羅 勇，劉勝波，張 濤，王立志，軒棟棟，徐滌寒，邵惠芳，賈宏昉*

1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，鄭州市文化路95 號(hào)450002

2. 史丹利化肥寧陵有限公司，河南省商丘市寧陵縣露嶺路 476000

3. 浙江中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，杭州市上城區(qū)中山南路77 號(hào) 310000

硒是一種重要的營(yíng)養(yǎng)元素。大量研究表明硒對(duì)植物生長(zhǎng)具有雙重效應(yīng)，適量的硒可以增強(qiáng)抗氧化能力，延緩衰老，促進(jìn)植物生長(zhǎng)［1-2］。一般認(rèn)為，硒在低濃度(0.001～0.05 mg/kg)時(shí)對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育有促進(jìn)效應(yīng)，高濃度則起到抑制作用，甚至產(chǎn)生毒害［3］。Han 等［4］報(bào)道，低濃度硒（2.2 mg/kg）可促進(jìn)煙草生長(zhǎng)，根系生物量提高10.3%；高濃度硒（11.1 mg/kg）則抑制植物生長(zhǎng)，根系生物量?jī)H為對(duì)照處理的70.5%。高家合等［5］研究表明，施用適量硒不僅能提高根系活力，促進(jìn)煙草生長(zhǎng), 還提高了煙葉品質(zhì)和卷煙的安全性。賈宏昉［6］研究提出，葉片噴施適量的硒可顯著增加烤煙全氮含量、降低總糖含量，有利于改善烤煙品質(zhì)。王美珠等［7］發(fā)現(xiàn)煙葉硒含量的增加可導(dǎo)致卷煙焦油量和自由基濃度降低, 使人體的血硒水平通過(guò)抽吸富硒卷煙而得到提高?？梢?jiàn)，葉片噴施適量硒可提高烤煙的產(chǎn)量、品質(zhì)以及安全性。硒對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育的作用機(jī)制研究主要集中在抗氧化作用上，而對(duì)激素在這個(gè)過(guò)程中所起的作用研究較少。生長(zhǎng)素是調(diào)節(jié)植物根系發(fā)育的一種關(guān)鍵激素，參與脅迫反應(yīng)中根系構(gòu)型的變化［8-10］，從而有助于植物體從地下吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)到莖稈部，促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育［11］。Lehotai等［12］報(bào)道，施用高濃度Se（40 μmol/L）可抑制擬南芥主根伸長(zhǎng)并降低生物量。進(jìn)一步的研究表明，高濃度硒可以降低根尖生長(zhǎng)素濃度，但低濃度硒是否可以通過(guò)改變生長(zhǎng)素含量而促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育尚鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，以能標(biāo)記生長(zhǎng)素的DR5::GUS 云煙87 轉(zhuǎn)基因煙草為材料，研究不同濃度硒處理對(duì)煙草生物學(xué)性狀、生長(zhǎng)素、MDA 含量及NtYUCCA 和NtPINs 基因家族表達(dá)的影響，揭示不同濃度硒對(duì)煙草生長(zhǎng)發(fā)育的作用，旨在為富硒煙草栽培技術(shù)和煙葉的綜合利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2017—2018 年在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)文化路校區(qū)實(shí)驗(yàn)室的人工培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行，光強(qiáng)300 μmol·m-2·s-1，28 ℃/16 h 晝，24 ℃/8 h 夜。供試材料為DR5::GUS 云煙87 轉(zhuǎn)基因純合株系（該轉(zhuǎn)基因材料僅用于室內(nèi)試驗(yàn)，以便于標(biāo)記生長(zhǎng)素），DR5 是一個(gè)人工合成的響應(yīng)生長(zhǎng)素的啟動(dòng)子。挑選飽滿光潔無(wú)菌斑的種子經(jīng)過(guò)75%的酒精消毒30 s，10%次氯酸鈉消毒7 min,滅菌蒸餾水沖洗5 次，放在MS培養(yǎng)基上育苗，并放入28 ℃暗室培養(yǎng)3 d 催芽。催芽后的種子放入光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 周，選取長(zhǎng)勢(shì)較為一致的幼苗移至MS 培養(yǎng)基的組培瓶中，進(jìn)行21 d 的營(yíng)養(yǎng)處理。硒以Na2SeO3加入配置的MS培養(yǎng)基中，硒濃度為0、1、5、10 和20 mg/L，分別以Se0、Se1、Se5、Se10、Se20 表示。每處理設(shè)置3 次重復(fù)，每重復(fù)10 株煙苗。

1.2 樣品采集與分析

根系形態(tài)的測(cè)定：每重復(fù)取3株長(zhǎng)勢(shì)一致的煙苗（處理21 d），用去離子水沖洗根系，拍照，再用根系掃描儀［型號(hào)：Expression 11000xl，愛(ài)普生（中國(guó)）有限公司］測(cè)定不定根長(zhǎng)度，人工測(cè)定二級(jí)根長(zhǎng)度和數(shù)量。

生物量的測(cè)定：每重復(fù)取3 株長(zhǎng)勢(shì)一致的煙苗（處理21 d），分地上部和地下部用天平（感量0.001 g）稱量，并記錄樣品鮮質(zhì)量。

生長(zhǎng)素的測(cè)定：每重復(fù)取3 株長(zhǎng)勢(shì)一致的煙苗（處理21 d），分地上部和地下部，鮮樣于-70 ℃冷凍保存。采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)［13］測(cè)定煙株中生長(zhǎng)素含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。IAA 標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Sigma-Aldrich 公司。

NBT 染色與MDA 含量的測(cè)定：每重復(fù)取5 株長(zhǎng)勢(shì)一致的煙苗（處理7 d），用清水沖洗干凈，浸沒(méi)于NBT 染液中，30 ℃染色5 h。待染色完成后將葉片分別放入75%乙醇、95%乙醇中直至材料脫色完全，用Olympus SZX16 體式顯微鏡（日本奧林巴斯公司）觀察并照相。參照Feng 等［14］的方法測(cè)定MDA 含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。

GUS 組織染色和活性測(cè)定：每重復(fù)取5 株長(zhǎng)勢(shì)一致的煙苗（處理21 d），將煙苗整株浸沒(méi)于GUS染液中，37 ℃染色24 h。待染色完成后將煙苗分別放入75%乙醇、95%乙醇中直至材料脫色完全，在OlympusSZX16 體式顯微鏡下觀察并拍照。參照李依婷［15］的方法進(jìn)行GUS 活性測(cè)定。使用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)物，用Bio-Rad 蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒（美國(guó)伯樂(lè)公司）測(cè)定蛋白質(zhì)含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。

NtYUCCA 和NtPINs 基因家族的表達(dá)：煙苗處理21 d 后，對(duì)0、1 和10 mg/L 硒處理的煙苗整株取樣（每重復(fù)分別取10 株長(zhǎng)勢(shì)一致的煙苗），參照王立志等［16］的方法進(jìn)行qRT-PCR 分析。引物序列見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR 引物序列Tab.1 Primer sequences of qRT-PCR

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，新復(fù)極差法進(jìn)行差異的顯著性比較。采用Olympus SZX16體式顯微鏡、Adobe Photoshop 和Microsoft Excel 2010 軟件分別進(jìn)行染色拍照、圖像處理和圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度硒處理煙草表型及生物量的變化

與對(duì)照（Se0）相比(圖1A)，低濃度硒（Se1）處理煙苗根系發(fā)育較好，主根明顯伸長(zhǎng)，高濃度硒（Se5、Se10、Se20）處理植株矮小，葉片小而少。與對(duì)照（Se0）相比（圖1B、C），煙苗地上部和地下部（根系）生物量分別顯著增加76.9%和105.9%；高濃度硒處理（Se5、Se10、Se20）的煙苗地上部與地下部生物量與對(duì)照相比，分別顯著減少36.9%、60.8%、70.8%和39.8%、64.0%、73.8%。適宜的硒濃度顯著增加煙苗主根根長(zhǎng)和側(cè)根數(shù)，特別是Se1 處理，主根根長(zhǎng)和側(cè)根數(shù)分別是對(duì)照（Se0）的2.1 倍和2.0 倍（圖1D、E）。表明硒處理可以改變煙苗的根系結(jié)構(gòu)，低濃度硒（1 mg/L）能夠促進(jìn)煙苗根系的生長(zhǎng)發(fā)育，高濃度硒（5、10、20 mg/L）則起到抑制作用。

2.2 不同濃度硒處理對(duì)煙草生長(zhǎng)素含量的影響

5 個(gè)處理煙苗地上部和地下部生長(zhǎng)素含量見(jiàn)圖2。與對(duì)照（Se0）相比，低濃度硒處理的煙苗（Se1）地上部生長(zhǎng)素含量增加13.6%，地下部生長(zhǎng)素含量增加37.1%；高濃度硒處理（Se5、Se10、Se20）的煙苗地上部和地下部生長(zhǎng)素含量均顯著降低，其中煙苗地上部含量分別降低4.3%、32.6%和55.4%，而煙苗地下部生長(zhǎng)素含量分別降低10.7%、21.7%和34.2%。煙苗地上部和地下部生長(zhǎng)素含量隨著硒用量的增加而降低。

2.3 不同濃度硒處理對(duì)煙草抗氧化能力的影響

膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物MDA 含量見(jiàn)圖3。與對(duì)照（Se0）相比（圖3A），低濃度硒處理（Se1）的煙苗新葉顏色較淺，說(shuō)明活性氧量較少，抗氧化能力強(qiáng)，高濃度硒處理（Se10）的新葉顏色深，活性氧量較多，抗氧化能力弱。與對(duì)照相比（圖3B），低濃度硒處理（Se1）的煙苗MDA 含量下降39.8%，高濃度硒處理（Se10）MDA 含量則上升44.4%。說(shuō)明低濃度硒處理有利于降低MDA 含量，緩解氧化脅迫，對(duì)煙草細(xì)胞膜有一定保護(hù)作用，高濃度硒則促進(jìn)MDA 的生成，加劇氧化脅迫，進(jìn)而促進(jìn)了細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化。

圖1 不同濃度硒處理煙苗生物量統(tǒng)計(jì)及根系表型比較Fig.1 Biomass statistics and root phenotype of tobacco seedlings treated with Se at different concentrations

圖2 不同濃度硒處理煙苗生長(zhǎng)素含量比較Fig.2 Auxin contents in tobacco seedlings treated with Se at different concentrations

圖3 不同濃度硒處理煙苗葉色及MDA 含量比較Fig.3 MDA contents in tobacco seedlings treated with Se at different concentrations

2.4 不同濃度硒處理對(duì)煙草生長(zhǎng)素分布的影響

煙苗中DR5::GUS 的染色情況和GUS 活性見(jiàn)圖4。與對(duì)照（Se0）相比（圖4A），低濃度硒處理（Se1）煙苗新葉、側(cè)根根原基和距根尖1～2 cm 處的DR5::GUS 顏色較深，煙苗生長(zhǎng)素在根系分布較多；高濃度硒處理（Se10）則顏色較淺，煙苗生長(zhǎng)素在根系分布較少；與對(duì)照(Se0)相比（圖4B、C），低濃度硒處理（Se1）的煙苗地上部和地下部GUS 活性分別提高34.1%和40.1%，高濃度硒處理（Se10）的煙苗地上部和地下部GUS 活性則分別下降65.5%和67.6%。這表明低濃度硒處理DR5 啟動(dòng)子表達(dá)水平增強(qiáng)，高濃度硒則會(huì)抑制啟動(dòng)子表達(dá)，這與染色的結(jié)果一致。

2.5 不同濃度硒處理對(duì)煙草根系中NtYUCCA 和NtPINs 基因家族表達(dá)的影響

煙苗根系中NtYUCCA 基因家族和生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸?shù)鞍譔tPINs 基因家族的表達(dá)見(jiàn)圖5。除NtYUCCA3、NtYUCCA10 和NtPIN2、NtPIN3、NtPIN11的表達(dá)水平較低沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，低濃度硒處理（Se1）的 煙 苗 根 系 中NtYUCCA4、NtYUCCA6、NtYUCCA8 和NtYUCCA9 的基因表達(dá)水平分別增加87.2% 、521.3% 、725.2% 和248.3% ，NtPIN1a、NtPIN1c、NtPIN4 和NtPIN9 的基因表達(dá)水平分別增加91.1%、186.1%、35.4%和28.5%。高濃度硒處理（Se10）的 煙 苗 根 系 中NtYUCCA4、NtYUCCA6、NtYUCCA8 和NtYUCCA9 的基因表達(dá)水平分別降低62.8%、22.7%、47.9%和16.8%，NtPIN1a、NtPIN1c、NtPIN4 和NtPIN9 基因表達(dá)水平分別降低44.9%、22.8%、12.8%和14.7%。這表明低濃度硒處理可促進(jìn)生長(zhǎng)素合成和極性運(yùn)輸，高濃度硒處理則起到抑制作用。

圖4 不同濃度硒處理煙苗各部位生長(zhǎng)素分布和GUS活性比較Fig.4 Auxin distribution and GUS activity in different parts of tobacco seedlings treated with Se at different concentrations

圖5 不同濃度硒處理煙苗中NtYUCCA 和NtPINs 基因家族相對(duì)表達(dá)量比較Fig.5 Relative expressions of NtYUCCA and NtPINs gene families in tobacco seedlings treated with Se at different concentrations

3 討論

植物根系形態(tài)對(duì)植物體從土壤中吸收養(yǎng)分有較大影響［17］。在本試驗(yàn)中，低濃度硒（1 mg/L）處理可顯著促進(jìn)煙株生長(zhǎng)，高濃度硒(10 mg/L)處理則對(duì)煙株生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生抑制作用。這與Ramos 等［18］在生菜上和Yao 等［19］在小麥上的試驗(yàn)結(jié)果一致。付冬冬等［20］在對(duì)不同硒處理的小白菜研究中提出，低濃度硒處理可促進(jìn)小白菜的生長(zhǎng),而高濃度硒處理則起到抑制作用。但本試驗(yàn)結(jié)果與Lyons 等［21］和周鑫斌等［22］的研究結(jié)果存在差異。Lyons 等［21］認(rèn)為低濃度亞硒酸鹽對(duì)小麥的生長(zhǎng)雖有促進(jìn)作用，但效果沒(méi)有達(dá)到顯著水平；周鑫斌等［22］提出8 mg/L 以下的亞硒酸鹽濃度不會(huì)顯著提高水稻的生物量?？赡苁且?yàn)椴煌魑镱愋蛯?duì)硒的吸收與品種、pH、離子環(huán)境等因素有關(guān)，其有效濃度可能存在較大差異［23］，但總體趨勢(shì)為低濃度硒處理表現(xiàn)為促進(jìn)作用，高濃度硒處理則表現(xiàn)為抑制作用。

本試驗(yàn)中，低濃度硒處理煙株活性氧量減少，MDA 含量降低，而高濃度硒處理則活性氧量增加，MDA 含量提高。Cartes 等［24］研究提出，當(dāng)加入的硒濃度≥6.0 mg/kg 時(shí)，黑麥草中MDA 含量增加，反之則減少。Feng 等［25］研究表明，當(dāng)硒濃度≤2.0 mg/L 時(shí)，蜈蚣草中MDA 含量減少，反之則增加。MDA 是植物在逆境條件下的膜脂過(guò)氧化反應(yīng)產(chǎn)物之一，能直接反映膜受損和膜脂過(guò)氧化程度。植物在發(fā)生硒毒害的情況下，對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收會(huì)減少［26］，植物體內(nèi)Ca 可以抵抗逆境帶來(lái)的損傷，參與多種酶活性的調(diào)節(jié)［27］，保護(hù)細(xì)胞膜的完整性［28］。有研究表明，低濃度硒（2.2 mg/L）處理可以促使烤煙對(duì)Ca 元素的吸收，高濃度硒(22.2 mg/kg）處理烤煙各部位鈣含量均低于低濃度硒處理［29］。Mg 也有與Ca 相似的功能［30］。由此推測(cè)，煙株對(duì)Ca 和Mg 等元素的吸收，可能抑制了高濃度硒的毒害作用，其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。

生長(zhǎng)素參與植物生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控［31-32］。在本試驗(yàn)中，利用DR5::GUS 轉(zhuǎn)基因材料GUS 報(bào)告基因表達(dá)與生長(zhǎng)素分布積累部位一致的特性［33-35］，可直觀描述不同濃度硒處理對(duì)煙草生長(zhǎng)素分布的影響。前人研究表明，磷參與調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的生長(zhǎng)素合成和極性運(yùn)輸，從而影響根系的構(gòu)型［36］。缺磷可增加根系生長(zhǎng)素含量，促進(jìn)根系生長(zhǎng)，提高根冠比［37］。最新研究發(fā)現(xiàn)，亞硒酸鹽和磷酸鹽具有相似的吸收機(jī)制，磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OsPT8 參與植物對(duì)亞硒酸鹽的吸收［38］，推測(cè)硒可能通過(guò)與磷互作從而改變生長(zhǎng)素的濃度來(lái)影響植物生長(zhǎng)和發(fā)育。而有關(guān)硒和磷互作條件下添加外源生長(zhǎng)素對(duì)煙苗生長(zhǎng)發(fā)育的影響，以及磷硒互作對(duì)煙草生長(zhǎng)發(fā)育的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步試驗(yàn)。

不僅生長(zhǎng)素，其他內(nèi)源激素（細(xì)胞分裂素、乙烯、赤霉素）等對(duì)植物根系發(fā)育也可能有一定影響。有研究表明，高濃度硒處理通過(guò)活性氧的積累、植物激素的變化等復(fù)雜組合方式而抑制根系生長(zhǎng)［39］。Lehotai 等［12］利用擬南芥研究了亞硒酸鹽誘導(dǎo)的應(yīng)激過(guò)程中激素（生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、乙烯）和信號(hào)組分（NO 和H2O2）間可能的作用和關(guān)系。提出高濃度亞硒酸鹽誘導(dǎo)的乙烯生物合成增強(qiáng)可能導(dǎo)致植株細(xì)胞死亡，引起植物生長(zhǎng)障礙；同時(shí)，較高Se 濃度（20、40 μmol/L）處理可抑制蛋白質(zhì)的合成，增加活性氧的積累，影響植物根系的發(fā)育。因此，不同濃度硒處理下細(xì)胞分裂素、乙烯、赤霉素等激素在煙株根系發(fā)育過(guò)程中的作用及機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

在人工培養(yǎng)箱（光強(qiáng)300 μmol·m-2·s-1，28 ℃/16 h 晝，24 ℃/8 h 夜）中，通過(guò)改變培養(yǎng)基硒濃度（0、1、5、10 和20 mg/L）研究了煙草幼苗對(duì)不同濃度硒處理的響應(yīng)。硒對(duì)煙草的生長(zhǎng)發(fā)育具有雙重效應(yīng)。低濃度硒（1 mg/L）處理?xiàng)l件下, 生長(zhǎng)素合成NtYUCCA 基因家族與生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸?shù)鞍譔tPINs 基因家族的表達(dá)水平提高，生長(zhǎng)素的合成以及地上部向根部的極性運(yùn)輸明顯增加，根系生長(zhǎng)素含量提高，從而促進(jìn)煙草生物量顯著增加，并改變了煙草根系構(gòu)型（主根伸長(zhǎng)，側(cè)根數(shù)量多），MDA 含量降低，抗氧化能力增強(qiáng)，促進(jìn)了煙草的生長(zhǎng)發(fā)育；高濃度硒（10 mg/L）處理?xiàng)l件下，生長(zhǎng)素合成以及地上部向根部的極性運(yùn)輸被抑制，生長(zhǎng)素含量降低，煙草的生長(zhǎng)發(fā)育受到抑制。