胡艷平 周 揚(yáng) 楊 春 廖道龍 朱白婢 王 敏 黃文楓 張 文 云天海*

（1 海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，海南省蔬菜生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南省瓜菜育種工程技術(shù)研究中心，海南海口571100；2 海南大學(xué)園藝學(xué)院，海南海口570228；3 海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，海南?？?71100）

海南省具有得天獨(dú)厚的生態(tài)優(yōu)勢(shì)和氣候條件，蔬菜栽培由來(lái)已久，是我國(guó)最主要的南菜北運(yùn)基地。隨著人民生活和消費(fèi)水平的不斷提高，迫切要求各種蔬菜作物實(shí)現(xiàn)周年生產(chǎn)和供應(yīng)。但蔬菜作物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中常常會(huì)受到各種非生物脅迫的影響，其中高溫脅迫是影響其生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量的重要因子之一。蔬菜作物對(duì)于高溫脅迫的響應(yīng)并非完全是被動(dòng)的，其體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的適應(yīng)機(jī)制來(lái)降低脅迫造成的危害（韓笑冰 等，1997；葉陳亮 等，1997），以維持基本的代謝過(guò)程，甚至通過(guò)開(kāi)啟某些基因或者酶的表達(dá)來(lái)緩解高溫帶來(lái)的危害（秦俊 等，2001；田婧和郭世榮，2012；閆圓圓 等，2016）。因此，通過(guò)研究蔬菜作物的耐熱機(jī)理，可以有助于人們培育出耐高溫的蔬菜新品種。

植物在進(jìn)化過(guò)程中形成了許多應(yīng)對(duì)高溫逆境的機(jī)制，包括基礎(chǔ)耐熱性和獲得耐熱性。當(dāng)植物受到高溫脅迫時(shí)，一些基因被激活，從而導(dǎo)致一些代謝物和蛋白的含量增加，這些基因中有些可能會(huì)保護(hù)植物免受高溫脅迫的傷害，有些可能會(huì)激活某些特定基因的表達(dá)從而增強(qiáng)植物的耐熱性。目前已經(jīng)克隆的與植物耐熱性有關(guān)的基因主要分為熱激蛋白（HSPs，heat shock proteins）、熱激轉(zhuǎn)錄因子（HSFs，heat stress transcription factors）、與膜穩(wěn)定性、抗氧化和激素相關(guān)的基因等。熱激蛋白（HSPs）被認(rèn)為是熱脅迫誘導(dǎo)的一類(lèi)蛋白，其中包括：HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、HSP40 和 small HSP（sHSP）（方麗平和李進(jìn)步，2007）。Katiyar-Agarwal 等（2003）將擬南芥的hsp101 基因?qū)胨?，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系的耐熱性有一定程度的提高且產(chǎn)量穩(wěn)定。將玉米ZmHSP22 基因轉(zhuǎn)化到擬南芥中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系生育期縮短，同時(shí)耐熱性增強(qiáng)（Rhoads et al.，2005）。在擬南芥中過(guò)量表達(dá)菊花HSP70 基因可以增強(qiáng)植株對(duì)高溫脅迫的耐受性（Song et al.，2014）。將番茄熱激蛋白基因Lehsp100 反義敲除后，轉(zhuǎn)反義鏈的株系和對(duì)照相比耐熱性下降（Yang et al.，2006）。對(duì)海帶Sjhsp70 基因在溫度脅迫下的表達(dá)變化分析表明，高溫對(duì)Sjhsp70 的表達(dá)量具有顯著影響（袁艷敏 等，2018）。

南瓜起源于中、南美洲，包括30 個(gè)種，其中有5 個(gè)栽培種：中國(guó)南瓜（Cucurbita moschata）、美洲南瓜（C. pepo）、印度南瓜（C. maxima）、灰籽南瓜（C. mixta）以及黑籽南瓜（C. f icifolia）。不同南瓜品種的耐熱性差異較大，不耐熱品種在高溫季節(jié)及溫室栽培下容易受到高溫傷害。一般認(rèn)為，中國(guó)南瓜廣泛種植于熱帶和亞熱帶地區(qū)，生長(zhǎng)發(fā)育的適宜溫度一般為18～32 ℃，具有較好的高溫適應(yīng)性，但溫度超過(guò)35 ℃時(shí)，雄花易變?yōu)閮尚曰?。海南地處熱帶邊緣，夏季太?yáng)輻射強(qiáng)，平均氣溫在25 ℃以上，極端最高氣溫超過(guò)38 ℃，高溫嚴(yán)重制約著海南南瓜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，開(kāi)展南瓜對(duì)高溫脅迫的機(jī)理研究，對(duì)于篩選培育出耐熱的南瓜品種，豐富海南南瓜品種資源具有深遠(yuǎn)意義。本試驗(yàn)基于南瓜基因組的數(shù)據(jù)，從南瓜中分離1 個(gè)熱激蛋白相關(guān)基因CmHSP70-5，對(duì)其在高溫脅迫下的表達(dá)進(jìn)行分析研究，以期為深入探討南瓜耐熱機(jī)理提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

于2018 年11 月選用海南地區(qū)廣泛種植的蜜本南瓜（Cucurbita moschata），將種子播種在裝滿(mǎn)基質(zhì)（泥炭土∶蛭石=1 V∶1 V）的花盆中，放置在培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)，待長(zhǎng)出3 片真葉后，進(jìn)行37 ℃和42 ℃持續(xù)高溫處理，分別在高溫處理后0、3、6、12、24、48 h 取南瓜幼苗的根、莖、葉，用超純水清洗，然后用液氮速凍后立即放入-80 ℃保存以備提取RNA。整個(gè)試驗(yàn)均在海南省瓜菜育種工程技術(shù)研究中心完成。

1.2 RNA 提取及反轉(zhuǎn)錄

采用天根生化科技（北京）有限公司的RNA提取試劑盒（RNAprep Pure Plant Kit，目錄號(hào)：DP441）提取南瓜幼苗的RNA，采用寶生物工程（大連）有限公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒〔PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time），目錄號(hào)：DRR047A〕進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，具體操作步驟參照說(shuō)明書(shū)。

1.3 基因克隆

從南瓜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=Cucurbita+moschata） 中 獲得CmHSP70-5 基 因 的 序 列， 用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列為HSP70-5-F：5′-ATGGCAGCGAAAACTGAAG-3′，HSP70-5-R： 5′-TCAATCAACCTCCTCGATCTTC-3′。以 南 瓜cDNA 為模板，采用Vazyme 公司的2×Taq Master Mix（目錄號(hào)：P112）擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后連接到pEASY-T1（北京全式金生物技術(shù)有限公司，目錄號(hào)：CT101-01）載體上，挑取陽(yáng)性克隆送往上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

用Primer Premier 5.0 軟 件 設(shè) 計(jì) 南 瓜CmHSP70-5 基因的熒光定量引物，內(nèi)標(biāo)基因選用文獻(xiàn)報(bào)道中的Actin 基因（王安君 等，2016）。 引物由上海生工生物工程有限公司 合 成， 引 物 序 列 為：CmHSP70-qRT-F：5′-CGTTGCTTATGGTGCTGCTGT-3′，CmHSP70-qRT-R：5′-CTGTTCTTTCTTTGTTGGGATTGTT-3′；CmActin-F：5′-CGGCCATTGAGAAAAGCTACGAA CT-3′，CmActin-R：5′-CCCACCACTGAGGACGAT GTTACCA-3′。用未經(jīng)高溫處理的根、莖、葉反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 為模板進(jìn)行熒光定量PCR，研究CmHSP70-5 基因在不同組織中的表達(dá)差異；以高溫處理后不同時(shí)間的根、莖、葉cDNA 為模板進(jìn)行熒光定量PCR，研究CmHSP70-5 基因在高溫脅迫下的表達(dá)模式。熒光定量PCR 采用TaKaRa 公司SYBR Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）試劑盒（目錄號(hào)：DRR820A），在ABI 7900HT Fast Real-Time PCR System 儀器上運(yùn)行，Real-Time PCR 反應(yīng)體系參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，45 個(gè)循環(huán)；結(jié)束后讀取熒光信號(hào)：95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，95 ℃ 15 s，進(jìn)行熔解曲線分析。

采用比較CT 法來(lái)計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，目的基因的相對(duì)表達(dá)量=2-△△Ct，其中△△Ct=（Ct目的基因-Ct內(nèi)標(biāo)基因）實(shí)驗(yàn)組-（Ct目的基因-Ct內(nèi)標(biāo)基因）對(duì)照。試驗(yàn)結(jié)果設(shè)3 個(gè)重復(fù)，取平均值進(jìn)行作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 南瓜幼苗RNA 提取及反轉(zhuǎn)錄

將南瓜幼苗經(jīng)過(guò)37 ℃和42 ℃高溫處理，分別在0、3、6、12、24、48 h 取其根、莖和葉片，用RNA 提取試劑盒提取各樣品的總RNA，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)RNA 質(zhì)量較好，28S 和18S 較完整，且量較大（圖1）。按照說(shuō)明書(shū)的操作方法取適量的樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA 用南瓜內(nèi)標(biāo)基因Actin 進(jìn)行PCR 檢測(cè)，從圖2 中可以看出，內(nèi)標(biāo)基因的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶單一，無(wú)雜帶，且亮度基本一致，說(shuō)明cDNA 質(zhì)量較好，可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 42 ℃高溫處理下根中的RNA

圖2 42 ℃處理下根中的cDNA 擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 CmHSP70-5 基因克隆

從南瓜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得CmHSP70-5基因（XM_023065965）的序列，將反轉(zhuǎn)錄的cDNA 混合作為模板，設(shè)計(jì)基因全長(zhǎng)引物，擴(kuò)增CmHSP70-5 基因，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到大小約為2 000 bp 的片段（圖3），將PCR 產(chǎn)物連接到T 載體后，篩選陽(yáng)性克隆送往上海生工生物工程有限公司測(cè)序，確定CmHSP70-5 基因全長(zhǎng)1 953 bp，測(cè)序結(jié)果與南瓜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中查到的序列完全符合，說(shuō)明目的基因擴(kuò)增正確。

圖3 CmHSP70-5 基因的克隆

利用MEGA7.0 軟件將CmHSP70-5 基因編碼的氨基酸序列與擬南芥HSP70 蛋白家族成員進(jìn)行進(jìn)化關(guān)系分析，發(fā)現(xiàn)CmHSP70-5 蛋白與擬南芥AtHSP70-5 的親緣關(guān)系更近（圖4）。

2.3 CmHSP70-5 基因在不同組織中的表達(dá)分析

提取未經(jīng)高溫處理的南瓜幼苗根、莖和葉中的總RNA，采用熒光定量PCR 的方法研究這3 個(gè)組織中CmHSP70-5 基因的表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CmHSP70-5 基因在根中表達(dá)量最高，葉片中的表達(dá)量次之，約為根中表達(dá)量的42%；莖中表達(dá)量最少，約為根中表達(dá)量的11%（圖5）。

圖4 CmHSP70-5 與擬南芥HSP70 家族蛋白的進(jìn)化分析

圖5 CmHSP70-5 基因在南瓜幼苗不同組織中的表達(dá)

2.4 不同溫度脅迫下CmHSP70-5 基因在不同組織中的表達(dá)分析

2.4.1 不同溫度脅迫下根中CmHSP70-5 基因的表達(dá)模式分析 根中CmHSP70-5 基因在高溫脅迫下上調(diào)表達(dá)，處理后3 h 表達(dá)量達(dá)到最高，37 ℃處理3 h 后的表達(dá)量約為起始表達(dá)量的10 倍，42 ℃處理3 h 后的表達(dá)量約為起始表達(dá)量的16 倍，此后表達(dá)量降低，逐漸恢復(fù)到起始水平（圖6）。

2.4.2 不同溫度脅迫下莖中CmHSP70-5 基因的表達(dá)模式分析 雖然莖中CmHSP70-5 基因的起始表達(dá)量較低（圖7），但在高溫處理后，莖中CmHSP70-5 基因受高溫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，從圖7 中可以看出，處理3 h 后基因的表達(dá)量達(dá)到最大，且在高溫處理后0～24 h 內(nèi)42 ℃處理的CmHSP70-5基因表達(dá)量要高于37 ℃同時(shí)期的基因表 達(dá)量。

圖6 根中CmHSP70-5 基因在不同溫度脅迫下的表達(dá)

圖7 莖中CmHSP70-5 基因在不同溫度脅迫下的表達(dá)

2.4.3 不同溫度脅迫下葉中CmHSP70-5 基因的表達(dá)模式分析 與莖中基因表達(dá)量相似，葉片中CmHSP70-5 基因在高溫處理3 h 后的表達(dá)量達(dá)最高，分別為起始表達(dá)量的1 800 倍（37 ℃）和2 860 倍（42 ℃）（圖8），說(shuō)明葉片中CmHSP70-5基因的表達(dá)是一種高溫誘導(dǎo)模式。

圖8 葉中CmHSP70-5 基因在不同溫度脅迫下的表達(dá)

3 結(jié)論與討論

植物生長(zhǎng)過(guò)程中，高溫是影響其生長(zhǎng)發(fā)育的一種重要非生物脅迫，而且溫室效應(yīng)導(dǎo)致全球氣溫升高，園藝植物生產(chǎn)面臨著嚴(yán)峻挑戰(zhàn)（范雙喜 等，2003）。因此研究植物耐熱性，培育耐熱植物新品種已經(jīng)成為一項(xiàng)亟待解決的工作。植物的耐熱性是一個(gè)復(fù)雜的生理現(xiàn)象，是一個(gè)由多基因控制的數(shù)量性狀，包括熱激蛋白HSPs、熱激轉(zhuǎn)錄因子HSFs、抗氧化和激素相關(guān)基因等。在高溫脅迫下，植物細(xì)胞中會(huì)表達(dá)和積累大量的HSPs，從而避免或減輕植物受到熱損傷，HSPs 的積累量是由HSFs 控制的，并在植物熱激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用（Wang et al.，2004）。在所有的HSPs 中，HSP70家族蛋白是生物體內(nèi)分布最廣和研究最多的一類(lèi)。研究發(fā)現(xiàn)，HSP70 在植物生長(zhǎng)發(fā)育和各類(lèi)植物脅迫響應(yīng)中至關(guān)重要（Sung et al.，2001；Swindell et al.，2007；Cho & Choi，2009；Zou et al.，2012；Kim et al.，2014）。擬南芥HSP70-1 定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，與植物的耐熱性相關(guān)（Sung et al.，2001；Cazale et al.，2009）；缺 失HSP70-15 基 因的擬南芥突變體植株矮小、耐熱性下降（Jungkunz et al.，2011）；高粱HSP70 蛋白參與了其雄性不育系在不同溫度下的育性轉(zhuǎn)換（Chen et al.，1998）；葉用萵苣LsHsp70-2711 屬于Hsp70 基因家族，與葉用萵苣耐熱性相關(guān)（李雅博 等，2017）；蠟梅HSP70-1 基因在42 ℃高溫處理后1 h 表達(dá)量達(dá)到最高，說(shuō)明其參與了高溫脅迫響應(yīng)過(guò)程（阮文進(jìn)， 2015）。

本試驗(yàn)從南瓜中克隆到1 個(gè)HSP70 基因，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)其編碼的蛋白與擬南芥AtHSP70-5 蛋白的親緣關(guān)系較近，因此命名為CmHSP70-5。CmHSP70-5 基因在南瓜幼苗的各部位均有表達(dá)，運(yùn)用熒光定量PCR 技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，CmHSP70-5 基因的表達(dá)受到高溫脅迫誘導(dǎo)，在一段時(shí)間內(nèi)，溫度越高，表達(dá)量越高，這與其他植物中HSP70 基因的表達(dá)模式相似（Sung et al.，2001；Jungkunz et al.，2011；陳二龍 等，2018）。本試驗(yàn)結(jié)果對(duì)開(kāi)展南瓜耐熱機(jī)制研究以及耐熱南瓜的選育有積極意義。