李宗俊 王先裕 劉夢姣 崔馨月 趙 雄 陳 鵬 歐青青

（廣西大學農(nóng)學院，廣西南寧530001）

廣西地區(qū)氣候潮濕、降雨量多、春秋季節(jié)常見陰雨天，在這種環(huán)境下番茄晚疫病（Tomato late blight）產(chǎn)生的致病疫霉（Phytophthora infestans）極易存活并侵染植株（鄭海武和李正英，2016）。番茄晚疫病是番茄上的常見病害，直接影響果實的產(chǎn)量與品質（路世竑，2018），每年減產(chǎn)10%～20%，嚴重時可以達到80%甚至絕產(chǎn)（陳宇飛 等，2000）。番茄晚疫病是由致病疫霉侵染所引起的一種真菌性病害，在廣西地區(qū)以A1 基因型為主要存在形式，優(yōu)勢生理小種為T1，2和T1，2，3，4，5（朱桂寧 等，2007）。目前晚疫病主要通過合理調整栽培制度、使用特定的化學抑菌劑、種植含有抗性基因的品種等方式進行防治（鄭海武和李正英，2016），使用高抗晚疫病的品種是防治番茄晚疫病最為經(jīng)濟有效的措施（李明遠，2017）。

番茄對晚疫病的抗性是典型的數(shù)量遺傳性狀，由Ph-1、Ph-2、Ph-3、Ph-4、Ph-5-1 和Ph-5-2等基因位點控制（胡明瑜 等，2018），對晚疫病的遺傳抗性已被證明可以減少晚疫病田間發(fā)病率，從而減少化學藥劑的使用（杜敏敏 等，2017）。在目前生產(chǎn)利用中，Ph-3 不僅抗多個生理小種并且在雜合狀態(tài)下也表現(xiàn)出較好的抗性，是較有優(yōu)勢的一個基因位點（張春芝，2014）。利用分子標記等方式輔助常規(guī)育種技術進行抗病材料的篩選可以節(jié)省大量時間、人工成本，更加有利于我國抗病番茄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展（杜敏敏 等，2017）。

本試驗通過將田間抗性鑒定與KASP（kompetitive allel-specif ic PCR）分子標記輔助選擇結合運用來高效篩選出田間表現(xiàn)為抗病且具有優(yōu)良經(jīng)濟性狀的番茄材料，從而為選育抗晚疫病的番茄優(yōu)良新品種奠定一定基礎。

1 材料與方法

2018 年9 月初在廣西壯族自治區(qū)武鳴定標水庫旁番茄試驗基地進行大田試驗，10 月在廣西大學農(nóng)學院園藝植物分子生物實驗室進行室內(nèi)試驗。

1.1 試驗材料

參試的16 份番茄材料由廣西大學農(nóng)學院番茄課題組提供，均為在連續(xù)多年發(fā)生晚疫病的試驗田中篩選收集的健康茂盛、經(jīng)多代自交純化的番茄材料。其特性來源見表1。

表1 供試番茄材料及來源

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA 的提取及KASP 分子標記檢測 DNA的提取采用CTAB 法，并且參考了番茄基因組DNA 的提取方法（劉秀麗 等，2017）。稱取0.2 g左右的新鮮番茄葉片置于研缽中，加入液氮研磨至泛白粉末狀，迅速轉移適量粉末至2 mL 離心管中，加入65 ℃ CTAB 提取緩沖液,充分搖勻后置于65 ℃恒溫水浴鍋加熱40 min，冷卻至室溫后加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，充分搖勻后10 000 r · min-1離心10 min，提取上清液加入等體積氯仿/異戊醇，充分搖勻再10 000 r · min-1離心10 min，提取上清液加入醋酸鈉以及異丙醇，混勻后放入-40 ℃冰箱靜置30 min，在4 ℃條件下10 000 r · min-1離心10 min，棄上清液用75%乙醇洗滌沉淀2 次，晾干后加入TE 溶液溶解DNA，放入-40 ℃冰箱 待用。

使用蛋白質核酸分析儀檢測DNA 質量，以OD260/OD280在1.80～2.00 之間為宜。將DNA 送至北京通州國際種業(yè)科技有限公司，利用KASP 標記檢測SNP 位點。設計引物進行PCR 擴增，采用Douglas 軟件進行數(shù)據(jù)分析和基因型確認。

1.2.2 田間抗病性鑒定 2018 年12 月進行晚疫癥田間抗病性調查，采取五點取樣法調查番茄植株田間感病狀況，每個品種大約調查40 m2。將番茄晚疫病病情分為6 個等級（康立功，2006），具體 見表2。

病情指數(shù)（DI）=∑（各級病株數(shù)×該病級值）/（調查總株數(shù)×最高級值）×100

高 抗（HR），0 ≤DI ＜10； 抗 病（R），10 ≤DI ＜30；中抗（MR），30 ≤DI ＜50；感?。⊿）：50 ≤DI ＜70；高 感（HS）：DI ＞70（康立功，2006）。

表2 番茄晚疫病病情分級標準

1.2.3 果實性狀測定 2018 年12 月，在番茄結果期每個品種隨機選擇5 株，在第3 穗果上采5～10個果實進行果實性狀測定。采用桂林量具刃具有限責任公司生產(chǎn)的0～150 mm 電子數(shù)顯卡尺測量番茄果實橫、縱徑，計算果形指數(shù)；采用竹村電機制作所生產(chǎn)的硬度計測定果實硬度；采用成都泰華光學有限公司生產(chǎn)的手持式折光儀測定果實含 糖量。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 利用Microsoft Excel、Word 以及SPSS 20.0 統(tǒng)計分析軟件進行試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 番茄晚疫病抗性檢測結果

田間調查結果顯示（表3），16 份番茄材料中對晚疫病抗性較好的有10 份，其中LF-15、LF-35、LF-41、AL-21、AL-55 的病情指數(shù)均為0，表現(xiàn)高抗，LF-23 也對晚疫病表現(xiàn)高抗，LF-5、LF-7、LF-11、AL-51 表現(xiàn)為抗病。

田間晚疫病抗病性調查數(shù)據(jù)與分子標記試驗結果基本一致。根據(jù)KASP 分子標記檢測結果（表3、圖1～4），16 份材料中有3 份材料含晚疫病純合體抗性基因Ph-3，2 份材料含番茄黃化曲葉病毒病純合體抗性基因Ty-1，4 份材料含番茄黃化曲葉病毒病純合體抗性基因Ty-3，10 份材料含黃萎病純合體抗性基因Ve-2，LF-15、LF-35、LF-41 等3 份材料同時含有4 種抗性基因，其中LF-35 含有的4種抗性基因皆為純合體。

表3 番茄材料田間抗性調查與KASP 分子標記結果

圖1 番茄材料晚疫病抗性基因Ph-3 的KASP 分子標記檢測結果

圖2 番茄材料番茄黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-1 的KASP 分子標記檢測結果

圖3 番茄材料番茄黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-3 的KASP 分子標記檢測結果

圖4 番茄材料黃萎病抗性基因Ve-2 的KASP 分子標記檢測結果

2.2 番茄果實田間性狀調查

從表4 可以看出，16 份番茄材料中只有LF-30與AL-51 為有限生長型，其他材料皆為無限生長型；果形指數(shù)在0.79～1.03 之間，除LF-41 為高圓形外其他材料皆為扁圓形；果實硬度在0.56～0.81 kg · cm-2之間，AL-10 的硬度最高，AL-21 的硬度最低；LF-37、AL-1、AL-51 為中度裂果，LF-5、LF-66 不易裂果，其他材料無裂果現(xiàn)象；含糖量在4.0%～6.0%之間，酸甜比例合適；LF-5、LF-7、LF-35、LF-37、LF-41、AL-7、AL-51、AL-55 等8 份材料無果肩，其余材料皆有果肩。

3 結論與討論

本試驗從16 份番茄材料中篩選出3 份同時含有4 種抗性基因的材料LF-15、LF-35、LF-41，其中LF-35 的4 種抗性基因皆為純合體；這3 份材料皆為無限生長型，LF-41 為高圓形，LF-15、LF-35 為扁圓形，硬度皆在0.70 kg · cm-2以上，沒有裂果現(xiàn)象，含糖量在4.0%～5.5%之間，LF-15有果肩。3 份材料均具有十分優(yōu)良的經(jīng)濟性狀，可以為將來抗性育種篩選聚合多抗番茄材料提供更多 選擇。

本試驗使用第三代分子標記技術，利用KASP標記基于已知SNP 檢測來輔助番茄育種，大大節(jié)省了常規(guī)番茄育種的時間，提高了番茄抗病育種效率。在實踐過程中，由于第二代分子標記技術SSR 是基于凝膠條帶中的觀察，會出現(xiàn)操作觀察的錯誤，比如條帶顯色較弱或者條帶分離不完全等。與第一、二代分子標記技術不同，KASP 基因測定使用新型均相熒光檢測系統(tǒng)（Devran et al.，2016），該技術依賴于等位基因特異性單核苷酸延伸和熒光共振能量轉移（FRET）來產(chǎn)生信號，具有分布密度高、遺傳穩(wěn)定性好、二等位基因型等特點，更容易實現(xiàn)高通量和自動化檢測（劉麗華 等，2018）。本試驗田間晚疫病抗病性調查數(shù)據(jù)與分子標記試驗結果基本一致，表明KASP SNP分子標記能夠顯著提高抗病育種中抗性基因的篩 選率。

綜上所述，新開發(fā)的KASP 標記在篩選番茄育種群體時顯示出一致的結果，將為在短時間內(nèi)快速準確地分析許多樣品提供機會。然而，由于市場和消費者的需求，商業(yè)番茄品種的遺傳和物理特性迅速變化，因此未來KASP 標記應該在具有不同遺傳背景的番茄中進行測試，以確定大群體中標記的效率。在該研究之后，與番茄中的其他抗性基因相關的分子標記也可以轉化為KASP 技術，應用于分子標記輔助選擇以及抗病新種質的培育中。