張 維，刁朝強，李 斌，包自超，張家韜，林北森，陳德鑫*

1. 中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所，山東省青島市嶗山區(qū)科苑經(jīng)四路11 號 266100

2. 貴州省煙草公司貴陽市公司，貴陽市南明區(qū)華坤大廈 550001

3. 中國煙草總公司四川省公司，成都市高新區(qū)世紀城路936 號 610041

4. 中國煙草總公司山東省公司，濟南市高新區(qū)龍奧北路1067 號 250101

5. 中國煙草總公司陜西省公司，西安市雁塔區(qū)雁南四路19 號 710000

6. 中國煙草總公司海南省公司，?？谑协偵絽^(qū)紅城湖路22 號 571199

煙草黑脛?。═obacco black shack）是由寄生疫霉（Phytophthora parasitica var. nicotiana）引起的一種毀滅性土傳病害，每年給煙草生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟損失［1］。目前，煙草黑脛病的防治主要以化學防治為主，但長期施用農(nóng)藥造成的污染問題，對煙草安全及人類健康都存在直接或間接的危害［2］。生物防治作為一種新型的病害防治措施，不僅對植物具有防病促生的作用，而且能有效克服生產(chǎn)中存在的農(nóng)藥殘留和病菌抗藥性問題［3-4］。周京龍等［5］研究表明，生防菌不僅對土傳病害的病原菌具有抑制作用，而且可以誘導植株產(chǎn)生抗病性，增強自身免疫力。楊秀榮等［6］利用生防細菌B579 處理黃瓜種子后，黃瓜立枯病得到有效控制，并促進了黃瓜生長。目前，利用生防細菌防治煙草黑脛病也取得了一定的成效。徐同偉等［7］發(fā)現(xiàn)從土壤中分離得到的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）YBM-4 菌株，對煙草黑脛病菌具有較強的拮抗作用。楊藝煒等［8］研究發(fā)現(xiàn)，菌株XF10 的發(fā)酵液及其揮發(fā)性代謝產(chǎn)物能較好地抑制煙草黑脛病菌的生長。然而，單一生防細菌的藥效期短、作用對象單一、易受自然環(huán)境影響、競爭存活能力有限且在田間的穩(wěn)定性差。郭橋燕［9］研究表明，復配拮抗菌對煙草黑脛病的防治效果遠高于單一菌株。為此，利用盆栽試驗和Biolog-ECO 技術，探究了復配拮抗菌FP246 對煙草黑脛病的防治效果，并分析了復配拮抗菌FP246 對根際土壤微生物群落多樣性的影響，旨在為復配生防菌在煙葉生產(chǎn)中防治黑脛病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試煙草品種為紅花大金元，由中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所提供。盆栽試驗所用土壤取自中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所即墨基地，該土壤未施用過供試菌劑。

供試菌劑：復配拮抗菌FP246［由沙福芽孢桿菌（Bacillus safensis）YJC-4、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）CY106 和CY111 組成，在中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所分離獲得］，10 億個/g 枯草芽孢桿菌可濕性粉劑（濰坊萬勝生物農(nóng)藥有限公司），58%甲霜錳鋅可濕性粉劑（陜西省西安市植豐農(nóng)藥廠）。

儀器：R71MHD15ZH 電子天平（感量0.1 g，常州奧豪斯儀器有限公司）、Multiskan GO 1510 酶標儀（美國Thermo 公司）、Eppendorf Minispin 離心機（德國Eppendorf 公司）、Biolog 微生物鑒定系統(tǒng)（型號GEN ⅢMicroStation，美國BioTek 公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

煙苗種植于中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所人工氣候室（溫度28 ℃，相對濕度60%），待煙苗生長至5～6 片真葉時進行移栽。共設4 個處理：T1 處理為復配拮抗菌FP246 菌液（OD600=0.10±0.02）；T2處理為10 億個/g 枯草芽孢桿菌粉劑（2 mg/mL）；T3 處理為58%甲霜錳鋅可濕性粉劑（3 mg/mL）；T4 處理為等量清水，即空白對照。每個處理3 次重復，每個重復20 株煙苗。

煙苗移栽后7 d 開始施用藥劑，每株灌根20 mL，每隔7 d 施用1 次，共施用3 次。在施藥后第23 天，用手術刀在煙苗莖基部刮一傷口，深度至髓部，將煙草黑脛病菌菌餅貼于傷口處，并用脫脂棉保濕［10］。

1.2.2 調(diào)查及計算方法

參照標準GB/T 23222—2008［11］方法，在接種黑脛病菌后7 d 調(diào)查對照組和處理組的發(fā)病率和病情指數(shù)，并計算相對防治效果。

發(fā)病率=（發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)）×100%

病情指數(shù)=［∑（各級病株或葉數(shù)×該病級值）/（調(diào)查總株數(shù)或葉數(shù)×最高級值）］×100

相對防治效果=［（對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)］×100%

1.2.3 Biolog-ECO 微生物群落功能多樣性分析

1.2.3.1 土壤樣品采集

第一，對“集合”概念的認識存在偏差.“集合”是不定義的概念，只要學生感知，明白是什么就可以.不必深究它的內(nèi)涵，這也是教科書本節(jié)內(nèi)容標題為“集合的含義及其表示”而非“集合的概念及其表示”的用意.教科書在習題中給出的“閱讀題”有這樣的敘述：一位漁民非常喜歡數(shù)學，但他怎么也想不明白集合的意義.于是，他請教數(shù)學家：“尊敬的先生，請你告訴我，集合是什么？”集合是不定義概念，數(shù)學家很難回答那位漁民.有一天，他來到漁民的船上，看到漁民撒下魚網(wǎng)，輕輕一拉，許多魚蝦在網(wǎng)中跳動.數(shù)學家非常激動，高興地告訴漁民：“這就是集合！”[1]

當對照組發(fā)病率達到50%時，采用多點混合法隨機收集土壤樣品［12］。小心挖出育苗盆中整株煙苗，抖掉根系外圍土保留根際土，同時去除根系雜物，經(jīng)室內(nèi)自然風干后過1 mm 篩。隨后土樣保存于-80 ℃冰箱，用于Biolog 微生物鑒定分析。

1.2.3.2 Biolog-ECO 微平板接種

ECO 接種液制備方法：①供試土樣在室溫下活化24 h 后，取10 g 土樣于100 mL 無菌三角瓶，加45 mL 無菌水。置于28 ℃振蕩培養(yǎng)箱（180 r/min）培養(yǎng)30 min 后，取1 mL 泥漿于1.5 mL 離心管中。②10 000 r/min 離心20 min，棄去上清液，加1 mL 無菌生理鹽水（0.85% NaCl）在振蕩器上混勻5 min（此步驟重復3 次，以除去碳源）；棄去上清液，加1 mL 無菌生理鹽水，在振蕩器上振動5 min使之混勻，2 000 r/min 離心1 min。③取上清液加入裝有生理鹽水的試管中，使其OD590=0.13±0.02。④在Biolog-ECO 微平板每個樣品孔中加150 μL 接種液，每個樣品重復3 次。 將接種好的Biolog-ECO 微平板用自封袋裝好，置于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)。分別于0、12、24、48、72、96、120、144、168、192、216、240 h 用Biolog 微平板讀數(shù)儀測定吸光度。

1.2.3.3 多樣性指數(shù)計算方法

微生物代謝強度采用每孔平均顏色變化率（AWCD）進行描述［13］。土壤微生物群落代謝多樣性指數(shù)選取Shannon-Wiener 指數(shù)、Simpson 優(yōu)勢度指數(shù)、McIntosh 指數(shù)、豐富度指數(shù)進行表征［14-17］。

式中：Ci為第i 個非對照孔吸光值；R 為對照孔吸光值；N 為培養(yǎng)基碳源種類數(shù)。

式中：Pi表示第i 個非對照孔中的吸光值與所有非對照孔吸光值總和的比值，即Pi=（Ci-R）/∑（Ci-R）。

式中：ni是第i 個孔的相對吸光值（Ci-R）。

豐富度指數(shù)（S）指被利用的碳源總數(shù)目，即每孔（Ci-R）的值大于0.25 的孔數(shù)。

1.2.4 主成分分析（PCA）

Biolog-ECO 微平板由空白對照孔及31 種單一碳源孔組成，微生物通過每孔吸光值變化度來反映碳源的代謝特征。但這種多元的特征向量不易比較微生物間的代謝差異，因此利用SPSS 軟件將復配拮抗菌FP246 在不同培養(yǎng)時間下的每種碳源吸光值，通過降維的方式將多元特征向量吸光值變成2 個無關的主元向量PC1 和PC2，在二維空間比較不同微生物間的代謝差異。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理，多樣性指數(shù)及主成分分析采用240 h 土壤AWCD 值進行計算［18］，繪圖使用Origin 2018 軟件。

2 結(jié)果

2.1 復配拮抗菌FP246 對煙草黑脛病的盆栽防治效果

由表1 可知，T1 處理煙草黑脛病的發(fā)病率為21.67%，與T3 處理差異不顯著，與T2 及T4 處理差異顯著。T1 處理煙草黑脛病的病情指數(shù)為9.45，與對照T4 處理差異顯著。T1 處理的防治效果為85.40%，略低于T3 處理，但優(yōu)于T2 處理。盆栽防效試驗表明，復配拮抗菌FP246 對煙草黑脛病具有較好的防治效果且高于單一拮抗菌YJC-4［7］。

表1 不同處理下煙草黑脛病的盆栽防治效果①Tab.1 Control efficacies of different treatments on tobacco black shank in pot experiment

2.2 不同接種時間微生物代謝功能的AWCD 變化特征及主成分分析

由圖1 可知，隨著接種時間的增加，AWCD 值呈S 型變化趨勢。各個處理在0～24 h 的時間范圍內(nèi)不具有統(tǒng)計學意義。接種24 h 后，4 個處理AWCD 值的曲線斜率變大，在168 h 后趨于平穩(wěn)。比較各處理間AWCD 的最大值發(fā)現(xiàn)：T3＞T1＞T2＞T4，其中T3 處理與T1 處理之間的差值較小，但二者均與T2 處理間存在明顯差異。此外，清水對照T4 處理的AWCD 最大值顯著低于其他3 組處理。

圖1 不同處理根際土壤微生物AWCD 值的變化Fig.1 Variation of AWCD of rhizosphere microorganisms under different treatments

AWCD 值變化幅度越大代表微生物的碳源代謝力越強、豐富度越大［19］。對復配拮抗菌FP246在不同接種時間下的AWCD 值進行主成分分析，從31 種因子中提取4 個主成分因子，其中PC1、PC2 主成分得分貢獻率分別為64.98%和30.33%，累計貢獻率為95.31%。對PC1、PC2 主成分的得分進行作圖（圖2）表明，接種72 h 的得分在第3 象限、與其他培養(yǎng)時間點距離較遠，表明碳源在72 h時與其他時間點的利用情況差異顯著。雖然96 h在PC2 軸上的得分略高于120 和144 h，但后者均位于第1 象限，且距離極為接近，同時二者得分在PC2 軸上與其他時間點的距離較遠，說明接種120和144 h 對微生物碳源的利用情況有顯著影響。而接 種168、192、216、240 h 的 得 分相近，說明Biolog-ECO 微平板在接種168 h 及以后，微生物對碳源的利用情況相似，且無明顯差異。主成分分析結(jié)果表明，在Biolog-ECO 微平板接種96～144 h時間段內(nèi)，微生物對碳源的利用較為活躍，并與其他時間段存在顯著差異。

圖2 AWCD 值的主成分分析Fig.2 Principal component analysis of AWCD

2.3 不同接種時間微生物群落的多樣性分析

圖3 培養(yǎng)時間對根系微生物多樣性指數(shù)的影響Fig.3 Effects of incubation time on diversity index of rhizosphere microorganisms

圖3 表明，接種過程中，不同處理的微生物群落多樣性指數(shù)發(fā)生了變化。在接種72 h 后，T1、T3 處理的Shannon-Wiener 多樣性指數(shù)均高于T2、T4 處理，表明經(jīng)T1、T3 處理后的土壤微生物多樣性高于T2、T4 處理。在不同接種時間，McIntosh指數(shù)整體上為T3＞T1＞T2＞T4，且同一時間點不同處理之間存在顯著差異。隨接種時間的增加，McIntosh 指數(shù)呈上升趨勢，在168 h 后趨于平穩(wěn)。在接種96～240 h 期間，T1、T2、T3 處理的Simpson優(yōu)勢度指數(shù)變化不大，而T4 處理先上升后趨于平緩。豐富度指數(shù)結(jié)果顯示，T1 和T3 處理均與T2、T4 處理存在顯著差異，并且在接種培養(yǎng)168 h 以后，各處理的豐富度指數(shù)趨于穩(wěn)定。

2.4 微生物對不同碳源的利用特征

ECO 微平板含有31 種碳源，分別為胺類（苯乙基胺、腐胺）、糖類（β-甲基-D-葡萄糖苷、D-半乳糖內(nèi)脂、D-木糖、I-赤藻糖醇、D-甘露醇、N-乙?；?D-葡萄胺、D-纖維二糖、葡萄糖-1-磷酸鹽、α-D-乳糖、D,L-α-甘油）、酚酸類（2-羥苯甲酸、4-羥基苯甲酸）、羧酸類（丙酮酸甲脂、D-半乳糖醛酸、γ-羥基丁酸、D-葡萄胺酸、衣康酸、α-丁酮酸、D-蘋果酸）、氨基酸類（L-精氨酸、L-天冬酰胺酸、L-苯基丙氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、甘氨酸-L-谷氨酸）、聚合物類（吐溫40、吐溫80、α-環(huán)糊精、肝糖）［20-21］。通過測定不同碳源的平均吸光值，可以從側(cè)面反映微生物對各類碳源的利用情況。由圖4 可知，在接種96～240 h 期間，每個處理對糖類均有較高程度的利用，且均與T4 處理存在顯著差異。各處理在接種120 h 后，微生物對氨基酸的利用趨于穩(wěn)定，其中T3 處理利用氨基酸的程度略高于T1 和T2 處理。對羧酸類物質(zhì)的利用程度，T1處理在72～240 h 均高于其他處理，表明T1 處理利用羧酸類物質(zhì)的能力比T3 處理更強。隨著接種時間的延長，微生物對聚合物類物質(zhì)的利用整體上呈T2＞T1＞T3＞T4。此外，各處理對胺類和酚酸類物質(zhì)的利用程度顯著低于上述碳源，但均高于對照處理。綜上，微生物對糖類、氨基酸類、羧酸類以及聚合物類物質(zhì)的利用程度較高，且對這4類碳源的利用在接種120 h后變化趨于平緩。

圖4 培養(yǎng)時間對微生物碳源利用的影響Fig.4 Effects of incubation time on carbon source utilization of microorganisms

3 討論

Biolog-ECO 技術能快速反映微生物群落的特征變化［22］。土壤微生物群落多樣性指數(shù)越高，其多樣性越豐富，則土壤微生態(tài)功能越穩(wěn)定。本研究中，與對照相比，各處理AWCD 值和群落多樣性指數(shù)均顯著升高?？赡茉颍孩偻寥乐袪I養(yǎng)物質(zhì)豐富、適宜微生物的生長；②外源功能菌施入后大量繁殖，微生物種類和數(shù)量大幅度增加，對微平板中的碳源利用能力增強，與劉輝等［23］研究結(jié)果一致。主成分分析可用點的位置直觀反映土壤微生物群落多樣性的變化，并且樣品的得分與相似度呈反比［24-25］。主成分分析結(jié)果顯示，復配拮抗菌PF246 在接種120 h 和144 h 的得分極為相似，且與96 h 的得分接近。結(jié)合發(fā)病情況進行分析，在接入黑脛病菌96 h 后，黑脛病開始進入盛發(fā)期，增加土壤微生物對碳源的利用量，從而增強微生物的活性，豐富微生物群落的多樣性。此外，枯草芽孢桿菌對氨基酸具有一定的趨化性，可以促進其他物質(zhì)的合成。本研究中，T2 處理對氨基酸及聚合物的利用程度大于T1處理，與其他研究結(jié)果相似［26-27］。T1、T2、T3 處理后均能提高黑脛病的防治效果，增加土壤微生物的多樣性，提高碳源的利用程度，可能是因為土壤微生物產(chǎn)生的代謝物質(zhì)能影響植物根系細胞的通透性，促進植物對水分和營養(yǎng)元素的吸收，并能誘導植物產(chǎn)生抗病性，從而提高植株的抗病性，減輕病害的發(fā)生［28］。

農(nóng)藥的使用會對土壤微生物產(chǎn)生不同程度的影響，即使較低濃度也能引起微生物群落發(fā)生明顯變化［29-31］。楊琴［32］發(fā)現(xiàn)甲霜錳鋅在一定濃度范圍內(nèi)對土壤微生物的數(shù)量具有激活作用，可增加微生物多樣性指數(shù)，與T3 處理后的結(jié)果基本一致。農(nóng)藥處理后微生物多樣性增加，可能是由于農(nóng)藥對土壤環(huán)境結(jié)構(gòu)修飾后，改善了微生物的營養(yǎng)狀況，使土壤有機物質(zhì)更易被吸收利用，從而使土壤有益微生物的種類和數(shù)量得以增加，但具體原因有待進一步研究。

4 結(jié)論

①與單一拮抗菌YJC-4 相比，復配拮抗菌FP246 提高了煙草黑脛病的防治效果。②復配拮抗菌FP246 處理后增強了土壤微生物的碳源代謝能力，提升了微生物的豐富度。在接種培養(yǎng)96 h后，微生物對碳源的利用能力明顯升高。③3 個處理的Shannon-Wiener 多樣性指數(shù)、McIntosh 指數(shù)、Simpson 優(yōu)勢度指數(shù)、豐富度指數(shù)均顯著高于對照，表明土壤微生物的種類、數(shù)量、群落多樣性增加。④土壤微生物對碳源的利用程度升高，特別是糖類、氨基酸類、羧酸類、聚合物類物質(zhì)。