唐儉，陳旭昕，樊重陽(yáng)，韓志海，△

肺泡巨噬細(xì)胞是體內(nèi)重要的吞噬和抗原提呈細(xì)胞，其作為固有免疫系統(tǒng)中的“第一道防線(xiàn)”參與了多種肺部疾病包括急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）的發(fā)病過(guò)程［1-2］。目前依據(jù)極化狀態(tài)的不同，巨噬細(xì)胞可分為M1和M2兩個(gè)亞群，調(diào)控巨噬細(xì)胞極化方向是治療ARDS等多種炎癥失控疾病的潛在策略［3］。Paralemmin-3（PALM3）屬于Paralemmin蛋白家族，本課題組前期研究表明，下調(diào)PALM3的表達(dá)可以抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng)［4］，但上調(diào)PALM3的表達(dá)對(duì)巨噬細(xì)胞極化方向是否存在影響尚少見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究擬通過(guò)以慢病毒為介導(dǎo)，構(gòu)建含大鼠PALM3基因的重組慢病毒載體，并測(cè)定PALM3在肺泡巨噬細(xì)胞中的表達(dá)情況，以期為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞（DH5α）及293T細(xì)胞由武漢普諾賽生命科技有限公司提供；大鼠肺泡巨噬細(xì)胞（NR8383）購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)；pCV186載體及慢病毒空載體pCV186-Cherry購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司；DMEM培養(yǎng)基、Ham’s F12培養(yǎng)基和胎牛血清均為GIBCO公司產(chǎn)品。Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒及Trizol購(gòu)自Invitrogen公司；質(zhì)粒抽提試劑盒膠購(gòu)自Qiagen公司；DNA回收、純化試劑盒、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（PCR）試劑、DNA連接試劑盒、BamHⅠ和AgeⅠ限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自TaKaRa公司；抗鼠PALM3多克隆抗體購(gòu)自Sigma公司；抗GAPDH及二抗購(gòu)自Santa Cruz公司；蛋白定量和細(xì)胞蛋白提取試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天公司；ECL-PLUS發(fā)光試劑盒及蛋白Marker均購(gòu)自Thermo Fisher公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 293T細(xì)胞所用培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2及95%濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔1 d換液1次，2～3 d傳代1次。NR8383細(xì)胞所用培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的Ham’s F12培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2 d換液1次，3～4 d傳代1次，實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.2.2 鼠PALM3基因擴(kuò)增 在GenBank中查閱大鼠PALM3的mRNA序列（XM-002728582），采用premier 5.0設(shè)計(jì)特異性引物，上游引物：5′-AGGTCGACTCTAGAGGATCCCGCCACCATGGCTCTGCAGACCCCGGTG-3′；下游引物5′-TCCTTGTAGTCCATACCGGTCATGACCACACAACACTGGCACG-3′，BamHⅠ酶切位點(diǎn)為GGATCC，AgeⅠ的酶切位點(diǎn)為ACCGGT。引物的設(shè)計(jì)和合成由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司完成。反應(yīng)條件如下：依次98℃5 min；98℃10 s，55℃10 s，72℃90 s，以上循環(huán)30次，取10μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.3 重組質(zhì)粒pCV186-cherry-PALM3的構(gòu)建與鑒定 用BamHⅠ和AgeⅠ酶切質(zhì)粒pCV186-cherry及鼠PALM3基因擴(kuò)增產(chǎn)物，酶切產(chǎn)物純化后，用DNA連接酶連接線(xiàn)性化的pCV186-cherry及rat-PALM3基因片段，轉(zhuǎn)化至DH5α，在含有氨芐青霉素抗性的LB瓊脂培養(yǎng)平板上培養(yǎng)過(guò)夜，挑選單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，行PCR鑒定，PCR反應(yīng)的上游引物：5′-AAAAGCTTGGGGCAGAGCTG-3′；下 游 引 物 ：5′-CCTTATAGTCCTTATCATCGTC-3′。此引物由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成，反應(yīng)條件如下：94℃3 min；94℃30 s，55℃ 30 s，72℃ 90 s，共22次循環(huán)。取10μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，對(duì)PCR鑒定正確的陽(yáng)性克隆小提質(zhì)粒并送檢測(cè)序。

1.2.4 重組慢病毒lenti-CV186-Cherry-PALM3的包裝與滴度測(cè)定 采用Qiagen公司的質(zhì)粒抽提試劑盒對(duì)重組質(zhì)粒及輔助包裝質(zhì)粒pHelper 1.0和pHelper 2.0進(jìn)行高純度無(wú)內(nèi)毒素抽提，按Lipofectamine 2000脂質(zhì)體說(shuō)明書(shū)將重組質(zhì)粒及輔助包裝質(zhì)粒pHelper 1.0和pHelper 2.0共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染8 h后更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，4℃，4 000 r/min離心10 min，隨后將上清液過(guò)濾到40 mL超速離心管中，25 000 r/min、4℃離心2 h，此時(shí)收集到的即為病毒濃縮液，病毒液保存于-70℃冰箱中備用。將293T細(xì)胞以5×104個(gè)/孔接種于96孔板中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過(guò)夜。分別加入逐孔稀釋的病毒液（1×10-1～1×10-6），12 h后去除含慢病毒的培養(yǎng)基，換為新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，然后采用熒光標(biāo)記法在熒光倒置相差顯微鏡下觀(guān)察并計(jì)算各孔中表達(dá)熒光的細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 最佳感染復(fù)數(shù)（multiple of infection，MOI）篩選 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NR8383細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，以1×105/孔的密度接種到96孔板中，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)，以不同MOI值（0、1、10、20、50）的重組慢病毒lenti-CV186-Cherry-PALM3感染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染方法同1.2.4。根據(jù)以下公式計(jì)算轉(zhuǎn)染效率：轉(zhuǎn)染效率=Cherry陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。轉(zhuǎn)染效率90%以上的最低MOI值為最佳MOI值。

1.2.6 Western blot檢測(cè)慢病毒感染NR8383細(xì)胞內(nèi)PALM3的表達(dá) 同1.2.5接種NR8383細(xì)胞到6孔板中，接種密度為1×106/孔，分為以下3組：空載體組、空白對(duì)照組及慢病毒lenti-CV186-Cherry-PALM3感染組（MOI=20），同1.2.4轉(zhuǎn)染NR8383細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后用蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞的總蛋白，測(cè)定蛋白濃度后，以GAPDH為內(nèi)參，取20μg樣品依次行SDS-PAGE電泳、電轉(zhuǎn)至PVDF膜，經(jīng)過(guò)脫脂牛奶封閉后，依次加入山羊抗大鼠PALM3多克隆抗體（1∶500）、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗山羊二抗（1∶2 500），ECL發(fā)光液中顯色。放入GBOX-HR凝膠成像分析系統(tǒng)中進(jìn)行攝像分析。以GAPDH作為內(nèi)參照，以PALM3的灰度值/GAPDH的灰度值代表PALM3蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 目的基因PALM3的擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增PALM3基因片段，預(yù)期條帶大小為2 246 bp，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，擴(kuò)增出的條帶位于2 000～3 000 bp之間，片段大小與預(yù)期結(jié)果一致，見(jiàn)圖1。

Fig.1 Electrophoresis of PALM3 gene segment by PCR amplification圖1 PCR擴(kuò)增PALM3基因片段電泳結(jié)果

2.2 重組載體pCV186-Cherry-PALM3的PCR鑒定 重組質(zhì)粒pCV186-Cherry-PALM3的陽(yáng)性克隆PCR產(chǎn)物大小為1 045 bp，設(shè)立內(nèi)參GAPDH片段作為陽(yáng)性對(duì)照，其對(duì)應(yīng)的產(chǎn)物大小為1 000 bp，同時(shí)設(shè)立ddH2O作為空白對(duì)照、空載體作為陰性對(duì)照，見(jiàn)圖2。

Fig.2 Electrophoresis identification of recombinant plasmid vector pCV186-Cherry-PALM3 by PCR圖2 重組質(zhì)粒pCV186-Cherry-PALM3的PCR電泳鑒定

2.3 重組載體pCV186-Cherry-PALM3的測(cè)序鑒定 挑選經(jīng)PCR鑒定成功的陽(yáng)性克隆送檢測(cè)序，測(cè)序結(jié)果證實(shí)rat-PALM3基因序列正確，無(wú)突變或缺失，與GenBank信息庫(kù)中rat-PALM3基因mRNA一致，表明重組質(zhì)粒pCV186-Cherry-PALM3已成功構(gòu)建，見(jiàn)圖3。

2.4 慢病毒顆粒包裝及滴度測(cè)定 重組質(zhì)粒pCV186-Cherry-PALM3、輔助質(zhì)粒（pHelper 1.0、pHelper 2.0）共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后在熒光顯微鏡下可觀(guān)察到特異性紅色熒光，見(jiàn)圖4，證明此重組慢病毒包裝成功。轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，重組慢病毒lenti-CV186-Cherry-PALM3感染滴度為3×108TU/mL。

2.5 轉(zhuǎn)染NR8383細(xì)胞最佳MOI篩選及轉(zhuǎn)染效率測(cè)定 轉(zhuǎn)染48 h后，肺泡巨噬細(xì)胞NR8383開(kāi)始出現(xiàn)少量紅色熒光，隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間延長(zhǎng)，各組熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，96 h后達(dá)到穩(wěn)態(tài)，見(jiàn)圖5。MOI值為0、1、10、20、50時(shí)，轉(zhuǎn)染效率分別為 0、（11.33±1.86）%、（40.0±2.89）%、（92.33±1.45）%、（80.33±2.60）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=3，F(xiàn)=387.600，P＜0.05），最佳MOI值為20。

Fig.3 DNA sequencing analysis of recombinant plasmid vector pCV186-Cherry-PALM3圖3 重組質(zhì)粒pCV186-Cherry-PALM3的測(cè)序結(jié)果

Fig.4 The morphology of 293T cells at 48 h after plasmid transfection under phase contrast and fluorescence microscopy(×200)圖4 三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染48 h后293T細(xì)胞在普通光學(xué)顯微鏡及熒光顯微鏡下的觀(guān)察（×200）

Fig.5 The fluorescence expression in NR8383 cells after transfection with lenti-CV186-Cherry-PALM3(×200)圖5 重組慢病毒lenti-CV186-Cherry-PALM3轉(zhuǎn)染NR8383細(xì)胞96 h后熒光表達(dá)情況（×200）

2.6 Western blot檢測(cè)PALM3蛋白表達(dá)情況 重組慢病毒lenti-CV186-Cherry-PALM3按MOI=20轉(zhuǎn)染NR8383細(xì)胞96 h后，lenti-CV186-Cherry-PALM3轉(zhuǎn)染組PALM3蛋白表達(dá)較空白對(duì)照組和空載體組顯著增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=3，F(xiàn)=43.670，P＜0.05）；而空載體組與空白對(duì)照組PALM3蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖6。

3 討論

成熟的巨噬細(xì)胞在各種因素下出現(xiàn)表型及形態(tài)分化，即巨噬細(xì)胞的極化現(xiàn)象［5］。極化后的巨噬細(xì)胞亞型可以細(xì)致調(diào)節(jié)及回應(yīng)各種不同的刺激，在機(jī)體宿主防御、免疫應(yīng)答、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中扮演著重要角色［6］。巨噬細(xì)胞極化的機(jī)制是刺激信號(hào)通過(guò)膜受體啟動(dòng)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，通過(guò)激活轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)不同基因表達(dá)以實(shí)現(xiàn)表型特征。巨噬細(xì)胞極化受多種信號(hào)分子調(diào)控，目前比較明確具有調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化作用的轉(zhuǎn)錄因子包括：核因子-κB、轉(zhuǎn)錄激活蛋白1、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激動(dòng)子、細(xì)胞因子信號(hào)抑制因子及過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體等［7］。

Fig.6 Western blot analysis of PALM3 protein expression in NR8383 cells圖6 NR8383細(xì)胞中PALM3 Western blot分析

PALM3是一種異戊二烯/棕櫚酰錨定的磷蛋白。最早于1992年為Cornish等［8］在非洲爪蛙中被發(fā)現(xiàn)，并將其稱(chēng)為Xlgv7/Xlcaax-1。PALM3主要參與細(xì)胞膜動(dòng)力學(xué)、細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性、細(xì)胞形狀控制及腫瘤淋巴管形成等［9］。前期研究發(fā)現(xiàn)，PALM3在肺泡上皮中參與了脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，下調(diào)PALM3的表達(dá)可以減輕LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)及改善內(nèi)毒素性急性肺損傷的程度［10-11］。本課題組近期研究發(fā)現(xiàn)，PALM3在肺泡巨噬細(xì)胞NR8383中有表達(dá)，下調(diào)PALM3的表達(dá)同樣能抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，而且下調(diào)PALM3后可抑制NR8383細(xì)胞中Toll樣受體/白細(xì)胞介素-1受體信號(hào)（Toll like receptor/Interleukin-1 receptor，TIR）通路中復(fù)合物的形成［4］。這些結(jié)果提示PALM3可能作為“接頭”分子，參與TIR信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，而TIR信號(hào)通路又參與了巨噬細(xì)胞的極化，因此筆者推測(cè)PALM3除了在巨噬細(xì)胞中參與調(diào)控LPS誘導(dǎo)的炎癥以外，可能還參與了巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控。調(diào)控巨噬細(xì)胞中PALM3的表達(dá)水平可能影響巨噬細(xì)胞極化的方向，從而改善炎癥和免疫相關(guān)疾病的預(yù)后。

慢病毒是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一個(gè)亞類(lèi)，其優(yōu)勢(shì)是具有同時(shí)感染分裂細(xì)胞與非分裂細(xì)胞的獨(dú)特能力，而其他逆轉(zhuǎn)錄病毒僅可感染分裂細(xì)胞［12］。對(duì)于原代細(xì)胞、干細(xì)胞等一些較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，應(yīng)用慢病毒載體可以大大提高靶基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，使目的基因整合到宿主細(xì)胞基因組中的可能性大大增加，能夠較方便快捷地實(shí)現(xiàn)目的基因長(zhǎng)期、穩(wěn)定表達(dá)［13］。本研究采用三質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)，包括2個(gè)輔助包裝質(zhì)粒和1個(gè)表達(dá)質(zhì)粒，3個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染1個(gè)細(xì)胞系，使序列重疊的機(jī)會(huì)減少，減少載體重組過(guò)程中產(chǎn)生有復(fù)制能力病毒的可能性［14］。表達(dá)質(zhì)粒主要表達(dá)目的基因、報(bào)告基因及目的基因啟動(dòng)子等，而輔助包裝質(zhì)粒表達(dá)病毒包裝所需的結(jié)構(gòu)蛋白。表達(dá)載體和包裝質(zhì)粒載體互補(bǔ)，共轉(zhuǎn)染包裝293T細(xì)胞后成功制備出重組慢病毒lenti-CV186-Cherry-PALM3，采用熒光標(biāo)記法測(cè)定病毒滴度為3×108TU/mL。轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞后可以觀(guān)察到報(bào)告基因Cherry表達(dá)，最佳MOI為20。后期經(jīng)Western blot法檢測(cè)目的基因PALM3表達(dá)，證實(shí)制備的重組慢病毒lenti-CV186-Cherry-PALM3對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞系NR8383細(xì)胞具有較高的感染效率。

綜上所述，本研究利用基因工程技術(shù)成功構(gòu)建了含鼠PALM3基因的重組慢病毒載體lenti-CV186-Cherry-PALM3，其滴度為 3×108TU/mL，感染NR8383細(xì)胞的最佳MOI值為20。該重組慢病毒載體不僅能夠在真核細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)PALM3的過(guò)表達(dá)，還可利用標(biāo)簽Cherry實(shí)現(xiàn)目的基因的示蹤定位，為下一步研究PALM3對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞極化的影響奠定了前期基礎(chǔ)。