李雙梅 柯衛(wèi)東 彭 靜 黃新芳 李明華

（武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，湖北武漢 430345）

菱（Trapa spp.）為菱科菱屬一年生水生草本植物，在歐亞及非洲熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)均有分布，北美地區(qū)和澳大利亞亦有引種栽培（中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì)，1992）。我國(guó)是菱的原產(chǎn)地之一（葉靜淵，2001），長(zhǎng)江流域及其以南各地均有栽培，歷史悠久。

目前，國(guó)內(nèi)學(xué)者在菱的分類學(xué)、形態(tài)學(xué)與解剖學(xué)、細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)、生理生化、營(yíng)養(yǎng)成分、醫(yī)藥保健、組織培養(yǎng)、栽培技術(shù)及加工等方面做了大量工作（顏素珠，1983；周家琪 等，1983；丁炳揚(yáng) 等，1991，1996a；史美棠，1994；嚴(yán)素珍和徐祥生，1994；蔡健，1997；李大輝 等，1999；保曙琳 等，2004；盛占武 等，2006）。而有關(guān)菱屬植物傳粉生物學(xué)方面的研究較少，宋秀珍等（1981）、Kadono 和Schneider（1986）、丁炳揚(yáng)等（1996b）對(duì)菱的繁育系統(tǒng)、傳粉生物學(xué)等進(jìn)行了初步研究，認(rèn)為菱以自花授粉為主，存在一定程度的異花授粉和較低程度的無(wú)融合生殖。但是，由于菱去雄時(shí)間較難掌握，故菱的無(wú)融合生殖現(xiàn)象還有待于進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)對(duì)菱的繁育系統(tǒng)、傳粉生物學(xué)進(jìn)行了較為詳細(xì)、深入的研究，以期為菱的雜交育種、種質(zhì)創(chuàng)新提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

參試的6 個(gè)菱品種根據(jù)顏素珠（1983）的分類方法進(jìn)行分類（表1），2014 年5～10 月在國(guó)家種質(zhì)武漢水生蔬菜資源圃內(nèi)進(jìn)行觀測(cè)和取樣。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花器形態(tài)特征觀察 在盛花期，隨機(jī)摘取孝感紅菱的花30 朵，解剖觀察花器結(jié)構(gòu)，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量花冠直徑、花瓣長(zhǎng)度及寬度、萼片長(zhǎng)度及寬度、雄蕊長(zhǎng)度、花藥長(zhǎng)度、花絲長(zhǎng)度、雌蕊長(zhǎng)度、花柄長(zhǎng)度及直徑等。

表1 參試菱品種類型及來(lái)源

1.2.2 群體花期及單花開(kāi)花動(dòng)態(tài)觀察 分別觀察6個(gè)菱品種第1 朵花和最后1 朵花的開(kāi)花時(shí)間，每個(gè)品種的觀察面積均為6 m2，以確定群體花期。隨機(jī)選取孝感紅菱盛花期不同植株上剛出水的花蕾10朵，掛牌標(biāo)記，觀察并記錄單花開(kāi)花動(dòng)態(tài)。

1.2.3 不同類型菱開(kāi)花時(shí)間觀察 在盛花期，不定時(shí)觀察6 個(gè)菱品種的開(kāi)花情況，分別統(tǒng)計(jì)8 月10～12 日同一時(shí)段內(nèi)6 m2菱植株的總開(kāi)花數(shù)量。

1.2.4 柱頭可授性測(cè)定 在盛花期，選取萼片剛開(kāi)裂的孝感紅菱花（圖1），去雄套袋；取漢川紅菱經(jīng)套袋后剛散粉的新鮮花粉，裝入圓形帶蓋的鋁盒中備用。設(shè)4 個(gè)處理：a，去雄后立即授粉；b，去雄后0.5 h 授粉；c，去雄后2 h 授粉；d，去雄后4 h 授粉。授粉后再套袋，15 d 后調(diào)查各處理的結(jié)實(shí)情況并統(tǒng)計(jì)結(jié)實(shí)率。

1.2.5 花粉活力測(cè)定 8 月20 日，隨機(jī)選取孝感紅菱的花10 朵，插入30 mL 的試劑瓶（裝水）中，置于室內(nèi)25 ℃環(huán)境條件下，從散粉至衰?。?.5、1.0、1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、24.0 h）分別取花粉樣品測(cè)定花粉活力?；ǚ蹣悠分糜谳d玻片上，加1～2 滴10%蔗糖+0.005%硼酸的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液，放入墊有2 層濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，于（25±1） ℃條件下培養(yǎng)，3～4 h后統(tǒng)計(jì)花粉萌發(fā)率。

1.2.6 雜交指數(shù)（outcrossing index，OCI）估算 8月22 日，按照Dafni（1992）的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)6 m2孝感紅菱的花直徑及開(kāi)花行為進(jìn)行測(cè)定及繁育系統(tǒng)評(píng)判。具體方法：① 花朵或花序直徑≤1 mm 記為0；1 mm ＜花朵或花序直徑≤2 mm 記為1；2 mm ＜花朵或花序直徑≤6 mm 記為2；花朵或花序直徑＞6 mm 記為3。② 花藥開(kāi)裂時(shí)間與柱頭可授期之間的時(shí)間間隔，雌雄蕊同熟或雌蕊先熟記為0；雄蕊先熟記為1。③ 柱頭與花藥的空間位置，同一高度記為0；空間分離記為1。①、②、③之和為OCI值。評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：OCI=0 時(shí)，繁育系統(tǒng)為閉花受精；OCI=1 時(shí)，繁育系統(tǒng)為專性自交；OCI=2 時(shí)，繁育系統(tǒng)為兼性自交；OCI=3 時(shí)，繁育系統(tǒng)為自交親和，有時(shí)需要傳粉者；OCI=4 時(shí)，繁育系統(tǒng)為部分自交親和，異交，需要傳粉者。

1.2.7 傳粉形式觀察 選用孝感紅菱為試材，設(shè)4個(gè)處理：a，自然授粉；b，不去雄套袋；c，去雄套袋；d，去雄不套袋。每處理隨機(jī)選擇30 朵花，采用0.1 mm 厚的白色硫酸紙袋套袋，去雄套袋和去雄不套袋2 個(gè)處理的去雄時(shí)期為萼片剛開(kāi)裂時(shí)期（圖1、2），15 d 后調(diào)查各處理的結(jié)實(shí)情況并統(tǒng)計(jì)結(jié)實(shí)率。

圖1 孝感紅菱萼片剛開(kāi)裂的花

圖2 孝感紅菱去掉萼片和花瓣后雄蕊、雌蕊的狀況

2 結(jié)果與分析

2.1 花器形態(tài)特征

由圖3 可知，菱花兩性，單生于葉腋，輻射對(duì)稱，自下而上順序發(fā)生；花柄長(zhǎng)度1.40～3.40 cm，花柄直徑0.19～0.50 cm；花冠直徑1.10～1.60 cm，花瓣4 枚，白色，倒卵狀三角形，上部具1 個(gè)或多個(gè)波狀缺刻，長(zhǎng)度1.27～1.76 cm、寬度0.63～0.82 cm；萼片4 枚，長(zhǎng)度0.60～0.70 cm、寬度0.30～0.38 cm，外被淡黃色短毛；雄蕊4 枚，長(zhǎng)度0.68～0.90 cm，花藥長(zhǎng)度0.17～0.19 cm，花絲長(zhǎng)度0.62～0.78 cm，花藥的著生方式為背著藥，開(kāi)裂方式為縱裂；雌蕊1 枚，長(zhǎng)度0.44～0.55 cm，花柱細(xì)，柱頭近球形，黃色；子房半下位，2 心皮，2 室，每室具1 枚倒生胚珠，僅1 室胚珠發(fā)育成種子，另1 枚胚珠退化。

2.2 群體花期及單花開(kāi)花動(dòng)態(tài)

據(jù)觀察，菱群體花期在5～10 月，盛花期在7～ 8 月，具體因品種、氣候條件和栽培條件而異，開(kāi)花期全天均有花開(kāi)。從現(xiàn)蕾到開(kāi)花需5～6 d，單花花期15 h，出水開(kāi)放，花柄在花完全開(kāi)放之前不斷伸長(zhǎng)，雌雄同花，萼片剛開(kāi)裂時(shí)雌蕊柱頭即具有可授性。萼片開(kāi)裂后2 h 10 min，花瓣開(kāi)始松動(dòng)，此時(shí)剝開(kāi)同種狀態(tài)的其他花蕾，可見(jiàn)1 枚雄蕊與柱頭同高，并緊挨柱頭且柱頭上可見(jiàn)少量花粉粒；2 h 20 min，花瓣開(kāi)始逐漸打開(kāi)；2 h 30 min，2 枚雄蕊低于柱頭，2 枚雄蕊與柱頭持平，柱頭上可見(jiàn)少量花粉粒；3 h，4 枚雄蕊均與柱頭持平；4 h 10 min，4 枚雄蕊花藥均高出并緊抱柱頭，柱頭上可見(jiàn)大量黃色花粉粒；6 h 30 min，花粉散盡，花柄依然挺立；15 h，花柄倒入水中，完成整個(gè)開(kāi)花過(guò)程。以早晨8：00 開(kāi)花的花為例，菱單花開(kāi)花時(shí)間及動(dòng)態(tài) 見(jiàn)表2。

2.3 不同類型菱開(kāi)花時(shí)間

從表3 可以看出，6 個(gè)菱品種不分白天黑夜都可以開(kāi)花，但開(kāi)花的高峰期不同。栽培菱大部分在11：00～20：00 開(kāi)花，5：00～8：00 開(kāi)花較少或沒(méi)有花開(kāi)；野生菱大部分在5：00～14：00 開(kāi)花。栽培菱不同品種間開(kāi)花高峰期存在差異，漢川紅菱的開(kāi)花高峰期為11：00～14：00，孝感紅菱為 14：00～17：00， 而 汈 汊 湖 紅 菱 為17：00～ 20：00；野生菱不同品種間開(kāi)花高峰期亦存在差異，L 野菱-21 的開(kāi)花高峰期為11：00～14：00，東北菱角和巢湖菱均為8：00～11：00。

表2 菱單花開(kāi)花動(dòng)態(tài)

表3 不同類型菱開(kāi)花時(shí)間

2.4 柱頭可授性

從表4 可以看出，在萼片剛開(kāi)裂時(shí)去雄立即授粉，結(jié)實(shí)率最高，達(dá)52.0%；去雄0.5～2 h 后授粉，結(jié)實(shí)率仍達(dá)50%；但在去雄4 h 后授粉，結(jié)實(shí)率急劇下降，僅為19.8%。表明柱頭在萼片開(kāi)裂后2 h內(nèi)活力最強(qiáng)，可授性較高，4 h 后柱頭活力急劇下降，可授性變?nèi)酢?/p>

表4 不同授粉時(shí)間對(duì)菱結(jié)實(shí)率的影響

2.5 花粉活力

從表5 可以看出，菱的花粉活力在散粉初期（0.5～1.0 h）較強(qiáng)，保持在70%以上；之后明顯下降，1.5 h 就降低到50%以下；2.5 h 后降速趨緩，7.5 h僅為14.5%；放置24.0 h后為0，完全失去活力。

表5 菱花粉活力測(cè)定結(jié)果

2.6 雜交指數(shù)（OCI）

調(diào)查結(jié)果顯示，菱的花冠直徑超過(guò)6 mm，計(jì)為3；雌蕊先成熟，計(jì)為0；柱頭與花藥在同一高度，記為0。因此，菱的雜交指數(shù)為3，根據(jù)Dafni（1992）的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，菱的繁育系統(tǒng)為自交親和，有時(shí)需要傳粉者。

2.7 傳粉形式

從表6 可以看出，去雄套袋處理的結(jié)實(shí)率為21.1%，表明菱存在無(wú)融合生殖現(xiàn)象；去雄不套袋處理的結(jié)實(shí)率為25.0%，表明菱除存在無(wú)融合生殖外，還存在少量異花授粉；不去雄套袋處理的結(jié)實(shí)率為80.9%，在考慮無(wú)融合生殖（結(jié)實(shí)率21.1%）的前提下，菱自花授粉的結(jié)實(shí)率應(yīng)為59.8%；菱自然授粉條件下的結(jié)實(shí)率為85.7%，在考慮自花授粉和無(wú)融合生殖的前提下，說(shuō)明菱存在少量異花授粉，結(jié)實(shí)率大約為4.8%。綜合來(lái)看，菱以自花授粉為主，存在一定程度的無(wú)融合生殖和少量異花 授粉。

表6 不同傳粉形式對(duì)菱結(jié)實(shí)率的影響

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，菱以自花授粉為主，同時(shí)存在一定程度的無(wú)融合生殖和少量異花授粉現(xiàn)象，這與丁炳揚(yáng)等（1996b）對(duì)細(xì)果野菱、Kadono和Schneider（1986）對(duì)日本菱的觀察結(jié)果基本一致。但丁炳揚(yáng)等（1996b）認(rèn)為菱去雄時(shí)間較難掌握，加之菱屬植物存在花前期閉花授粉（Cook，1993），因此認(rèn)為菱是否存在無(wú)融合生殖現(xiàn)象還有待于進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)中，菱去雄時(shí)間嚴(yán)格控制在萼片剛開(kāi)裂時(shí)進(jìn)行，此時(shí)雄蕊花藥低于雌蕊柱頭且未開(kāi)裂，故萼片剛開(kāi)裂時(shí)不會(huì)發(fā)生前期閉花授粉。因此，本試驗(yàn)通過(guò)去雄套袋證實(shí)菱存在無(wú)融合生殖無(wú)疑。植物的無(wú)融合生殖包括單倍體無(wú)融合生殖、二倍體無(wú)融合生殖和不定胚等，單倍體無(wú)融合生殖只含有單倍體染色體組（N），其后代常常是不育的；二倍體無(wú)融合生殖因仍為二倍體，故其后代是可育的；不定胚是直接由珠心或珠被的二倍體細(xì)胞發(fā)育成胚，故其后代也是可育的。據(jù)筆者多年的觀察研究，發(fā)現(xiàn)成熟的菱后代是可育的，尚未發(fā)現(xiàn)成熟的菱后代有不育現(xiàn)象。因此，菱的無(wú)融合生殖不可能是單倍體無(wú)融合生殖。至于菱的無(wú)融合生殖是屬于二倍體無(wú)融合生殖還是不定胚，有待進(jìn)一步從細(xì)胞學(xué)和遺傳學(xué)的角度進(jìn)行深入研究。菱的這種生殖特性可能是在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，為適應(yīng)水生環(huán)境而形成的一種保護(hù)性繁衍后代策略。由于菱存在一定程度的無(wú)融合生殖，因此在開(kāi)展菱雜交育種時(shí)應(yīng)對(duì)后代的性狀進(jìn)行仔細(xì)甄別，判斷哪些后代是通過(guò)無(wú)融合生殖而來(lái)的，哪些后代是通過(guò)異花授粉而得到的。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，不同類型菱在一天中的開(kāi)花高峰期存在差異，栽培菱大部分集中在11：00～20：00 開(kāi)花，野生菱大部分集中在 5：00～14：00 開(kāi)花，且同一類型不同品種間也存在差異。因此，在對(duì)不同類型的菱品種進(jìn)行雜交時(shí)，應(yīng)根據(jù)其開(kāi)花高峰期選擇雜交時(shí)間，以保證獲得最大的成功。由于萼片剛開(kāi)裂時(shí)，花瓣仍被包裹在萼片之中，此時(shí)雌蕊柱頭可授性最強(qiáng)，雄蕊花藥低于柱頭且未開(kāi)裂散粉，故去雄雜交最好在萼片剛開(kāi)裂時(shí)進(jìn)行。

本試驗(yàn)在探討柱頭可授性時(shí)，因去雄2 h 之后授粉時(shí)間間隔過(guò)大，導(dǎo)致去雄2 h 后柱頭的可授性缺乏詳細(xì)的數(shù)據(jù)變化；去雄4 h 后授粉的結(jié)實(shí)率為19.8%，與檢測(cè)到的無(wú)融合生殖的結(jié)實(shí)率21.1%較為接近，存在4 h 后柱頭已失去可授性的可能。今后在研究菱的柱頭可授性時(shí)，應(yīng)對(duì)去雄后授粉時(shí)間間隔設(shè)置更為精細(xì)。

本試驗(yàn)依據(jù)Dafni（1992）的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)對(duì)菱的雜交指數(shù)進(jìn)行估算，認(rèn)為菱的繁育系統(tǒng)為自交親和，有時(shí)需要傳粉者，這與本試驗(yàn)所驗(yàn)證的菱傳粉形式及丁炳揚(yáng)等（1996b）對(duì)細(xì)果野菱、Kadono 和Schneider（1986）對(duì)日本菱的觀察結(jié)果一致，表明采用Dafni（1992）的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)對(duì)菱的雜交指數(shù)進(jìn)行估算來(lái)判定菱的繁育系統(tǒng)是可行的。