梅宏翔 張懿丹 張城浩 劉恩言 陳昊 趙志河 廖文

1.口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院 成都 610041；

2.口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院正畸科 成都 610041

牙周炎是常見(jiàn)的口腔疾病之一，能夠破壞牙齒支持組織（包括牙槽骨和牙周膜），最終導(dǎo)致牙齒脫落[1]。隨著干細(xì)胞成骨分化研究的深入，干細(xì)胞（尤其是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞）療法和基于此的骨組織工程成為牙周炎骨質(zhì)流失治療的新興研究方向[2-3]。

循證醫(yī)學(xué)證據(jù)顯示，茶飲用量作為一個(gè)獨(dú)立因素，與股骨、腰椎等處的骨密度呈正相關(guān)[4]。此外，綠茶能夠抑制牙周炎的發(fā)生、發(fā)展，改善其牙周袋深度以及附著喪失[5]。這提示茶葉中的某些有效成分可能在牙周炎相關(guān)骨質(zhì)流失的預(yù)防與治療中發(fā)揮著重要作用。作為在茶葉中含量最多的兒茶素，表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）在成骨分化中的作用受到了藥物研發(fā)者的廣泛關(guān)注。

研究顯示，EGCG在抑制牙周炎癥[6]、延緩牙槽骨吸收[7]以及引導(dǎo)牙周組織再生[8]中發(fā)揮了重要作用。EGCG可以直接或者通過(guò)抗炎[9]、抗氧化[10]等途徑作用于成骨分化通路，影響干細(xì)胞成骨分化，對(duì)骨重建有正向調(diào)節(jié)作用。這些研究為EGCG作為牙周炎相關(guān)骨質(zhì)流失的輔助治療藥物提供了理論支撐，也為其對(duì)骨組織工程材料的改性奠定了基礎(chǔ)。本文就EGCG在干細(xì)胞增殖及成骨分化中的作用進(jìn)行綜述，同時(shí)探討該作用在組織工程材料改性中的應(yīng)用。

1 EGCG簡(jiǎn)介

茶是世界上最受歡迎的飲品之一，茶多酚是茶葉中的主要成分，占茶葉干重的30%左右。超過(guò)80%的綠茶多酚是兒茶素（3,3,4,5,7-五羥基黃烷），即黃烷-3醇的衍生物。兒茶素主要由4種單體組成，分別是EGCG、表沒(méi)食子兒茶素[(-)-epigallocatechin，EGC]、表兒茶素沒(méi)食子酸酯[(-)-epicatechin gallate，ECG]、表兒茶素[(-)-epicatechin，EC]。其中，含量最多、藥理作用最強(qiáng)的組分是EGCG[11]。EGCG含有8個(gè)羥基，是綠茶多酚中含羥基最多的化合物（圖1）。

圖 1 EGCG的結(jié)構(gòu)Fig 1 The structure of EGCG

EGCG多羥基結(jié)構(gòu)（尤其是B環(huán)上的鄰二羥基和C環(huán)上的沒(méi)食子?；┵x予了其強(qiáng)大的自由基清除活性[12]。這也為EGCG的抗氧化[10]、抗腫瘤[13]以及促進(jìn)牙周組織缺損修復(fù)[8]等藥理作用奠定了基礎(chǔ)。

2 EGCG對(duì)干細(xì)胞增殖的影響

研究者對(duì)于EGCG在干細(xì)胞增殖中的作用意見(jiàn)不一。多數(shù)研究[14-15]發(fā)現(xiàn)，濃度為2.5、5、10 μmol·L-1的EGCG均能夠促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖，其中5 μmol·L-1的EGCG對(duì)增殖的促進(jìn)作用最強(qiáng)。5、10、20 μmol·L-1的EGCG甚至能夠阻斷缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-inducible factor，HIF）對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞活性的抑制作用[10]。即使對(duì)于脂肪干細(xì)胞，1.25和10 μmol·L-1的EGCG對(duì)其增殖活性的促進(jìn)作用也較為顯著[16]。但有研究[17]也提出，1 μmol·L-1的EGCG就能抑制小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞D1細(xì)胞系增殖。這種差異可能是實(shí)驗(yàn)使用的細(xì)胞來(lái)源和組成不同導(dǎo)致：前者使用從人骨髓組織中提取出的間充質(zhì)干細(xì)胞；后者使用的細(xì)胞系則是由小鼠骨髓基質(zhì)前體細(xì)胞克隆而來(lái)，雖具有多項(xiàng)分化潛能，但其主要成分仍為成骨細(xì)胞。

EGCG對(duì)細(xì)胞增殖的影響可能與多酚羥基結(jié)構(gòu)有關(guān)。其獨(dú)特的氧化還原微環(huán)境可以賦予其抗氧化或促氧化的雙重能力[18]。研究[10,19-20]發(fā)現(xiàn)，10 μmol·L-1以下的EGCG可以增加細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶，防止活性氧粒子（reactive oxygen species，ROS）介導(dǎo)的染色體損傷，抑制可能損害細(xì)胞功能的誘導(dǎo)性氧化應(yīng)激；高濃度（＞50 μmol·L-1）的EGCG則會(huì)自動(dòng)氧化，在培養(yǎng)基中產(chǎn)生過(guò)氧化氫，具有細(xì)胞毒性作用。因此，不同濃度的EGCG可能是通過(guò)調(diào)節(jié)ROS水平而影響細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖。

因此，適宜劑量（1～10 μmol·L-1）的EGCG能通過(guò)抗氧化途徑促進(jìn)干細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖，具有良好的生物安全性。這為牙槽骨吸和骨質(zhì)疏松相關(guān)藥物研發(fā)以及骨缺損重建提供了重要參考。

3 EGCG對(duì)干細(xì)胞成骨分化的影響

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)指出，EGCG能預(yù)防骨質(zhì)疏松及促進(jìn)骨重建[21]，并抑制牙周炎所導(dǎo)致的骨吸收[22]。這可能是EGCG通過(guò)抑制過(guò)度的氧化應(yīng)激[23]以及炎癥反應(yīng)[22]而抑制破骨細(xì)胞形成，而對(duì)于EGCG是否能夠直接刺激干細(xì)胞成骨分化尚未統(tǒng)一認(rèn)識(shí)。

成骨細(xì)胞成熟包括3個(gè)主要的發(fā)育階段：增殖、細(xì)胞外基質(zhì)的沉積與礦化[24]。細(xì)胞外基質(zhì)與細(xì)胞成骨相關(guān)基因的表達(dá)密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，EGCG對(duì)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化具有積極作用。Chen等[25]比較了茶葉中不同兒茶素對(duì)于D1細(xì)胞系成骨分化的影響，發(fā)現(xiàn)EGCG的促進(jìn)作用最強(qiáng)。其他的研究[17,26]也證實(shí)，在EGCG的刺激下，干細(xì)胞的堿性磷酸酶（alkaline phospha tase，ALP）以及骨基質(zhì)蛋白如Ⅰ型膠原、骨保護(hù)素、骨鈣素等成骨分化標(biāo)志性蛋白質(zhì)出現(xiàn)了進(jìn)行性上調(diào)。在轉(zhuǎn)錄水平也表現(xiàn)出相同的趨勢(shì)。轉(zhuǎn)錄因子Runx2和osterix在骨標(biāo)志性蛋白質(zhì)形成早期起著至關(guān)重要的正向作用[27]，而晚期Runx2的過(guò)表達(dá)則會(huì)抑制成骨細(xì)胞成熟[28]。EGCG則能使Runx2早期上調(diào)而隨后下調(diào)[29]，并促進(jìn)osterix的表達(dá)[17]，有利于成骨分化以及骨結(jié)節(jié)的生成。

然而，EGCG對(duì)小鼠成骨細(xì)胞前體細(xì)胞MC3T3-E1成骨分化的影響引起了一些爭(zhēng)議，Kamon等[30]認(rèn)為EGCG以劑量依賴(lài)性的方式抑制MC3T3-E1細(xì)胞系成骨分化；而Sakai等[31]則發(fā)現(xiàn)EGCG增強(qiáng)了前列腺素-2α介導(dǎo)的骨保護(hù)素合成，從而促進(jìn)成骨分化。但MC3T3-E1的多項(xiàng)分化潛能較弱，并不能藉此否定EGCG對(duì)干細(xì)胞成骨分化的正向作用。

4 EGCG促進(jìn)干細(xì)胞成骨分化的機(jī)制

4.1 抗氧化應(yīng)激途徑

研究[32]表明，過(guò)量的氧化應(yīng)激能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞的凋亡，使骨形成速率減慢。已知ROS能夠通過(guò)Wnt、Foxo、Hedgehog等信號(hào)通路抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化[33]。EGCG的多酚羥基結(jié)構(gòu)賦予其強(qiáng)大的抗氧化功能，多酚羥基結(jié)構(gòu)能夠與過(guò)量的自由基如ROS結(jié)合，使其失去活性，從而終止自由基聚合反應(yīng)[34]。因此，EGCG具有較強(qiáng)的抗氧化功能，能夠阻斷ROS的抑制作用，促進(jìn)干細(xì)胞成骨分化。

4.2 抗炎途徑

由于炎癥能夠促進(jìn)骨質(zhì)吸收和抑制新骨形成，牙周炎成為牙槽骨骨質(zhì)流失的重要原因。EGCG的另一種作用就是抗炎，可能在抑制炎癥性骨質(zhì)流失中扮演著重要角色。有研究[9]證實(shí)，EGCG能抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的小鼠炎癥性牙槽骨骨吸收。這可能與EGCG與層粘連蛋白受體（laminin receptor，LR）特異性結(jié)合而介導(dǎo)抗炎作用有關(guān)[35]。EGCG的處理能夠通過(guò)LR依賴(lài)的途徑下調(diào)Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）4的表達(dá)并且上調(diào)其負(fù)調(diào)控因子Tollip，來(lái)抑制TLR4/絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/核因子（nuclear factor，NF）-κB信號(hào)通路的表達(dá)[36]。另一項(xiàng)研究[15]進(jìn)一步證實(shí)，EGCG能夠通過(guò)阻斷NF-κB通路來(lái)抑制腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α的生成，從而促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化。

4.3 經(jīng)典的成骨分化通路

Wnt/β-連環(huán)蛋白（catenin）通路參與了骨量調(diào)節(jié)，能夠控制全身所有骨骼的骨質(zhì)發(fā)育以及防止成年后的骨質(zhì)流失[37]。Wang等[38]發(fā)現(xiàn)，EGCG通過(guò)直接上調(diào)Wnt/β-連環(huán)蛋白通路元件的表達(dá)，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化活性。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）/Smad信號(hào)通路可能在EGCG的調(diào)節(jié)作用中也扮演著重要角色。Jin等[14]研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用EGCG對(duì)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的促進(jìn)作用有限，僅能使BMP-2表達(dá)升高，并不能使其他成骨相關(guān)基因表達(dá)上升。Chen等[17]證實(shí)，EGCG能夠促進(jìn)核心結(jié)合因子α1（core-binding factor-α1，Cbfa1）的表達(dá)。而Cbfa1又能與細(xì)胞質(zhì)BMP信號(hào)分子Smad結(jié)合，在誘導(dǎo)干細(xì)胞成骨分化中發(fā)揮關(guān)鍵作用[39]。這些研究說(shuō)明EGCG促進(jìn)成骨分化的能力可能與BMP/Smad相關(guān)通路存在潛在聯(lián)系。

4.4 表觀(guān)遺傳途徑

微小RNA（micro RNA，miRNA）在成骨分化以及骨折愈合中具有重要作用。研究[40]證實(shí)miRNA-210能夠通過(guò)調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）參與缺氧調(diào)節(jié)的成骨分化。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)EGCG處理后，其mi-RNA210水平升高，從而促進(jìn)成骨分化相關(guān)信號(hào)分子的表達(dá)。這可能依賴(lài)于miRNA-210對(duì)受體酪氨酸激酶配體-A3的3’非翻譯區(qū)的靶向抑制作用[41]。

5 EGCG修飾的組織工程材料的應(yīng)用

鑒于良好的生物安全性以及對(duì)成骨分化的促進(jìn)作用，EGCG局部作用在骨折以及牙槽骨骨質(zhì)流失的修復(fù)中可能有廣闊的應(yīng)用前景。因此，EGCG對(duì)骨組織工程材料的改性受到較高的關(guān)注。

目前，材料荷載被認(rèn)為是藥物局部低濃度持續(xù)釋放的重要方式。有研究表明，EGCG/凝膠復(fù)合物能促進(jìn)小鼠顱骨缺損修復(fù)。這可能與EGCG在體內(nèi)緩慢釋放并在凝膠崩解后繼續(xù)附著于細(xì)胞表面有關(guān)，從而使EGCG能持續(xù)抑制炎癥，促進(jìn)小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化[42]。

另一方面，EGCG與骨組織工程材料在誘導(dǎo)成骨方面存在著協(xié)同作用。Rodriguez等[43]將不同量的EGCG與α-磷酸三鈣顆粒交聯(lián)后填充于小鼠顱骨缺損中。結(jié)果顯示，加載了0.1和0.2 mg EGCG的植入物能促進(jìn)不規(guī)則骨小梁以及由成骨細(xì)胞構(gòu)成的骨樣群落的形成。這表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化能力得到了進(jìn)一步增強(qiáng)。

此外，Chu等[44-46]就EGCG對(duì)于膠原膜的修飾作用進(jìn)行了系列研究，發(fā)現(xiàn)EGCG交聯(lián)后不僅能夠增強(qiáng)材料的促成骨能力，還能改善支架材料的物理性能、表面形態(tài)和機(jī)械性能，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和黏附，降低炎性因子的釋放。這表明EGCG可以作為引導(dǎo)性骨再生材料的常規(guī)交聯(lián)劑，以發(fā)揮多重作用，促進(jìn)骨缺損的修復(fù)。

這些研究都為EGCG應(yīng)用于引導(dǎo)性骨再生提供了應(yīng)用場(chǎng)景和理論依據(jù)。但是，由于高濃度的EGCG可以抑制細(xì)胞體外增殖及成骨分化[47]，并抑制小鼠體內(nèi)的骨形成[43]，故不同臨床應(yīng)用方式下的最佳荷載濃度仍需要進(jìn)一步的研究。

6 展望

EGCG作為茶葉的重要活性成分，已經(jīng)受到了研究人員、醫(yī)藥廠(chǎng)商和公眾的廣泛關(guān)注。飲茶量與牙周炎癥呈負(fù)相關(guān)的流行病學(xué)證據(jù)提示，EGCG在預(yù)防和治療牙周炎癥中具有巨大的潛力。然而，盡管許多實(shí)驗(yàn)都對(duì)于EGCG在抗牙周病原菌以及抗炎中的積極作用進(jìn)行了肯定，但是其在牙槽骨再生的作用及其具體機(jī)制仍待進(jìn)一步探索。

在基礎(chǔ)研究方面，在考慮口腔應(yīng)用環(huán)境復(fù)雜性的同時(shí)，還應(yīng)進(jìn)一步深入至干細(xì)胞成骨分化通路水平，逐步完善機(jī)制網(wǎng)絡(luò)。同時(shí)，目前仍欠缺先進(jìn)的成像技術(shù)對(duì)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供系統(tǒng)性評(píng)價(jià)，以探究出最適濃度。而在未來(lái)的人體試驗(yàn)中，也應(yīng)該注意濃度對(duì)于安全性和治療效果的影響，并結(jié)合臨床評(píng)價(jià)方法，以確定EGCG對(duì)骨質(zhì)流失以及骨質(zhì)缺損等的治療效果。

就臨床應(yīng)用而言，EGCG的局部應(yīng)用以及對(duì)于骨組織工程材料的改性可能對(duì)于局部骨質(zhì)缺損有著更加重要的意義。一方面，材料能夠局部緩釋EGCG，以避免高濃度EGCG的毒性作用；另一方面，EGCG交聯(lián)可以?xún)?yōu)化材料性能，并可能通過(guò)抗炎、抗氧化等多種途徑協(xié)同促進(jìn)成骨分化。在之后的臨床實(shí)踐中，應(yīng)該根據(jù)不同的臨床場(chǎng)景設(shè)計(jì)不同的研究方向，對(duì)于EGCG的應(yīng)用量、交聯(lián)方式、比例等進(jìn)行探究，以滿(mǎn)足各種臨床需求。

鑒于EGCG良好的生物安全性和多重生理作用，其將為牙周炎相關(guān)骨質(zhì)流失以及骨質(zhì)缺損等疾病的治療提供新思路和新途徑。