎癥、氧化應激及內(nèi)皮細胞凋亡更加劇烈，即PMN與VEC間的交互作用促使重疊綜合征所致血管內(nèi)皮損傷更嚴重。

另外，在重疊模式低氧暴露下實驗組ICAM-1與IL-6，TNF-α，MDA呈正相關(guān)，與CAT，Bcl-xl/Bak呈負相關(guān)，表明在重疊低氧模式暴露下PMN與VEC的交互作用中ICAM-1起了重要作用。Fotis等［13］研究亦顯示，白細胞與血管內(nèi)皮細胞在循環(huán)中的黏附是血管內(nèi)皮損傷和動脈粥樣硬化發(fā)病的標志，其特征在于黏附分子的過表達。ICAM-1屬于黏附分子免疫球蛋白超家族中的成員之一，主要分布于內(nèi)皮細胞和白細胞表面，在血管病變中起重要作用。正常情況下ICAM-1很少表達或不表達，在低氧、炎癥刺激物、氧化物等作用下促進VEC表達ICAM-1，增強PMN與VEC間的黏附作用，促進血管內(nèi)皮的損傷。本實驗結(jié)果表明，ICAM-1與炎癥因子、氧化應激指標及凋亡相關(guān)基因有較高的相關(guān)性。Collins等［14］研究顯示，缺乏ICAM-1的小鼠動脈粥樣硬化病變大幅度減少，認為這可能與缺乏ICAM-1而使其介導的PMN黏附減少有關(guān)。血清ICAM-1能敏感反應炎癥水平。Meta分析表明OSA患者ICAM-1表達水平增加，并隨嚴重程度的增加而增加［15］。低氧可使ICAM-1表達增加，從而介導PMN向內(nèi)皮細胞遷移，進而抑制PMN的凋亡［16］。PMN在炎癥部位存活時間的延長會產(chǎn)生過多有害物質(zhì)，從而擴大炎癥反應，加速內(nèi)皮細胞凋亡［17］。中性粒細胞釋放的過氧化氫是內(nèi)皮細胞功能的重要介質(zhì)。Habas等［18］研究顯示，過氧化氫誘導的氧化應激可促進ICAM-1水平升高，影響內(nèi)皮細胞功能，這可能是動脈粥樣硬化的形成因素之一；另外，這種升高可以通過N-乙酰半胱氨酸（NAC）抗氧化作用來降低，表明ICAM-1與氧化應激指標相關(guān)。陳鐵龍等［19］研究顯示，TNF-α能明顯增加HUVEC的凋亡率，同時上調(diào)ICAM-1在HUVEC中的表達，TNF-α可抑制內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）的釋放，并激活核因子（nuclear factor，NF）-κB、轉(zhuǎn)錄激活蛋白（activator protein，AP）-1的表達，表明ICAM-1與TNF-α水平有相關(guān)性，與本研究結(jié)果一致。

綜上所述，ICAM-1與炎癥、氧化應激及細胞凋亡有較高的相關(guān)性，炎癥和氧化應激相關(guān)因子可刺激內(nèi)皮細胞產(chǎn)生ICAM-1增多，而ICAM-1可以很好地介導PMN與VEC黏附，促使PMN凋亡延遲并分泌更多的有害物質(zhì)，從而加速VEC凋亡。本文從細胞水平為重疊綜合征所致血管內(nèi)皮損傷提供了理論依據(jù)。