陳方元 賴志文 徐祖森

自貢市婦幼保健院1皮膚科，2生殖健康與不孕科（四川自貢643000）；3華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院（武漢430030）

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是一種常見的內(nèi)分泌和代謝性疾病，痤瘡、黑棘皮等皮損癥狀在PCOS 患者中有較高的發(fā)病率［1］。腸道微生物泛指人體腸道內(nèi)寄生的微生物總和，在促進(jìn)宿主腸道發(fā)育、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和營養(yǎng)物質(zhì)獲取等方面發(fā)揮了關(guān)鍵的作用［2］。然而，腸道菌群紊亂可增加腸壁通透性，導(dǎo)致腸源性細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物進(jìn)入血液循環(huán)從而誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)［3］。持續(xù)性低度炎癥效應(yīng)鈍化胰島素受體敏感性，使宿主表現(xiàn)肥胖、胰島素抵抗和代償性高胰島素血癥，進(jìn)而增加卵巢中睪酮的合成與釋放［4］。近年來，腸道菌群紊亂與PCOS 的相關(guān)性得到了廣泛的關(guān)注。LIU 等［5］發(fā)現(xiàn)PCOS 患者腸道內(nèi)Bacteroides、Escherichia/Shigella、Streptococcus 和Akkermansia 等類群發(fā)生顯著變化，且與患者臨床特征相關(guān)。而INSENSER 等［6］發(fā)現(xiàn)PCOS 患者腸道菌群多樣性降低，Catenibacterium 和Kandleria genera 菌群豐度異常升高。

痤瘡皮損是一種常見于PCOS 患者的損容性皮膚病，以局部皮膚粉刺、丘疹、囊腫和結(jié)節(jié)樣皮損為主要特征，好發(fā)于患者臉頸部以及胸背部，對(duì)患者的外在形象造成了嚴(yán)重的影響［7-8］。目前，痤瘡的發(fā)生機(jī)制仍未完全明確。臨床研究［9］表明，飲食因素對(duì)痤瘡的發(fā)生發(fā)展有重要的影響，暗示腸道菌群可能對(duì)痤瘡皮損有極為重要的意義。王萃等［10］發(fā)現(xiàn)痤瘡患者乳桿菌和雙歧桿菌數(shù)量顯著降低。門月華等［11］對(duì)重度痤瘡患者腸道菌群進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)僅Blautia producta 和Coprococcus eutactus 發(fā)生了顯著的變化結(jié)果。雖然痤瘡和PCOS 相關(guān)的腸道菌群特征都已有報(bào)道，但痤瘡型PCOS 患者腸道菌群結(jié)構(gòu)特征還有待進(jìn)一步探究。

鑒于腸道菌群在疾病干預(yù)和防治中的重要作用，分析痤瘡型PCOS 患者的腸道菌群組成對(duì)于以腸道菌群為靶點(diǎn)的藥物設(shè)計(jì)和生活干預(yù)等方式改善PCOS 患者皮損有重要的指導(dǎo)意義?；诖?，本研究以第二代測序技術(shù)比較了PCOS 患者與健康女性之間、NA-PCOS 與MSA-PCOS 患者之間腸道細(xì)菌組成差異，并對(duì)豐度差異顯著的菌群與患者胰島素抵抗、炎癥、血脂代謝、性激素水平之間的相關(guān)性進(jìn)行了分析，為后續(xù)以調(diào)理腸道菌群改善PCOS 患者痤瘡皮損的研究提供了一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑全自動(dòng)生化分析儀（AU5800）購自美國Beckman 公司，彩色超聲診斷儀（HDI-4000）購自荷蘭Philips 公司，超微量分光光度計(jì)（ND2000）購自美國Thermo Scientific 公司，Miseq測序儀（PE300）購自美國Illumina，PCR 儀（Gene-Amp-9700）購自美國ABI，糞便微生物基因組抽提試劑盒購自德國Qiagen 公司，F(xiàn)astPfu PCR 擴(kuò)增試劑盒購自北京全式金生物，C-反應(yīng)蛋白（CRP）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）檢測試劑盒購自北京索萊寶生物。

1.2 研究對(duì)象PCOS 患者為2018年1-7月期間因月經(jīng)周期異?；虿辉邪Y就診于自貢市婦幼保健院的漢族女性。對(duì)照組由年齡匹配且排卵功能正常的健康漢族女性組成。受試者及其家屬對(duì)本次研究目的知情同意。PCOS 診斷參考2012年頒布的《多囊卵巢綜合征診斷中華人民共和國行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》執(zhí)行，滿足排卵功能異常和卵巢多囊樣病變即為疑似PCOS 患者［12］。排除遲發(fā)型腎上腺皮質(zhì)增生、柯興綜合征、甲狀腺功能異常、腎上腺雄激素分泌瘤及卵巢早衰等疾病的疑似患者。近3 個(gè)月內(nèi)服用過激素類藥物的PCOS 確診患者也不被納入到本次研究中［5］。

采用GAGS 系統(tǒng)對(duì)受試者痤瘡程度進(jìn)行評(píng)分［13］。發(fā)生區(qū)域因素評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：前額、右頰部和左頰部因素分值=2 分；鼻部和下頦區(qū)因素分值=1分；前胸及后背因素分值=3分；皮損程度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無皮損（0分）；≥1個(gè)粉刺（1分）；≥1個(gè)丘疹（2分）；≥1 個(gè)膿皰（3 分）；≥1 個(gè)結(jié)節(jié)（4 分）。區(qū)域分值=因素分值×皮損分值，綜合分值為各區(qū)域分值之和。結(jié)合中國人群體質(zhì)特征，根據(jù)綜合分值將PCOS 患者劃為無痤瘡型PCOS（NA-PCOS，0 分）、輕度痤瘡型PCOS（Mild Acne-PCOS，MA-PCOS，1～18 分）和中重度痤瘡型PCOS（Medium-to-severe acne-PCOS，MSA-PCOS，≥19 分）。

1.3 臨床數(shù)據(jù)采集月經(jīng)期第3 天清晨采集受試者空腹外周血，收集上層清液保存于-80 ℃?zhèn)溆谩Ｂ雅荽碳に兀‵SH）、黃體生成素（LH）、睪酮（T）、雌激素（E2）、空腹血糖（FPG）、空腹胰島素（FINs）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDLC）采用全自動(dòng)生化分析儀測定。炎癥因子IL-6、TNF-α、CRP 采用試劑盒檢測。體質(zhì)量指數(shù)（BMI）=體質(zhì)量（kg）/身高（m2），18 kg/m2≤BMI ≤24.9 kg/m2為正常體質(zhì)量指數(shù)，BMI ≥25 kg/m2為全身性肥胖；腰臀比（WHR）=腰圍（cm）/臀圍（cm），WHR ≥0.85 為向心性肥胖［5］。穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）=FINs×FPGs/22.5，HOMA-IR ≥2.5 為胰島素抵抗［14］。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法臨床數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)處理和分析采用SPSS 17.0 軟件包進(jìn)行。Kolmogorov-Smirnov 檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的正態(tài)分布性，正態(tài)分布數(shù)據(jù)的組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)和單因素方差分析（Student-Newman-Keuls 檢驗(yàn)）；非正態(tài)分布數(shù)據(jù)的組間比較采用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)和Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn)。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5 DNA 抽提、PCR 擴(kuò)增、高通量測序新鮮糞便樣品（約200 mg）中細(xì)菌基因組DNA 參照試劑盒步驟抽提，調(diào)節(jié)DNA 濃度至10 ng/μL。細(xì)菌16S rDNA V3-V4 片段擴(kuò)增采用通用引物338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGA CTACHVGGGTWTCTAAT-3′），產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠電泳分離后回收。高通量測序工作由上海美吉生物完成。

1.6 生物信息學(xué)分析生物信息學(xué)分析基于線上平臺(tái)I-sanger 完成（www.i-sanger.com，上海美吉生物醫(yī)藥）。經(jīng)序列篩選、拼接及嵌合體序列去除后，將相似度97%以上的序列歸入同一個(gè)操作分類單元（OTU）。利用RDP 分類器對(duì)每個(gè)OTU 中的代表性序列進(jìn)行物種分類注釋，在閾值為70%的情況下比對(duì)Silva SSU123 數(shù)據(jù)庫。生成的OTU 表格按照最少樣本序列數(shù)隨機(jī)抽平。Mother 軟件計(jì)算檢出OTU 數(shù)和Shannon 指數(shù)用以表示菌群的Alpha指數(shù)?；诩訖?quán)UniFrac 距離的層級(jí)聚類和主坐標(biāo)分析（PCoA）進(jìn)行樣本比較分析（Beta 多樣性）。菌群豐度的組間比較采用非參數(shù)Mann-Whitney U和Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)，并以Benjamini-Hochberg算法校正。Spearman 法分析PCOS 患者腸道菌群和臨床參數(shù)間的相關(guān)性，并繪制相關(guān)性熱圖。

2 結(jié)果

2.1 受試者情況概述根據(jù)GAGS評(píng)分系統(tǒng)，20例PCOS 患者被分為非痤瘡組（NA-PCOS，n = 10）和中重度痤瘡組（MSA-PCOS，n = 10）。3 組參與者年齡、BMI 和WHR 指數(shù)方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。NA-PCOS 和MSA-PCOS 患者T、LH/FSH、TC、TG、LDL-C 水平均顯著升高而HDL-C 水平降低（P ＜0.05），NA-PCOS 和MSA-PCOS 組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。MSA-PCOS 組FINs 和HOMA-IR 指數(shù)顯著高于HC 組和NA-PCOS 組，而NA-PCOS 患者與健康女性之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。炎癥因子方面，NA-PCOS 和MSA-PCOS 患者CRP、IL-6、TNF-α水平顯著升高，且MSA-PCOS 組明顯高于NA-PCOS 組。

2.2 組間腸道菌群差異分析從上述的30 例樣本中共獲得633 360 條高質(zhì)量的序列，以97%的序列相似性聚類得到330 個(gè)OTUs。Alpha 多樣性分析表明，NA-PCOS 和MSA-PCOS 組Sobs 指數(shù)（圖1A）和Shannon 指數(shù)（圖1B）均低于HC 組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。而MSA-PCOS 組的Sobs 指數(shù)（圖1A）和Shannon 指數(shù)（圖1B）均低于NA-PCOS 組（P ＜0.05）。此外，本文基于加權(quán)Uni-Frac 距離的層級(jí)聚類（圖1C）和PCoA 分析（圖1D）表征個(gè)體腸道菌群組成的差異。HC 個(gè)體腸道菌群與PCOS 患者無交叉現(xiàn)象（圖1C），但組內(nèi)樣本之間距離較遠(yuǎn)（圖1D），表明健康個(gè)體腸道菌群組成也存在一定的差異性。NA-PCOS 與MSA-PCOS 樣本之間雖存在一定程度的交叉（圖1C），但總體組內(nèi)樣本的相似性仍高于組間樣本比較（圖1D）。

與HC 組相比，NA-PCOS 組患者腸道菌群組成在門水平上無特征性改變（P ＞0.05），而MSA-PCOS組Firmicutes 豐度顯著升高（P ＜0.05）（圖2A、B）。在屬水平上（圖2C、D），Prevotella 在大多數(shù)的健康女性腸道內(nèi)具有較高的相對(duì)豐度（7/10），而在PCOS 患者腸道內(nèi)均未能檢出（0/20）。但NA-PCOS和MSA-PCOS患者腸道中Bacteroides的相對(duì)豐度均顯著高于HC 組（P ＜0.001），且MSA-PCOS 組高于NA-PCOS 組（P ＜0.001）。Faecalibacteruim 在PCOS患者中腸道菌群中的相對(duì)豐度降低，MSA-PCOS 患者與健康女性相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。

表1 受試者臨床參數(shù)特征Tab.1 Clinical parameters of subjects ±s

表1 受試者臨床參數(shù)特征Tab.1 Clinical parameters of subjects ±s

注：HC 組和NA pcos 組比，aP ＜0.05；HC 組與MSA-PCOS 組相比，bP＜0.05；NA-PCOS 組與MSA-PCOS 組比，cP ＜0.05

臨床參數(shù)年齡（歲）BMI（kg/m2）WHR T（nmol/L）FSH（IU/L）LH（IU/L）LH/FSH E2（pmol/L）CRP（mg/L）IL6（ng/L）TNF-α（ng/L）FPG（mmol/L）FINs（μIU/mL）HOMA-IR TG（mmol/L）TC（mmol/L）HDL-C（mmol/L）LDL-C（mmol/L）GAGS HC（n=10）26.6±3.80 22.35±1.92 0.74±0.06 0.66±0.29a，b 6.43±0.91b 3.27±0.49b 0.52±0.11b 245.89±87.4a 2.14±0.27a，b 2.36±0.50b 15.01±2.16a，b 5.20±0.34 6.65±2.46b 1.53±0.54b 0.79±0.21a，b 3.89±0.45b 2.16±0.37b 1.61±0.74a，b-PCOS（n=20）NA-PCOS（n=10）24.8±5.57 22.37±4.07 0.76±0.02 1.22±0.59a，c 5.92±0.94 6.80±4.09c 1.13±0.62c 150.15±73.78a 3.10±0.38a，c 2.56±0.62c 19.66±3.28a，c 4.87±0.50 7.78±2.03c 1.679±0.46c 1.61±0.52a，c 1.25±1.25 2.04±0.37c 2.40±0.39a，c-MSA-PCOS（n=10）23.8±3.49 25.92±3.27 0.82±0.07 2.88±0.55b，c 5.14±0.85b 13.34±5.67b，c 2.59±0.93b，c 180.04±83.27 5.03±1.06b，c 5.05±1.46b，c 24.25±3.72b，c 5.12±0.60 19.63±5.91b，c 4.45±1.39b，c 2.33±0.40b，c 4.93±0.57b 1.17±0.29b，c 2.91±0.39b，c 21.2±2.66

2.3 PCOS 患者臨床參數(shù)與腸道菌群相關(guān)性分析進(jìn)一步地，本文對(duì)PCOS 患者腸道菌群與臨床參數(shù)的相關(guān)性進(jìn)行了Spearman 分析。結(jié)果如圖3所示，Bacteroides 分別與HOMA-IR、T、LH/FSH、CRP、IL-6、TNF-α、LH 和TG、TC 呈正相關(guān)，但與E2負(fù)相關(guān)（P ＜0.05）。Faecalibacterium 與HOMA-IR、T、CRP、IL-6、TNF-α 和TG、TC 呈負(fù)相關(guān)（P ＜0.05）。

3 討論

圖1 腸道菌群多樣性分析Fig.1 Alpha and beta diversity analysis of the gut microbiota

圖2 受試者腸道菌群組成分析Fig.2 Composition of the gut microbial community in participants

圖3 主要腸道微生物與PCOS 臨床參數(shù)相關(guān)性Fig.3 Spearman correlation between PCOS-associated parameters and the main genera of gut microbial community

本研究首先對(duì)PCOS 患者腸道菌群組成進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，PCOS 患者腸道菌群多樣性降低（P ＜0.05）。其中，Prevotella 相對(duì)豐度在PCOS患者糞便中顯著減少，且?guī)缀鯔z測不到。另一方面，本研究還發(fā)現(xiàn)Bacteroides 的相對(duì)豐度在PCOS患者中顯著升高（P ＜0.001），成為優(yōu)勢菌群。在此前的研究中，多篇文獻(xiàn)對(duì)PCOS 患者腸道菌群進(jìn)行了分析，但均為得到一致的結(jié)論。LIU 等［5］分析了中國PCOS 人群腸道菌群發(fā)現(xiàn)PCOS 患者腸道菌群多樣性降低，Bacteroides、Escherichia/Shigella、Streptococcus 和Akkermansia 等類群發(fā)生顯著變化；INSENSER 等［6］發(fā)現(xiàn)西班牙PCOS 患者腸道菌群多樣性降低，Catenibacterium 和Kandleria genera菌群豐度異常升高；而LINDHEIM 等［15］對(duì)澳大利亞PCOS 女性的腸道菌群進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)相對(duì)豐度大于1%的類群與健康女性相比無顯著差異。引起上述研究結(jié)果差異的原因可能在于：（1）受試人群的篩選，如本文參考的是衛(wèi)生部2012年頒布的《多囊卵巢綜合征診斷中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》，而Insenser 和Lindheim 等參考的則是2003年制定的鹿特丹準(zhǔn)則；（2）受試者種族因素的影響：LIU 等［5］的研究也發(fā)現(xiàn)Bacteroides 在中國PCOS 人群腸道中相對(duì)豐度會(huì)升高；（3）受試者地理環(huán)境、生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的影響。

痤瘡皮損嚴(yán)重?fù)p害了患者的外在形象，是PCOS 患者最為關(guān)注的問題之一。本文對(duì)MSAPCOS 與NA-PCOS 患者腸道菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MSA-PCOS 患者腸道菌群多樣性進(jìn)一步降低，但Bacteroides 的相對(duì)豐度進(jìn)一步升高至70%，顯著高于NA-PCOS 患者（P ＜0.01）。這表明，痤瘡型PCOS 患者腸道菌群紊亂比非痤瘡PCOS 患者更為顯著。此前的研究［16-18］發(fā)現(xiàn)，腸道內(nèi)Bacteroides 相對(duì)豐度升高可能通過介導(dǎo)炎癥效應(yīng)參與胰島素抵抗、肥胖等疾病的發(fā)生發(fā)展。本研究表明，Bacteroides 豐度的異常升高與PCOS 患者胰島素抵抗、炎癥、血脂異常水平存在著密切的相關(guān)性，這暗示著可以將調(diào)節(jié)Bacteroides 豐度作為治療和緩解PCOS 癥狀的潛在靶點(diǎn)。

當(dāng)然，本研究也存在一定的局限性和需要改進(jìn)之處。首先，本研究未對(duì)痤瘡患者（非PCOS）的腸道菌群進(jìn)行分析。王萃和門月華等［10-11］的研究均發(fā)現(xiàn)痤瘡患者腸道菌群發(fā)生顯著的改變。因此，后續(xù)研究中比較痤瘡患者與痤瘡型PCOS 患者的腸道菌群的變化趨勢是否一致；其次，本研究僅分析了MSA-PCOS的腸道菌群結(jié)構(gòu)，而MA-PCOS 患者的腸道菌群組成還有待進(jìn)一步探究；此外，本研究納入的受試者主要考察是否符合PCOS 的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，而未排除PCOS 患者中的肥胖個(gè)體。雖然相關(guān)性分析表明，在PCOS 受試者中，BMI 和WHR與主要腸道類群無顯著相關(guān)性，但肥胖是否介導(dǎo)PCOS 患者腸道菌群和痤瘡之間的影響仍需要進(jìn)一步探究。在后續(xù)研究中，本研究將對(duì)輕度和重度痤瘡型PCOS 患者的腸道菌群進(jìn)行分析，并排除肥胖（包括全身性肥胖和向心性肥胖）、胰島素抵抗等疾病對(duì)腸道菌群和痤瘡之間相關(guān)性的干擾。

總體而言，本文分析了腸道菌群失調(diào)與PCOS患者（特別是痤瘡型PCOS 患者）胰島素抵抗、高雄激素血癥、炎癥、血脂異常等水平的相關(guān)性。鑒于胰島素抵抗、雄激素和炎癥在PCOS 和痤瘡發(fā)生發(fā)展中的重要角色，筆者推測腸道菌群紊亂（特別是Bacteroides 異常增多）可以引起慢性系統(tǒng)性炎癥、胰島抵抗和高雄激素血癥，進(jìn)而加重PCOS 患者的痤瘡程度。在后續(xù)的研究中，筆者將通過分析患者腸道菌群功能特征、調(diào)節(jié)患者菌群結(jié)構(gòu)以及模式動(dòng)物研究等方法對(duì)這一猜想進(jìn)行驗(yàn)證。