朱桓毅 ，楊愛江 ，2，胡 霞 ，2，徐 鵬 ，鄧秋靜 ，2，范佳宇

（1. 貴州大學資源與環(huán)境工程學院，貴州 貴陽 550025；2. 貴州大學環(huán)境工程規(guī)劃設(shè)計研究所，貴州 貴陽 550025）

【研究意義】砷、銻、鎘是毒性極強的3種重金屬，且其礦山在中國分布廣泛，長期開采與冶煉對礦山周邊土壤、運輸線路周邊農(nóng)田與河流造成嚴重的重金屬污染，導致農(nóng)作物難以生長，受影響生物、植物進入食物鏈后甚至會對人體健康造成不可逆作用甚至是死亡［1-8］。目前常用超富集植物對受污染土壤進行植物提取修復，利用超富集植物能超量富集重金屬并將其轉(zhuǎn)移至地上部的特點，收割地上部以達到去除土壤重金屬污染的目的［9］。蜈蚣草是一種成熟的修復土壤砷污染的超富集植物，廖曉勇等［10］在田間試驗中發(fā)現(xiàn)蜈蚣草對砷污染土壤的修復率最高可達7.84%，且修復率與收割次數(shù)成正比關(guān)系，而陳同斌等［11］將蜈蚣草投入工程性土壤重金屬修復，并成功修復湖南郴州砷污染土壤。對蜈蚣草富集銻、鎘的特性在近年也有報道，研究發(fā)現(xiàn)其可富集銻386.7 mg/kg、鎘 952.26 mg/kg［12-13］。了解蜈蚣草體內(nèi)重金屬的賦存形態(tài)以及在多金屬共脅迫下對其賦存形態(tài)的影響對進一步探究蜈蚣草耐受重金屬毒性的機理有重要意義。【前人研究進展】重金屬在植物體內(nèi)分為多種形態(tài)，各種形態(tài)對植物造成的毒性不盡相同，存在差異性，這就導致了重金屬毒性同總量不一定成正比關(guān)系。對于植物的有效態(tài)目前主要分為許嘉琳等［14］提出的醋酸提取態(tài)、去離子水提取態(tài)、氯化鈉提取態(tài)、醋酸提取態(tài)、鹽酸提取態(tài)與吳慧梅等［15］提出的兩步連續(xù)提取法提取的鹽酸提取態(tài)、乙醇提取態(tài)等。乙醇提取態(tài)被認為是植物體內(nèi)生物活性最強的形態(tài)、易遷移，而且對植物銻的毒性效應(yīng)最為顯著［14］，但對水培植物體內(nèi)重金屬形態(tài)的研究鮮有報道?！颈狙芯壳腥朦c】本研究選用耐受多種重金屬的蜈蚣草為載體，進行As、Sb、Cd單一脅迫及交互脅迫試驗，并利用兩步連續(xù)提取法提取As、Sb、Cd的乙醇提取態(tài)與鹽酸提取態(tài)進行分析?！緮M解決的關(guān)鍵問題】探索As、Sb、Cd單一脅迫及交互作用下蜈蚣草的富集特性及形態(tài)分布，并進一步闡述重金屬在高耐性植物體內(nèi)的賦存形態(tài)規(guī)律，以期為植物修復技術(shù)提供更多元化的支撐數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

蜈蚣草采自貴州大學校園，篩選采摘平均莖長10～15 cm的蜈蚣草，采摘時連根同采，采回后立即用小股清水緩慢清洗，保證其根部完整性。

改良霍格蘭營養(yǎng)液：四水硝酸鈣945 mg/L、硝酸鉀506 mg/L、硝酸銨80 mg/L、磷酸二氫鉀136 mg/L、硫酸鎂493 mg/L、鐵鹽溶液2.5 mL/L、微量元素液5 mL/L；鐵鹽溶液：七水硫酸亞鐵5.56 g/L、乙二胺四乙酸二鈉7.46 g/L；微量元素液：碘化鉀0.83 mg/L、硼酸6.2 mg/L、硫酸錳22.3 mg/L、硫酸鋅8.6 mg/L、鉬酸鈉0.25 mg/L、硫酸銅0.025 mg/L、氯化鈷0.025 mg/L；酒石酸銻鉀、亞砷酸鈉、氯化鎘、氯化銨，均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 蜈蚣草培養(yǎng) 將采回的蜈蚣草置于改良霍格蘭營養(yǎng)液中預培養(yǎng)7 d，使其適應(yīng)水培環(huán)境后，立即進行試驗處理。所有培養(yǎng)過程在人工氣候箱中進行，白天溫度設(shè)置為23℃，夜晚溫度設(shè)定為10℃，所有植株長勢正常，無明顯枯萎、葉片變色等情況。

1.2.2 試驗設(shè)計 試驗設(shè)置重金屬單一脅迫及交互脅迫7個處理，分別為砷、銻、鎘、砷-鎘、砷-銻、銻-鎘、砷-銻-鎘脅迫，每個處理均設(shè)7個重金屬脅迫梯度，分別為1、5、10、30、50、70、90 mg/L（多金屬交互脅迫處理濃度均為設(shè)定濃度），探究各濃度梯度下重金屬在蜈蚣草體內(nèi)的富集特征。每個處理3次重復，以營養(yǎng)液水培作空白對照。脅迫時長統(tǒng)一設(shè)置為7 d，與Tisarum等［16］設(shè)定的蜈蚣草水培時間相同。

1.2.3 取樣方法 蜈蚣草水培7 d后，取其根、莖、葉，晾干后于烘箱中95℃殺青30 min，再于65℃烘干，磨成粉，過0.150 mm篩裝入密封袋保存待測。

1.3 分析方法

重金屬在植物中主要以乙醇提取態(tài)與鹽酸提取態(tài)毒性最強，重金屬銻形態(tài)分析分為乙醇提取態(tài)（簡稱為“乙醇態(tài)”）、鹽酸提取態(tài)（簡稱為“鹽酸態(tài)”）和殘渣態(tài)，分析方法參考兩步連續(xù)提取法測定植物中重金屬的形態(tài)［15］。

1.3.1 乙醇提取態(tài) 取0.1～0.3 g樣品粉末加入50 mL聚四氟乙烯離心管中，加入10 mL體積分數(shù)為80%的乙醇溶液，室溫振蕩20 h，10 000 r/min離心10 min，收集離心液，殘渣中再次加入10 mL乙醇溶液，室溫振蕩2 h，離心分離，重復2次，將3次離心液全部集中在50 mL三角瓶中，置于140℃電熱板上加熱濃縮后，加2 mL濃硝酸加蓋回流2 h，蒸至近干，重復回流一次。

1.3.2 鹽酸提取態(tài) 于乙醇提取態(tài)殘渣中加入10 mL鹽酸提取劑（0.6 mol/L），室溫振蕩20 h，10 000 r/min離心10 min，收集離心液，殘渣中再次加入10 mL鹽酸提取劑，室溫振蕩2 h，離心分離，重復2次，將3次離心液全部集中在50 mL三角瓶中，置于140℃電熱板上加熱濃縮后，加2 mL濃硝酸加蓋回流2 h，蒸至近干，重復回流一次。

1.3.3 植物殘渣態(tài) 將鹽酸提取態(tài)殘渣移入高壓密閉消解罐中，加入5 mL HNO3+2 mL H2O2+2 mL HF，預消解過夜后，180℃高壓密閉消解12 h，取出冷卻至室溫，置于160℃電熱板上蒸至呈黃豆大小液滴后，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，并逐級稀釋100倍后待測。

1.3.4 測定方法 上述所有提取液和消解液均用2% HNO3定容，使用原子熒光測定，測定前1 h各樣品加入1 mL硫脲和抗壞血酸將所有銻還原為三價。

試驗數(shù)據(jù)使用Origin進行整理并制作圖表，采用SPSS 24.0進行方差分析，應(yīng)用ANOVA進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜈蚣草對As、Sb、Cd的富集特征分析

2.1.1 蜈蚣草地下部對As、Sb、Cd的富集特征 由于蜈蚣草是一種能將As、Sb等重金屬快速轉(zhuǎn)運至地上部的蕨類植物［17］，因此本試驗將蜈蚣草分為地上部與地下部進行分析。由圖1可知，As、Sb、Cd單一脅迫下，蜈蚣草地下部對As、Sb、Cd的富集濃度與其脅迫濃度呈正比關(guān)系，且均在70 mg/L脅迫濃度時達到最大值，分別為 337.56、7 020.90、2 742.58 mg/kg，其中蜈蚣草地下部對砷的富集濃度相對較低，且總體趨勢隨脅迫濃度變化不明顯，這可能是由于其屬于砷的超富集植物，能快速將地下部砷轉(zhuǎn)移至地上部所致。當脅迫濃度高于70 mg/L，單一脅迫處理均出現(xiàn)地下部富集濃度下降的情況，其中脅迫濃度為90 mg/L時，As、Sb、Cd富集濃度降幅分別為10.9%、40.2%、23.9%。

在重金屬互作脅迫下，蜈蚣草地下部對As、Sb、Cd的富集能力均產(chǎn)生了較大變化，從圖1A可以看出，在As脅迫分別添加Sb、Cd、Sb+Cd后，蜈蚣草地下部對As的富集濃度均有增加，其中脅迫濃度50 mg/L時，As+Cd脅迫與單As脅迫相比，As濃度增幅達到最大值1279%，出現(xiàn)較大反常；而As+Sb脅迫雖然對As的富集濃度有所增加，但總體變化趨勢趨于平穩(wěn)。與單As脅迫組相似，可能是由于As、Sb兩種重金屬結(jié)構(gòu)與化學性質(zhì)的相似性，Sb的加入并沒有對蜈蚣草吸收As的通道造成損壞或功能紊亂，相似規(guī)律在圖1B中也有體現(xiàn)，蜈蚣草地下部對Sb的富集趨勢同樣沒有因為As的加入產(chǎn)生較大變化，且由于As的加入，Sb的富集量在50 mg/L開始趨于穩(wěn)定。

蜈蚣草富集重金屬的能力可能隨生長時間、生物量、地域等因素產(chǎn)生變化，目前對蜈蚣草的定位有許多不同意見，除作為砷的超富集植物是學界統(tǒng)一定論外，其是否能作為Sb超富集植物，結(jié)論不一［17］。本試驗發(fā)現(xiàn)，水培蜈蚣草對Sb的富集濃度遠超As、Cd（圖1），地下部Sb濃度隨脅迫濃度的增加呈現(xiàn)逐漸升高趨勢（圖1B），至脅迫濃度達到50 mg/L后，富集濃度趨勢開始出現(xiàn)反常，或突然降低或趨于平穩(wěn)；與As相似，多金屬互作脅迫同樣能提高蜈蚣草地下部對Sb的富集能力，增幅最大點同樣出現(xiàn)在加入Cd的50 mg/L Sb+Cd脅迫，增幅達到200.8%，Sb富集濃度為11 087.10 mg/kg。

圖1 各脅迫條件下蜈蚣草地下部對As（A）、Sb（B）、Cd（C）的富集濃度Fig.1 The enrichment concentration of As (A), Sb (B) and Cd (C) in the underground part of the Pteris vittata under different stress conditions

由圖1C可知，當As+Cd脅迫濃度高于50 mg/L、Cd脅迫與Sb+Cd脅迫濃度高于70 mg/L，蜈蚣草地下部對Cd的富集濃度均開始逐漸下降或趨于平穩(wěn)，而As+Sb+Cd脅迫出現(xiàn)反常，As、Sb的共同加入可能導致了蜈蚣草對Cd的吸收通路變化，促使根系能夠大量吸收Cd。

2.1.2 蜈蚣草地上部對As、Sb、Cd的富集特征植物莖部與葉部的重金屬是由根系吸收后經(jīng)過木質(zhì)部運輸或蒸騰作用等方式轉(zhuǎn)移至地上部［18-19］，因此對地上部富集濃度的分析即是對蜈蚣草轉(zhuǎn)運能力的分析。絕大多數(shù)植物吸收的重金屬大部分儲存在根部，難以向莖、葉部轉(zhuǎn)運，以此作為防御重金屬毒害的一種手段。蜈蚣草是砷的超富集植物，對As有較強的轉(zhuǎn)運能力，可能對同主族的Sb具有相似的轉(zhuǎn)運能力。而多金屬的互作脅迫作用，可能會對蜈蚣草體內(nèi)As的轉(zhuǎn)運能力產(chǎn)生影響，如圖2A所示，Sb、Cd的加入提高了蜈蚣草對As的轉(zhuǎn)運量，且脅迫濃度為50 mg/L時地上部As的富集濃度達到一個高點，之后出現(xiàn)一個下降趨勢，至70 mg/L后又出現(xiàn)回升趨勢，說明水培條件下，50～70 mg/L的脅迫濃度可能是蜈蚣草體內(nèi)As轉(zhuǎn)移的一個臨界點或極限點。蜈蚣草地上部富集As濃度的最大值出現(xiàn)在90 mg/L As+Cd脅迫，達到1 390.40 mg/kg；Sb的加入也能夠提升蜈蚣草地上部對As的富集能力，最大值達到1 139.10 mg/kg，相對提升98.1%，且不改變其對As的富集規(guī)律，而As對Sb也表現(xiàn)出相似規(guī)律，能提高蜈蚣草地上部對Sb的富集能力，且不改變Sb的富集規(guī)律。

圖2 各脅迫條件蜈蚣草地上部對As（A）、Sb（B）、Cd（C）的富集濃度Fig.2 The enrichment concentration of As (A), Sb (B) and Cd (C) in shoot of the Pteris vittata under different stress concentrations

Cd的加入對蜈蚣草轉(zhuǎn)運Sb的能力也有較大影響，如圖2B所示，蜈蚣草地上部Sb濃度最大值出現(xiàn)在70 mg/L Sb+Cd脅迫、達到5 613.30 mg/kg，而在之后的90 mg/L Sb+Cd脅迫卻急劇下降、降至90.90 mg/kg，降幅達到6175.2%，說明Cd的加入可能對蜈蚣草轉(zhuǎn)運Sb的能力影響較大，而從總體趨勢分析，除As+Sb+Cd脅迫外，蜈蚣草對Sb的轉(zhuǎn)運能力在脅迫濃度50～70 mg/L之后均呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢。

2.2 重金屬單一及互作脅迫下蜈蚣草轉(zhuǎn)移系數(shù)的變化分析

1977年，Brooks等［20］首次提出超富集植物的概念，其定義是能夠超量富集重金屬并將其轉(zhuǎn)運到地上部的植物。通常，超富集植物可以考慮以下兩個主要因素：一是植物葉片或地上部（干重）含Cd量達到100 mg/kg,含Co、Cu等達到1 000 mg/kg；二是植物地上部的重金屬含量高于根部（即轉(zhuǎn)移系數(shù)＞1）的植物稱為超富集植物，至今世界上共發(fā)現(xiàn)400多種超富集植物。而目前發(fā)現(xiàn)的重金屬耐性植物有許多，其能夠高富集重金屬在根部，但大都難以向地上部轉(zhuǎn)移，因此，轉(zhuǎn)移系數(shù)是識別高富集植物與超富集植物的分界線。

蜈蚣草可以耐受許多重金屬，但是僅對砷有穩(wěn)定的轉(zhuǎn)運能力。對比分析蜈蚣草在As、Sb、Cd單一脅迫與互作脅迫下蜈蚣草體內(nèi)對其轉(zhuǎn)移系數(shù)的變化情況（表1），在單一重金屬脅迫下，脅迫濃度達到30 mg/L后蜈蚣草對As的轉(zhuǎn)移系數(shù)穩(wěn)定＞1，這一穩(wěn)定規(guī)律在Sb、Cd中均沒有出現(xiàn)，說明蜈蚣草對Sb、Cd僅為高富集，而非超富集。

2.3 多金屬互作對蜈蚣草體內(nèi)重金屬形態(tài)變化的影響

表1 不同脅迫濃度下蜈蚣草體內(nèi)As、Sb、Cd轉(zhuǎn)移系數(shù)Table1 The transfer coefficient of As, Sb and Cd in Pteris vittata under different stress concentrations

重金屬的乙醇態(tài)被認為是在植物體內(nèi)生物活性最強的形態(tài)，毒性效應(yīng)也最顯著，其提取的重金屬乙醇態(tài)是以硝酸鹽、氯化物為主的無機鹽及氨基鹽等，而重金屬的鹽酸提取態(tài)是以草酸鹽為主［14，21］，殘渣態(tài)為除以上兩種形態(tài)外剩余的重金屬提取態(tài)，各提取態(tài)中所含重金屬被提取部分見表2。根據(jù)前述試驗發(fā)現(xiàn)，重金屬脅迫濃度在50～70 mg/L時，蜈蚣草對重金屬的富集量達到峰值，綜合考慮選用50 mg/L作為研究重金屬形態(tài)變化的重金屬脅迫濃度，通過施加不同重金屬共脅迫分析蜈蚣草根、莖、葉中蜈蚣草重金屬提取態(tài)的變化情況。

表2 重金屬化學提取態(tài)與可被提取部分之間的關(guān)系［14,21］Table2 Relationship between chemical extraction states of Heavy metals and the extractable parts

圖3 多金屬脅迫下蜈蚣草體內(nèi)As乙醇態(tài)濃度（A）、As鹽酸態(tài)濃度（B）與As殘渣態(tài)濃度（C）Fig.3 Ethanol concentration of As(A), hydrochloric acid concentration of As(B) and the residue concentration of As(C) in various parts of Pteris vittata with different metal treatments

2.3.1 多金屬脅迫對蜈蚣草體內(nèi)As形態(tài)的影響對As的提取態(tài)分析（圖3）發(fā)現(xiàn)，單一As脅迫下，蜈蚣草體內(nèi)各部位As的乙醇態(tài)、鹽酸態(tài)與殘渣態(tài)濃度均表現(xiàn)為葉＞莖＞根，說明蜈蚣草對砷的各種形態(tài)均有較好且穩(wěn)定的向上轉(zhuǎn)移能力；在加入其他金屬脅迫后，這一規(guī)律發(fā)生不同程度的變化，從As形態(tài)分析，隨著Cd的加入，根部As乙醇態(tài)濃度急劇降低，降幅達到87.1%，莖部及葉部也出現(xiàn)同樣趨勢，而根部鹽酸態(tài)與殘渣態(tài)濃度均有所上升，升幅分別達到316.3%、168.9%，說明Cd的加入可能是通過改變As在蜈蚣草體內(nèi)的賦存形態(tài)，從而影響蜈蚣草根部對As的富集能力與向上的轉(zhuǎn)運能力；Sb的加入對As的吸收有促進作用，且對蜈蚣草對As形態(tài)的轉(zhuǎn)化能力沒有太大影響，除葉部As的乙醇態(tài)低于單As脅迫外，其余均呈現(xiàn)不同程度的升高趨勢。從圖3可以看出，蜈蚣草在不同脅迫條件下，其根、莖、葉的As形態(tài)均以乙醇態(tài)與鹽酸態(tài)兩種重金屬有效態(tài)為主，占比在69.49%以上，最高達94.25%。

2.3.2 多金屬脅迫對蜈蚣草體內(nèi)Sb形態(tài)的影響 對As的超富集植物蜈蚣草中Sb的富集形態(tài)分析結(jié)果（圖4）表明，單Sb脅迫下，蜈蚣草根、莖、葉中Sb的殘渣態(tài)濃度分別達到852.2、770.8、643.3 mg/kg，占比分別為51.7%、47.5%、52.3%，說明殘渣態(tài)為蜈蚣草體內(nèi)Sb的主要賦存形態(tài)。從圖4A可以看出，加入As、Cd脅迫后，蜈蚣草根、莖、葉中Sb的乙醇態(tài)濃度大幅降低，由最高322.0 mg/kg降至19.9 mg/kg，且比較圖4B與圖4C發(fā)現(xiàn)，殘渣態(tài)仍為Sb的主要賦存形態(tài)，表明As、Cd的加入會導致蜈蚣草體內(nèi)的Sb難以向乙醇態(tài)轉(zhuǎn)化，從而降低了Sb對蜈蚣草的毒性作用，As、Cd對Sb毒性可能具有拮抗作用。

從蜈蚣草根部Sb形態(tài)分析，單Sb脅迫下，蜈蚣草根部Sb乙醇態(tài)、鹽酸態(tài)與殘渣態(tài)濃度分 別 為 285.0、512.5、852.2 mg/kg， 在 As+Sb、Sb+Cd、As+Sb+Cd脅迫下，Sb乙醇態(tài)濃度分別下降至35.6、77.3、37.9 mg/kg，Sb鹽酸態(tài)濃度分別提高至788.9、791.9、712.8 mg/kg，Sb殘渣態(tài)濃度分別提高至999.2、1 015.3、957.0 mg/kg，說明多金屬脅迫可以促進蜈蚣草根部Sb形態(tài)向鹽酸態(tài)與殘渣態(tài)轉(zhuǎn)化，抑制Sb向乙醇態(tài)轉(zhuǎn)化，重金屬的乙醇態(tài)屬于植物中的易遷移形態(tài)，因此As、Cd脅迫對蜈蚣草Sb轉(zhuǎn)移系數(shù)的抑制作用（表1）可能是由于體內(nèi)乙醇態(tài)濃度的降低導致的。

圖4 多金屬脅迫下蜈蚣草體內(nèi)Sb提取態(tài)濃度Fig.4 Extraction concentration of Sb in Pteris vittata with different metal treatments

2.3.3 多金屬脅迫對蜈蚣草體內(nèi)Cd形態(tài)的影響由圖5可知，Cd單一脅迫下，Cd的乙醇態(tài)濃度最大值出現(xiàn)在莖部、為27.5 mg/kg，表現(xiàn)為莖＞根＞葉；Cd的鹽酸態(tài)濃度最大值出現(xiàn)在葉部、為1 571.6 mg/kg，表現(xiàn)為葉＞根＞莖；Cd的殘渣態(tài)最大值出現(xiàn)在根部、為13.6 mg/kg，表現(xiàn)為根＞葉＞莖，總體規(guī)律表現(xiàn)為根、莖、葉Cd形態(tài)均以鹽酸態(tài)為主，占各部位Cd形態(tài)的90%以上，說明Cd在蜈蚣草體內(nèi)以硝酸鎘或氯化鎘為主（結(jié)合表2分析），而Cd脅迫使用的藥品為溶解后的氯化鎘，代表蜈蚣草吸收Cd后可能難以改變Cd的形態(tài)，也從另一方面證明了蜈蚣草對Cd的遷移、轉(zhuǎn)化能力較弱。

從蜈蚣草中Cd的主要賦存形態(tài)鹽酸態(tài)分析，圖5B顯示，Sb+Cd、As+Cd與As+Sb+Cd脅迫下，蜈蚣草根、莖、葉中Cd的鹽酸態(tài)呈遞增趨勢，最大富集濃度出現(xiàn)在As+Sb+Cd脅迫的根部，達到1 968.3 mg/kg，且相比于單Cd脅迫的增幅達到306.5%，說明As、Sb、Cd共脅迫能大幅促進蜈蚣草根部富集的Cd向鹽酸態(tài)轉(zhuǎn)變。

2.3.4 多金屬脅迫下蜈蚣草As、Sb、Cd的殘渣態(tài)轉(zhuǎn)化率 由于水培試驗中加入的As、Sb、Cd（C8H4K2O12Sb2、NaAsO2、CdCl3）均為可溶態(tài)，即可溶于乙醇與鹽酸，其被蜈蚣草吸收后在體內(nèi)進行形態(tài)轉(zhuǎn)化，則考慮其向殘渣態(tài)的轉(zhuǎn)化率也可近似地作為蜈蚣草對重金屬耐受性的表征因子。由表3可知，蜈蚣草體內(nèi)As的殘渣態(tài)轉(zhuǎn)化率均維持在10%以上，Sb、Cd共脅迫時會出現(xiàn)一定的浮動變化，總體上蜈蚣草As殘渣態(tài)轉(zhuǎn)化率維持在10%～20%，蜈蚣草對Sb的殘渣態(tài)轉(zhuǎn)化率較高，最高可達78.36%，整體穩(wěn)定在50%～65%，這也證明了蜈蚣草對Sb的響應(yīng)作用極為明顯，可以在高Sb環(huán)境下生長，而Cd的殘渣態(tài)轉(zhuǎn)化率最高僅為2%，整體水平上處于1%以下。

圖5 多金屬脅迫下蜈蚣草體內(nèi)Cd乙醇態(tài)濃度（A）、Cd鹽酸態(tài)濃度（B）、Cd殘渣態(tài)濃度（C）Fig.5 Ethanol concentration of Cd(A), hydrochloric acid concentration of Cd(B) and the residue concentration of Cd(C) in various parts of Pteris vittata with different metal treatments

表3 蜈蚣草各部位的As、Sb、Cd殘渣態(tài)轉(zhuǎn)化率Table3 Conversion rate of As, Sb, Cd residue state of various parts in Pteris vittata

從整體上看，蜈蚣草As殘渣態(tài)轉(zhuǎn)化率加入Sb、Cd脅迫后，下降了2.33～7.23個百分點，說明多金屬共脅迫下降低了蜈蚣草將As向殘渣態(tài)轉(zhuǎn)化的能力，這一規(guī)律與Cd殘渣態(tài)轉(zhuǎn)化率變化相似，而與Sb殘渣態(tài)轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)相反趨勢；在加入As、Cd脅迫后，轉(zhuǎn)化率提升了7.61～13.31個百分點，說明在蜈蚣草體內(nèi)As、Sb兩種同主族重金屬元素賦存形態(tài)的差異性。

3 討論

蜈蚣草是一種公認的As超富集植物，但是其是否為Sb、Cd的超富集植物目前學界爭議較大［17］。蜈蚣草對As、Sb、Cd富集濃度的最大值分別出現(xiàn)在脅迫濃度為90、70、70 mg/L時，富集濃度分別達到1 187.5、9 142.4、6 788.3 mg/kg，均表現(xiàn)出對3種重金屬的高富集能力，但是僅對As表現(xiàn)出穩(wěn)定的轉(zhuǎn)運能力，轉(zhuǎn)移系數(shù)穩(wěn)定＞1。部分研究中在礦區(qū)采樣發(fā)現(xiàn)蜈蚣草對Sb轉(zhuǎn)移系數(shù)＞1［17］，可能是由于礦山伴生礦導致的多金屬脅迫所致，如1 mg/L As+Sb脅迫，蜈蚣草對Sb的轉(zhuǎn)移系數(shù)＞1。相似情況也出現(xiàn)在Sb+Cd脅迫中，蜈蚣草對Cd的轉(zhuǎn)移系數(shù)在脅迫濃度為5～10 mg/L時發(fā)生突變、高達4.54，在As+Sb+Cd脅迫中也有出現(xiàn)，說明多金屬脅迫下蜈蚣草對Sb、Cd的轉(zhuǎn)移能力會受到影響。As、Sb共脅迫下，蜈蚣草可以提高對As的轉(zhuǎn)運能力，而Cd的介入則會降低其對As的轉(zhuǎn)運能力，其原因可能與Sb、As結(jié)構(gòu)的相似性有關(guān)。但是Sb、Cd無論在單一脅迫還是多金屬共脅迫下，僅少數(shù)脅迫處理表現(xiàn)出轉(zhuǎn)移系數(shù)＞1的情景，從整體上看，蜈蚣草并不具備良好的轉(zhuǎn)移Sb、Cd的能力，不是Sb、Cd超富集植物。

在單一金屬脅迫下，脅迫濃度大于70 mg/L后，As、Sb、Cd地下部富集濃度均開始下降，這可能與蜈蚣草的耐受極限有關(guān)，即通過流出作用［16］排出重金屬，降低其對自身的毒性。由于本試驗是在水培條件下進行，重金屬脅迫形態(tài)均為溶解態(tài)，利于植物吸收，其富集濃度與國內(nèi)外土培試驗結(jié)果［22-24］差距較大。

多金屬脅迫時，蜈蚣草地下部對As、Sb的富集濃度最大值均出現(xiàn)在外加Cd的脅迫中，說明Cd可能對蜈蚣草根部吸收As、Sb的通道產(chǎn)生影響，從而極大地提高了蜈蚣草地下部對As 的富集能力。章金鴻等［25］發(fā)現(xiàn)植物中的Cd70%分布在細胞質(zhì)中，陳同斌等［26］發(fā)現(xiàn)As在蜈蚣草體內(nèi)90%以上被貯存在液泡內(nèi)，兩者的亞細胞分布場所不同卻又相連，之間可能存在某種相互平衡的關(guān)系，導致Cd的加入能夠提高蜈蚣草根部對As與As的同族元素Sb的吸收。蜈蚣草地上部As濃度在Cd加入后同樣出現(xiàn)增加情況，但是轉(zhuǎn)移系數(shù)在不同程度上出現(xiàn)下降，說明Cd的加入是誘導蜈蚣草根部富集As的量增加，從而導致地上部的As富集濃度增加，并沒有對蜈蚣草的As轉(zhuǎn)運能力起到促進作用。Cd改變蜈蚣草對As、Sb富集特征的原因也有可能與蜈蚣草自身的特性有關(guān)，有研究認為植物根系和葉片中，Cd的亞細胞分布情況為細胞壁＞細胞器，轉(zhuǎn)移系數(shù)隨根系細胞壁和細胞器的分配比例增加而遞減［27］。而Sb的加入也提高了蜈蚣草地上部對As的富集濃度，但并沒有影響其對As的轉(zhuǎn)運規(guī)律，As的加入同樣提高了蜈蚣草對Sb的轉(zhuǎn)運能力，但并沒有影響其對Sb的轉(zhuǎn)運規(guī)律，說明As、Sb之間可能存在相互促進的作用，與Wan等［28］、王曉麗等［29］研究發(fā)現(xiàn)的蜈蚣草中As、Sb共脅迫會增加As、Sb的富集濃度結(jié)論相似。

植物體內(nèi)重金屬的賦存形態(tài)決定了其對植物的毒性效應(yīng)，植物從土壤中吸取的均為生物可利用態(tài)，但是最終檢測出的形態(tài)卻各有差異，重金屬形態(tài)在植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)變也表征了植物對其的耐受性。之前研究一直認為重金屬以遷移能力最強的乙醇態(tài)、鹽酸態(tài)毒性效應(yīng)最大［15］，但在本研究中發(fā)現(xiàn)蜈蚣草體內(nèi)對As、Sb、Cd的主要賦存形態(tài)均有所差異，說明重金屬各形態(tài)間關(guān)系復雜，雖然在植物體內(nèi)乙醇態(tài)、鹽酸態(tài)易溶于植物自身分泌的酸性物質(zhì)，易于被植物利用，但是其對植物造成的毒性效應(yīng)不一定最強。如蜈蚣草體內(nèi)As的乙醇態(tài)、鹽酸態(tài)濃度占比超過70%，但是蜈蚣草卻是一種As的超富集植物，As在蜈蚣草體內(nèi)主要以硝酸砷、氯化砷以及草酸砷等形式存在，是其較易于向上遷移的原因之一。蜈蚣草體內(nèi)Sb形態(tài)同其他植物有所差異，銻礦區(qū)植物包括玉米、桃、蘆葦、板栗等體內(nèi)Sb主要以鹽酸態(tài)為主，乙醇態(tài)占比極?。?0-31］，而蜈蚣草中的Sb主要以殘渣態(tài)為主，這可能是由于蜈蚣草通過轉(zhuǎn)變Sb形態(tài)來降低其對自身的毒性，是一種耐性機制。而Cd的形態(tài)在蘆葦中是以氯化鈉提取態(tài)（主要提取Cd果膠酸鹽與蛋白質(zhì)結(jié)合態(tài)或呈吸著態(tài)的重金屬等）為主［32］，屬于本研究中的殘渣態(tài)，但在蜈蚣草體內(nèi)卻幾乎不存在Cd的殘渣態(tài)（＜2%），其同一般植物體內(nèi)Sb形態(tài)存在差異性，說明重金屬在蜈蚣草體內(nèi)的賦存形態(tài)與蜈蚣草本身能夠大量富集多種重金屬且同時維持正常生長有關(guān)。Cd在蜈蚣草中主要以易遷移的鹽酸態(tài)為主，但是卻難以向地上部轉(zhuǎn)運，可能是由于根部吸收Cd后主要附著在細胞壁上［33］，而蜈蚣草細胞壁對重金屬有極強的“吸持作用”［26］，從而減低了Cd向地上部轉(zhuǎn)運的能力。

從殘渣態(tài)轉(zhuǎn)化率中分析發(fā)現(xiàn)蜈蚣草對Cd殘渣態(tài)的轉(zhuǎn)化率遠低于As、Sb，說明蜈蚣草對Cd的耐性機制同As、Sb不同，且蜈蚣草對As、Sb兩種結(jié)構(gòu)相似的重金屬確實有相似的耐性機制，即通過轉(zhuǎn)變重金屬形態(tài)來降低其在植物體內(nèi)的毒性效果。

由于試驗使用的是兩步連續(xù)提取法，僅測定重金屬乙醇提取態(tài)、鹽酸提取態(tài)與殘渣態(tài)，殘渣態(tài)中可能還包括了重金屬的果膠酸鹽與蛋白質(zhì)結(jié)合態(tài)或呈吸著態(tài)和水溶性有機態(tài)的重金屬等，存在一定的局限性，且受蜈蚣草生物量、根長等影響，具有不確定性，有待在進一步研究中完善。

4 結(jié)論

蜈蚣草對As在各種情況下均具備超富集通，而對Sb、Cd僅為高富集。Cd的加入可以促進蜈蚣草根部對As、Sb的富集能力。

重金屬在植物體內(nèi)的主要賦存形態(tài)表示了其對植物的毒害效應(yīng)，蜈蚣草體內(nèi)對As、Sb的賦存形態(tài)同Cd有較大差異，As在植物體內(nèi)以乙醇態(tài)與鹽酸態(tài)為主，兩者占比達到70%以上，Sb以殘渣態(tài)為主，占比達到50%以上，Cd以鹽酸態(tài)為主，占比達到90%以上，殘渣態(tài)占比極低，僅為1%左右。多金屬共脅迫實驗中發(fā)現(xiàn)，Sb的加入可以促進蜈蚣草對As的富集能力，而Cd的加入會降低蜈蚣草中As乙醇態(tài)的濃度，可能是促使其向鹽酸態(tài)轉(zhuǎn)化。而As、Cd的加入會大幅降低蜈蚣草體內(nèi)Sb乙醇態(tài)的濃度，As、Cd對Sb毒性可能具有拮抗作用且會抑制蜈蚣草對Sb的轉(zhuǎn)運能力。As、Sb對蜈蚣草根部Cd的主要賦存形態(tài)鹽酸態(tài)也有極大影響，在As、Sb、Cd共脅迫下，同Cd單一脅迫相比，根部Cd鹽酸態(tài)增幅達到400%。重金屬間的互作作用雖不會改變蜈蚣草體內(nèi)對其的主要賦存規(guī)律，但是對各形態(tài)均會有顯著性影響，繼續(xù)進一步探究超富集植物體內(nèi)重金屬形態(tài)的賦存規(guī)律對理解超富集重金屬機制、解毒機制等會有較大幫助。