白麗杰 吳耀 李鴻斌 王靜 王勇

1內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院風(fēng)濕科（呼和浩特010059）；2呼和浩特市第一醫(yī)院骨科（呼和浩特010059）

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥為特征的系統(tǒng)性自身免疫性疾病［1］。其逐漸產(chǎn)生自身抗體如抗瓜氨酸蛋白抗體，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞及功能喪失引起骨和軟骨的進(jìn)行性破壞［2］。雖然目前關(guān)于RA 的病因尚無明確結(jié)論，然而，免疫調(diào)控失衡被認(rèn)為是介導(dǎo)其發(fā)生和發(fā)展的主要分子機(jī)制之一［3］。調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T cells，Tregs）是一種可以調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答以保持外周自耐受的特殊的抑制性細(xì)胞［4，9］。最新研究發(fā)現(xiàn)，Tregs特異性表達(dá)一個(gè)含有20個(gè)富含亮氨酸重復(fù)序列的80 kDa 跨膜蛋白糖蛋白A 重復(fù)序列（glycoprotein A repetitions predominant，GARP）［5］，具有與Toll 樣受體進(jìn)化的相似性，并且是潛在的轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factorβ，TGFβ）的結(jié)合蛋白，且GARP 是Tregs 作為免疫系統(tǒng)特異性TGF-β載體的關(guān)鍵分子在多種炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用［5］。而早期研究證實(shí)，活動(dòng)性RA 患者外周循環(huán)CD4+CD25highTregs 比例顯著降低［6］。同時(shí)，Tregs 的定性缺陷引起其在抑制促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生方面的不足［6］。并且，其參與調(diào)節(jié)的Th1 和Th2 反應(yīng)失衡被證實(shí)是多種炎癥反應(yīng)發(fā)生發(fā)展的重要原因之一［7-8］。然而，Tregs 調(diào)節(jié)Th1/Th2 反應(yīng)平衡在RA 的潛在機(jī)制尚不清楚。因此，本研究通過分析RA 患者臨床特點(diǎn)與外周血中GARP+Tregs 比例及相關(guān)分泌細(xì)胞因子含量關(guān)系，并檢測Th1、Th2 和Th17 細(xì)胞反應(yīng)變化研究GARP 活化態(tài)Tregs 細(xì)胞對RA 的治療其作用機(jī)制，為RA 的臨床監(jiān)測和細(xì)胞治療提供新的思路。

1 對象與方法

1.1 研究對象選取2012年5月至2017年12月在內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)科就診的232 例RA患者，其中男70 例，女162 例，年齡17 ～76 歲，病程時(shí)長（8.4 ± 3.4）年。健康志愿者240 位，其中男72 例，女168 例，年齡17 ～63 歲。采集各組人的外周靜脈血5 mL 于EDTA 抗凝采血管中，隨機(jī)選取各15 ～20 位試驗(yàn)者進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附法檢測實(shí)驗(yàn)。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)納入指標(biāo)包括：符合美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)（American college of rheumatology，ACR）1987 類風(fēng)濕病分類標(biāo)準(zhǔn)的RA 患者［9］。細(xì)則如下：關(guān)節(jié)及關(guān)節(jié)周圍的晨僵至少1 h（≥6 周）；≥3 個(gè)以上關(guān)節(jié)區(qū)的關(guān)節(jié)腫（≥6 周）；腕關(guān)節(jié)、掌指關(guān)節(jié)或者近端指間關(guān)節(jié)至少有一個(gè)關(guān)節(jié)區(qū)關(guān)節(jié)腫（≥6 周）；類風(fēng)濕結(jié)節(jié)伸肌表面或近關(guān)節(jié)區(qū)域的皮下結(jié)節(jié)；類風(fēng)濕因子陽性；手X 線像改變后前位手、腕關(guān)節(jié)X 線顯示骨侵襲或明確骨質(zhì)脫鈣的典型的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎改變。排除標(biāo)準(zhǔn)：糖尿病、急性感染、內(nèi)分泌失調(diào)、肺氣腫和孕婦。同時(shí)征集健康志愿者，征集標(biāo)準(zhǔn)為無自身免疫性疾病背景，并與研究組配對。

1.3 觀察指標(biāo)所有RA 患者記錄并評價(jià)以下指標(biāo)：疾病持續(xù)時(shí)間、壓痛關(guān)節(jié)Ritchie 指數(shù)（Ritchie articular index）、簡化疾病活動(dòng)指數(shù)（simple disease activity index，SDAI）、健康評估問卷（health assessment questionnaire，HAQ）、類風(fēng)濕因子（rheumatoid factor，RF）和抗環(huán)狀瓜氨酸（anti-cyclic peptide containing citrulline，anti-CCP）抗體，以及紅細(xì)胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）和C 反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)抽取各組人外周靜脈血3 mL，2 000 r/min 室溫離心10 min 以分離血漿，保存至-80 ℃。下層液體加入等體積PBS 混勻后，分別緩慢加入至含有等體積人單核淋巴細(xì)胞分離液的上層，2 000 r/min室溫離心10 min，小心吸取中間層外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）至2 mL Ep管中，加入PBS 1 mL。調(diào)整PBMC細(xì)胞密度至1×106/mL，分為4 管，常規(guī)固定和破膜后，分別加入1 μL CD4-FITC，CD25-APC，GARP-PE和各1 μL CD4+CD25+GARP 抗體，混勻后室溫孵育1 h，離心并洗滌后進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析GARP+Tregs 比例。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附法檢測人外周血中TGF-β1、IFN-γ和IL-4含量取-80 ℃保存的血漿，依照試劑盒操作，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法檢測100 μL 血漿的TGF-β 1、IFN-γ和IL-4 含量，實(shí)驗(yàn)步驟具體參照說明書，Th1/Th2 反應(yīng)平衡以Th1/Th2 指數(shù)（Th1/Th2 index）表示，計(jì)算公式為：Th1/Th2 指數(shù)= IFN-γ（pg/mL）/IL-4（pg/mL）。

1.6 qPCR檢測人外周血中PBMC的FoxP3 mRNA含量取-80 ℃保存的人PBMC 細(xì)胞，Trizol 一步法提取總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨即采用10 ng cDNA 為模板，SYBGreen I 型染料法檢測FoxP3 mRNA含量，qPCR 程序?yàn)椋?0 ℃10 s，95 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃變性30 s，退火60 ℃10 s，擴(kuò)增共35 個(gè)循環(huán)。以GAPDH 為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算mRNA 的相對表達(dá)量。PCR 引物序列為：人-FOXP3 FP：GTGGCCCGGATGTGAGAAG，人-FOXP 3 RP：GGAGCCCTTGTCGGATGATG，擴(kuò)增產(chǎn)物大小238 bp；人-GAPDH FP：AGCCACATCGCTCAGACAC；人-GAPDH RP：GCCCAATACGACCAAATCC，擴(kuò)增產(chǎn)物大小66 bp。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有計(jì)量數(shù)據(jù)均以±s 描述，組間比較采用t 檢驗(yàn)，采用Pearson 相關(guān)分析法進(jìn)行相關(guān)性檢驗(yàn)，P ＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用GraphPad Prism 7.0 軟件實(shí)現(xiàn)。

2 結(jié)果

2.1 RA 患者臨床特征分析RA 患者的臨床特征見表1，實(shí)驗(yàn)所采集健康志愿者和RA 患者的平均年齡、吸煙人群數(shù)量（比例）、性別數(shù)量（比例）和血紅蛋白以及血小板含量沒有明顯的不同。血清抗-CCP 和RF 含量以及CRP 和ESR 是評價(jià)RA 關(guān)節(jié)受累程度的主要指標(biāo)［10］。結(jié)果如圖1 所示，RA組抗CCP、RF、CRP 含量和ESR 顯著高于健康志愿者（P ＜0.05），說明本實(shí)驗(yàn)所采集RA 患者標(biāo)本合格。

2.2 RA患者外周血GARP+Tregs比例變化結(jié)果如圖1 所示，RA 組外周血中GARP+Tregs 比例［（1.91±0.70）%vs.（4.2±1.31）%，P ＜0.05］，PBMC的FoxP3 mRNA 表達(dá)水平［（1.0 ± 0.2）vs.（0.43 ±0.12），P ＜0.05］和血漿TGF-β1 含量［（13.5 ± 2.1）mg/mL vs.（6.8±2.5）mg/mL，P ＜0.05］顯著低于健康志愿者。

2.3 RA 患者Th1/Th2 極化和Th17 反應(yīng)分析Th1 和Th2 細(xì)胞反應(yīng)是Tregs 細(xì)胞對機(jī)體最直接的調(diào)控反應(yīng)，Th17 細(xì)胞與Tregs 細(xì)胞反應(yīng)平衡影響炎癥發(fā)生發(fā)展。其分別通過IFN-γ、IL-4 和IL-17A三類細(xì)胞因子參與機(jī)體調(diào)節(jié)［3］。結(jié)果如圖2 所示，RA 組外周血中IL-4 水平顯著低于健康志愿者［（15.4 ± 8.1）pg/mL vs.（36.5 ± 11.3）pg/mL，P ＜0.05］，IFN-γ和IL-17A 含量顯著高于健康志愿者［（160.2 ± 22.8）pg/mL vs.（115.5 ± 25.6）pg/mL，（51.0 ± 2.5）pg/mL vs.（6.0 ± 2.1）pg/mL，P ＜0.05］，RA 患者Th1/Th2 指數(shù)顯著高于健康志愿者。見圖2。

表1 RA 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和對照組臨床特征Tab.1 Clinical characteristics of patients with Rheumatoid arthritis and control ±s

注：CCP，環(huán)狀瓜氨酸；RF，類風(fēng)濕因子；ESR，紅細(xì)胞沉降率；CRP，C 反應(yīng)蛋白；SDAI，簡化疾病活動(dòng)指數(shù)；HAQ，健康評估問卷

總數(shù)（例）年齡（年）男/女（例）吸煙人群［例（%）］病程（年）臨床分期（例）ⅠⅡⅢⅣanti-CCP（RU/mL）anti-CCP陽性［例（%）］RF（IU/mL）RF陽性［例（%）］Ritchie關(guān)節(jié)指數(shù)ESR（mm/h）CRP（mg/L）血紅蛋白（g/dL）血小板（×109/L）SDAI HAQ類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎232 48.2±25.5 70/162 53（22.8）8.4±3.4 14 73 106 39 121.84±38.49 165（71.1）142.39±43.48 185（79.7）4.57±1.38 23.16±2.84 59.32±13.15 12.43±1.83 384.32±97.41 34.29±9.84 2.14±0.82健康志愿者240 43.8±18.5 72/168 65（27.1）n/a n/a n/a n/a n/a 2.36±0.83 0（0）12.93±3.38 0（0）n/a 9.32±1.07 3.44±0.96 12.95±1.71 324.94±101.81 n/a n/a P值n/a 0.173 n/a 0.539 n/a n/a n/a n/a n/a 0.001 n/a 0.001 n/a n/a 0.001 0.001 0.891 0.328 n/a n/a

圖1 RA 患者外周血GARP+Tregs 比例及TGF-β1 含量分析Fig.1 Analysis of the ratio of GARP+Tregs and TGF-β1 in peripheral blood of patients with RA

2.4 RA 患者CRP 水平和ESR 與外周血GARP+Tregs 比例變化相關(guān)性分析對隨機(jī)選取的15 ～20 位RA 患者的CRP 水平和ESR 變化與外周血GARP+Tregs 比例和Th1/Th2 指數(shù)變化經(jīng)行Pearson相關(guān)性分析。結(jié)果如圖3，RA 患者的CRP 水平和ESR 與外周血GARP+Tregs 比例變化具有明顯相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為r = -0.724 6（P = 0.003 4）和-0.665 3（P = 0.009 4）；與Th1/Th2 指數(shù)變化具有明顯正相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為r = 0.661 5（P =0.010 0）和0.608 9（P=0.020 8）。

圖2 RA 患者外周血Th1/Th2 極化和Th17 反應(yīng)變化Fig.2 Changes in Th1/Th2 polarization and Th17 response in peripheral blood of patients with RA

圖3 RA 患者CRP 水平和ESR 與外周血GARP+Tregs 比例和Th1/Th2 指相關(guān)性分析Fig.3 Correlation analysis of CRP levels and ratio of ESR to peripheral blood GARP+Tregs and Th1/Th2 index in RA patients

3 討論

RA 是在關(guān)節(jié)中高表達(dá)的炎性細(xì)胞因子促進(jìn)炎性細(xì)胞向關(guān)節(jié)浸潤，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)組織損傷和骨破壞的自身免疫性疾?。?2］。研究發(fā)現(xiàn)［13］，RA 的發(fā)病可能與免疫反應(yīng)失衡等有關(guān)。目前對于RA治療以抗炎藥物和糖皮質(zhì)激素類藥物為主，然而并未取得滿意的效果［14］。與此同時(shí)，以英夫利昔單抗（Infliximab）也稱TNF-α嵌合性單克隆抗體和抗CD20 單抗-利妥昔單抗（Rituximab）的免疫生物制劑在RA 治療中雖然取得不錯(cuò)的效果，然而機(jī)制不明，時(shí)有不良反應(yīng)與無效應(yīng)答發(fā)生［15］。因此，明確RA的免疫發(fā)病機(jī)制與調(diào)控靶點(diǎn)迫在眉睫。

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是一類具有免疫抑制功能的T細(xì)胞，其與Th17 反應(yīng)平衡以及參與調(diào)節(jié)的Th1/Th2 反應(yīng)平衡調(diào)節(jié)在機(jī)體維持免疫穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的作用［16］。最新研究［5］發(fā)現(xiàn)，Tregs特異性表達(dá)一個(gè)跨膜性蛋白GARP。具有潛在的TGFβ結(jié)合能力，且GARP是Tregs作為免疫系統(tǒng)特異性TGFβ載體的關(guān)鍵分子調(diào)控T 細(xì)胞應(yīng)答。在本研究中，筆者通過分析發(fā)現(xiàn)RA患者外周血中GARP+Tregs細(xì)胞比例明顯低于健康人群，說明在RA患者中GARP+Tregs介導(dǎo)的免疫穩(wěn)態(tài)平衡失衡。于此同時(shí)，通過分析其與CRP 和ESR 變化的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，RA 患者GARP+Tregs變化與CRP 和ESR 呈明顯負(fù)相關(guān)性。提示：GARP+Tregs比例可能作為RA患者在臨床免疫診斷的新標(biāo)準(zhǔn)。這和眾多文獻(xiàn)報(bào)道Tregs 與多種炎性疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)聯(lián)結(jié)果一致［16］。其次，筆者發(fā)現(xiàn)RA 患者外周血中TGF-β1顯著增加，Th1細(xì)胞反應(yīng)因子IFNγ增加和Th2 細(xì)胞反應(yīng)因子IL-4 降低，說明GARP+Tregs具有與CD4+CD25+FoxP3+Tregs調(diào)控炎癥反應(yīng)中Th1/Th2 細(xì)胞反應(yīng)向Th2 反應(yīng)發(fā)展相同的作用［16］。同時(shí)，Th17炎性反應(yīng)增強(qiáng)，說明RA患者的炎癥反應(yīng)存在Tregs/Th17 細(xì)胞反應(yīng)平衡向Th17 反應(yīng)發(fā)展的變化［15］。

綜上所述，GARP+Tregs 比例變化與RA 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可能通過調(diào)控Th1/Th2 細(xì)胞反應(yīng)平衡向Th2 方向發(fā)展以及自身與Th17 反應(yīng)平衡，來影響RA 病變的進(jìn)程。