高輝 王楊 陳婉婷 衛(wèi)波

昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科（昆明650051）

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展，人們飲食方式的改變，生活水平的提高，老齡化人口加劇，我國(guó)人群血脂水平正在逐步升高［1-2］。高脂血癥作為冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病等心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一［3］，其高發(fā)病率日益成為吞噬人類健康的隱形殺手。因此，高脂血癥的有效治療成為臨床最需迫切解決的問(wèn)題。

他汀類藥物是公認(rèn)最有效的降脂藥物，具有較好的耐受性和安全性。他汀類藥物是羥甲基戊二酰輔酶A（hydroxylmethylglutaryl-coenzyme A，HMG-CoA）還原酶抑制劑，主要通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制膽固醇合成的限速酶-HMG-CoA 還原酶的活性，阻斷肝細(xì)胞內(nèi)膽固醇的合成，上調(diào)肝細(xì)胞表面LDL 受體的水平，促進(jìn)血液中LDL 膽固醇的清除，從而達(dá)到有效降低血脂水平的目的。但不同個(gè)體對(duì)他汀藥物的反應(yīng)不同，個(gè)體的差異主要與他汀類藥物代謝的酶、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及藥物靶受體等的基因多態(tài)性相關(guān)［4］，特別是與編碼他汀類藥物肝臟代謝關(guān)鍵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（OATP1-B1）的SLCO1B1 基因以及參與體內(nèi)脂質(zhì)代謝的APOE 基因多態(tài)性相關(guān)。它們可影響他汀類藥物在血漿和肝臟中的濃度，進(jìn)而影響他汀類藥物的療效和安全性［5］。

本研究通過(guò)收集臨床診斷為高脂血癥患者的基線血脂和應(yīng)用他汀類降脂后的血脂結(jié)果等數(shù)據(jù)，采集患者的靜脈血進(jìn)行基因多態(tài)性的檢測(cè)，根據(jù)收集到的數(shù)據(jù)及臨床資料做SLCO1B1 521T ＞C位點(diǎn)和APOE 基因E2、E4 位點(diǎn)多態(tài)性與他汀類藥物療效的相關(guān)性研究分析。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象選取2016年6月至2018年3月就診于昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院且診斷為高脂血癥的住院患者81 例作為研究對(duì)象，其中男62 例，女19 例，年齡為（62 ± 12.43）歲。診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2007年版《中國(guó)成人血脂異常防治指南》［6］：（1）膽固醇（total cholesterol，TC）≥6.22 mmol/L；（2）甘油三酯（triglyceride，TG）≥2.26 mmol/L；（3）低密度脂蛋白（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）≥4.14 mmol/L。符合上述條件之一確診為高脂血癥。排除入院前已使用調(diào)脂藥物的患者及慢性肝病、嚴(yán)重腎功能不全、腫瘤、對(duì)他汀類藥物過(guò)敏和家族性高膽固醇血癥患者。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床資料收集收集口服他汀類藥物進(jìn)行降脂治療患者的用藥前、用藥1 個(gè)月后的5 項(xiàng)血脂TG、TC、高密度脂蛋白（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、LDL-C、載脂蛋白A1（apolipoprotein A1，APOA1）檢測(cè)結(jié)果，并隨訪觀察患者用藥期間的不良反應(yīng)情況。血脂檢測(cè)使用儀器為貝克曼全自動(dòng)生化分析儀AU5421，所用試劑為貝克曼原廠配套試劑。

1.2.2 DNA 提取取患者EDTA 抗凝靜脈全血2 mL 進(jìn)行核酸提取，使用天根生化科技股份有限公司血液基因組DNA 提取試劑盒（離心柱法），具體操作方法參照提取試劑盒操作說(shuō)明書(shū)。

1.2.3 SLCO1B1 和APOE 的熒光PCR 檢測(cè)使用武漢友芝友醫(yī)療科技股份有限公司的人類SLCO1B1 和APOE 基因檢測(cè)試劑盒，采用多重?zé)晒釶CR 法對(duì)提取的DNA 進(jìn)行SLCO1B1 基因SLCO1B1*5 521T ＞C 位點(diǎn)和APOE 基因E2、E4位點(diǎn)的檢測(cè)。反應(yīng)體系：基因組DNA 2 μL，SLCO1B1*5 反應(yīng)液、APOE2 反應(yīng)液、APOE4 反應(yīng)液分別23 μL，共25 μL。循環(huán)參數(shù)設(shè)置：UNG 處理階段共1 個(gè)循環(huán)，溫度設(shè)定37 ℃，共10 min；預(yù)變性階段共1 個(gè)循環(huán)，溫度設(shè)定為95 ℃，共5 min；PCR 反應(yīng)階段共40 個(gè)循環(huán)，循環(huán)溫度設(shè)定為95 ℃，時(shí)間為15 s，60 ℃時(shí)間為1 min，熒光信號(hào)的收集定為FAM 和VIC，并在60 ℃采集熒光信號(hào)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0 數(shù)據(jù)分析包對(duì)所得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布采用（±s）表示，偏態(tài)分布采用四分位數(shù)表示，兩組間正態(tài)分布計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)或配對(duì)t 檢驗(yàn)；偏態(tài)分布計(jì)量資料比較采用兩樣本秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用率及構(gòu)成比表示，計(jì)數(shù)資料及多組間的計(jì)量資料比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因型多態(tài)性頻率的Hardy-Weinberg H-W遺傳平衡檢驗(yàn)采用直接計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)基因型，計(jì)算各位點(diǎn)等位基因頻率?；蛐头植挤螲-W 平衡，說(shuō)明具有群體代表性。見(jiàn)表1、2。

2.2 SLCO1B1 521T ＞C 位點(diǎn)與應(yīng)用他汀類藥物療效相關(guān)性分析SLCO1B1 521T ＞C位點(diǎn)應(yīng)有CC、TC 和TT 3 個(gè)基因型，此次未檢測(cè)到CC 型，所以只對(duì)TC 型組和TT 型組這2 個(gè)基因型組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析：用藥前5 個(gè)血脂指標(biāo)（TG、TC、HDL-C、LDL-C、APOA1）分別進(jìn)行組間比較，TC 型組、TT 型組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義（P ＞0.05）。用藥后5 個(gè)血脂分別進(jìn)行組間比較：APOA1 水平組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且TT 型組APOA1 水平變化顯著高于TC 型組；其余4 個(gè)血脂指標(biāo)（TG、TC、HDL-C、LDL-C）的組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表3。

表1 SLCO1B1 基因的等位基因頻率和基因型頻數(shù)分布及H-W 平衡檢驗(yàn)Tab.1 Allele frequency and genotype frequency distribution of SLCO1B1 gene and H-W balance test 例

表2 APOE 基因的等位基因頻率和基因型頻數(shù)分布及H-W 平衡檢驗(yàn)Tab.2 Allele frequency and genotype frequency distribution of APOE gene and H-W balance test 例

表3 SLCO1B1 521T ＞C 位點(diǎn)與他汀類藥物療效Tab.3 Efficacy between SLCO1B1 521T ＞C and statins ±s

表3 SLCO1B1 521T ＞C 位點(diǎn)與他汀類藥物療效Tab.3 Efficacy between SLCO1B1 521T ＞C and statins ±s

參數(shù)TC（mmol/L）用藥前用藥后TG（mmol/L）用藥前用藥后HDL-C（mmol/L）用藥前用藥后LDL-C（mmol/L）用藥前用藥后APOA1（g/L）用藥前用藥后TT 型（69 例）4.57±1.11 3.83±0.95 2.43±1.92 1.53±0.72 0.98±0.22 0.98±0.22 2.75±0.88 2.25±0.81 1.20±0.27 1.17±0.18 TC 型（12 例）4.93±1.49 3.55±1.02 2.29±1.25 1.38±0.47 0.95±0.27 0.95±0.27 2.84±1.06 2.06±0.88 1.21±0.30 0.93±0.33 t 值-0.977 0.940 0.237 0.667 0.419 1.601-0.305 0.726-0.069 2.488 P 值0.331 0.350 0.813 0.507 0.677 0.113 0.761 0.470 0.945 0.028

2.3 APOE 基因與他汀類藥物療效的相關(guān)性分析APOE 基因共有E2/E3、E2/E2、E3/E3、E2/E4、E3/E4、E4/E4 6 個(gè)基因型，此次未檢測(cè)到E2/E2、E4/E4 型。根據(jù)其基因表型分為APOE E2 型（E2/E3、E2/E2）、APOE E3 型（E3/E3、E2/E4）和APOE E4 型（E3/E4、E4/E4）3 組。E2 型患者9 例，E3 型58例，E4 型14 例。對(duì)3 組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析得出：E2 型、E3 型E4 型與他汀類藥物用藥前的血脂水平相關(guān)性研究：用藥前E2 型、E3 型和E4 型與TG、TC 、HDL-C 和APOA1 水平間有差異，E2 型的TG和TC 水平顯著高于E3 和E4 型的患者，E4 型的HDL-C 和APOA1 水平顯著高于E2 和E3 型患者，其余血脂指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義（P＞0.05）。

E2 型、E3 型E4 型與他汀類藥物用藥后血脂水平相關(guān)性研究：用藥后患者的E2 型、E3 型和E4型與TG 、TC 和LDL-C 水平之間有差異，且E4 型的TC 和LDL-C 水平顯著高于E2 型、E3 型患者，E2型的TG 顯著高于E3 型和E4 型的患者。其余血脂指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表4。

3 討論

有研究指出，應(yīng)用他汀類藥物用藥后血脂結(jié)果變化的差異可達(dá)10%～70%［7］。這些差異受多種因素影響，除患者的性別、年齡、生活方式、用藥的依從性等非遺傳因素外，基因多態(tài)性已成為影響他汀類藥物調(diào)脂效果及不良反應(yīng)發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的重要因素之一。

SLCO1B1 基因定位于12 號(hào)染色體短臂12 區(qū)（12p12），全長(zhǎng)約109 kb，有14 個(gè)編碼外顯子和一個(gè)非編碼外顯子［8］。COUVERT 等［9］和THOMPSON等［10］研究結(jié)果顯示SLCO1B1 基因521 T ＞C 多態(tài)性與他汀療效無(wú)關(guān)聯(lián)。張昀赟等［11］研究得出SLCO1B1 521 T ＞C 基因變異可增強(qiáng)瑞舒伐他汀鈣降脂療效不同。APOE 基因多態(tài)性已被證實(shí)是心腦血管疾病的危險(xiǎn)因素［12］。劉國(guó)棟等［13］研究中指出不同的基因表型間個(gè)體血脂水平存在差異，APOE 基因表型組各占比E3 型＞E4 型＞E2型，E2、E3 表型組TC 濃度水平與E4 表型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。3 組均值比較顯示E2 表型組TG 濃度最高，E4 表型組TC、LDL-C濃度均值最高。

表4 APOE 基因與5 個(gè)血脂指標(biāo)之間的關(guān)系Tab.4 Analysis of APOE gene and seven blood lipid indices

本研究中檢測(cè)SLCO1B1 521T ＞C 位點(diǎn)基因多態(tài)性，對(duì)得到的TT 型、TC 型這2 個(gè)基因型組進(jìn)行組間比較，用藥后APOA1 水平組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），TC 型組顯著高于TT 型組，2組間的其余4 個(gè)血脂指標(biāo)的組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），提示SLCO1B1 521T ＞C 位點(diǎn)與他汀類藥物的療效有一定的相關(guān)性，需進(jìn)一步深入研究。另對(duì)APOE 位點(diǎn)E2 型、E3 型和E4 型3組進(jìn)行組間比較，用藥前5 個(gè)血脂指標(biāo)分別進(jìn)行組間比較：TG、TC、HDL-C、APOA1 水平組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。用藥后5 個(gè)血脂分別進(jìn)行組間比較：TG 、TC、LDL-C 水平組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。這一研究結(jié)果與劉國(guó)棟等人的研究中得出E4 表型組在TC、LDL-C 濃度最高的結(jié)果相符。

基于分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，聯(lián)合各種實(shí)驗(yàn)室不同檢測(cè)項(xiàng)目的檢驗(yàn)，未來(lái)SLCO1B1 和APOE基因的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)將會(huì)更加成熟地應(yīng)用于臨床，在他汀類藥物的個(gè)體化防治中發(fā)揮重要作用。