綦宇軒，徐 媛，符志楊，關(guān)麗萍

（浙江海洋大學食品與醫(yī)藥學院，浙江舟山 316022）

異喹啉類生物堿(Isoquinolines）是自然界中植物體內(nèi)所分布數(shù)量多、結(jié)構(gòu)類型復雜的一類生物堿。四氫異喹啉類生物堿作為天然的先導化合物，在植物中分布比較廣泛，將其結(jié)構(gòu)進行修飾、改造和優(yōu)化是豐富四氫異喹啉生物堿結(jié)構(gòu)多樣性的重要途徑。研究表明四氫異喹啉類生物堿及其衍生物具有多種藥理活性，如中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)、抗腫瘤抗癌、抗炎癥和抗病原微生物等[1-3]。

OSHIRO，et al[4]在篩選具抗抑郁活性的3，4-二氫-2(1H)-喹啉酮類衍生物時發(fā)現(xiàn)，5-甲氧基取代的衍生物具有刺激中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抗抑郁活性，并能選擇性的結(jié)合σ受體。TSOYI，et al[5]研究發(fā)現(xiàn)四氫異喹啉類化合物CKD 712（(S)-YS49）可經(jīng)由JAK-2和STAT-1通路發(fā)揮抗炎作用，其在小鼠的炎癥免疫模型（用脂多糖誘導RAW 264.7）中表達良好的抗炎作用，顯示NO和誘導型一氧化氮合成酶的生成被抑制，對其異構(gòu)體進行構(gòu)效分析研究后發(fā)現(xiàn)其對i NOS的抑制活性為S型＞R型。李劍[6]研究發(fā)現(xiàn)一種新的四環(huán)化合物四氫吡咯里嗪并喹琳并進行了結(jié)構(gòu)優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多數(shù)這樣結(jié)構(gòu)的衍生化合物具有較好的鎮(zhèn)痛作用。在此類衍生物的N原子上引入不同取代的酰胺基團和不同碳鏈烷基后，設(shè)計合成一系列的新型四氫吡咯里嗪并喹琳衍生物具有良好的鎮(zhèn)痛活性。

在上述研究的基礎(chǔ)上，筆者的課題組為了尋找抗抑郁、抗炎及鎮(zhèn)痛活性強，副作用低的化合物，設(shè)計合成了Solifenacin-1801化合物（結(jié)構(gòu)見圖1），對Solifenacin-1801采用經(jīng)典抗抑郁模型“小鼠強迫游泳實驗”和“小鼠懸尾實驗”進行抗抑郁活性研究。另據(jù)研究報道[7-8]抑郁與體內(nèi)炎癥和疼痛有一定的相關(guān)性。為了探討其相關(guān)性可能的作用機制，對Solifenacin-1801化合物采用經(jīng)典的“小鼠二甲苯致耳腫脹的抗炎模型”和“小鼠醋酸扭體實驗”進行抗炎和抗鎮(zhèn)痛研究，以期探討抗抑郁與炎癥和疼痛之前的關(guān)系，初步探討其作用機制，為抗抑郁藥物的研究提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

圖1 化合物Solifenacin-1801結(jié)構(gòu)Fig.1 The structure of compound Solifenacin-1801.

1 材料與方法

1.1 實驗儀器與試劑

WRS-1B數(shù)字熔點儀（上海精密科學儀器有限公司），BS323S精密天平（賽多利斯科學儀器有限公司），F(xiàn)T-IR1730紅外光譜儀（Bruker公司），AV-300核磁共振光譜儀（Bruker公司），HP1100LC/MS質(zhì)譜儀（美國惠普公司）。氟西汀，吲哚美辛購自Sigma公司，其它化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗動物

小鼠（ICR）20±2 g，購于浙江省實驗動物中心。實驗前，在動物室飼養(yǎng)1周，以適應(yīng)實驗條件和環(huán)境，晝夜進食進水。

1.3 Solifenacin-1801的制備路線

1.3.1 (S)-1-苯基-1，2，3，4-四氫異喹啉羧酸乙酯的制備

取 12 g（0.06 mol）的(S)-1-苯基-1，2，3，4-四氫異喹啉和 8.3 g(0.06 mol)的碳酸鉀，加入到甲苯(45 mL)和蒸餾水(30 mL)(3:2)的混合液中，置于圓底燒瓶中。攪拌條件下，于4℃緩慢滴加氯甲酸乙酯6.5 g(0.06 mol，5.71 mL)。滴畢，室溫條件下反應(yīng)50 min，反應(yīng)過程中使用薄層色譜追蹤反應(yīng)進程（展開劑：二氯甲烷（V）：甲醇（V）=30:1）。后處理：甲苯層先后經(jīng) 50 mL 蒸餾水，20 mL的 1 mol·L-1鹽酸，50 mL 蒸餾水，80 mL飽和氯化鈉溶液洗滌。洗滌后的有機層用無水硫酸鈉干燥，蒸除甲苯。得無色油狀物體 (S)-1-苯基-1，2，3，4-四氫異喹啉羧酸乙酯，稱重約15.4 g，計算產(chǎn)率為95.05%。

1.3.2 Solifenacin-1801的制備

取(S)-1-苯基-1，2，3，4-四氫異喹啉羧酸乙酯3.0 g（0.01 mol）與30 mL的甲苯于圓底燒瓶中，油浴加熱至 110～120 ℃，攪拌 2 h。冷卻后將氨芐 5.9 mL（0.05 mol，5.7 g）和 0.42 g（0.02 mol）NaH，加入到上述反應(yīng)體系的圓底燒瓶中，并升溫到130～140℃，不斷蒸除生成的乙醇。乙醇蒸出后，繼續(xù)反應(yīng)15 min，而后冷卻至室溫。反應(yīng)過程中采用薄層色譜追蹤反應(yīng)進程（二氯甲烷（V）：甲醇（V）=5:1）。反應(yīng)冷卻至室溫，加入30 mL飽和NaCl溶液，用乙酸乙酯萃取，合并有機層用蒸餾水洗滌，再用10 mL的20%HCl洗滌，用2 mol·L-1的氫氧化鈉溶液調(diào)pH至10。用無水硫酸鈉干燥，濃縮濾液。用95%的乙醇重結(jié)晶，得到目標化合物 Solifenacin-1801。

1.4 藥理活性實驗

1.4.1 小鼠強迫性游泳實驗（FST）

取雄性小鼠，隨機分成6組，每組8只?；衔颯olifenacin-1801和陽性對照藥物鹽酸氟西汀溶于聚乙二醇-400中，實驗當天在各組給藥30 min后，將小白鼠單只放入高為20 cm，直徑為14 cm，水深為10 cm，溫度為23±2℃的圓柱形玻璃容器中，觀察6 min。前2 min時小鼠劇烈掙扎，隨后進入不動時間，此時由玻璃容器上方直接定位的攝像機記錄實驗后4 min內(nèi)的不動時間。通過小鼠浮在水面上不動以及僅僅輕微劃動肢體以確保頭部浮在水面上所花費的時間認定為小鼠的不動時間[9]。

1.4.2 小鼠懸尾實驗（TST）

將小鼠尾部距離尖端2 cm處用尾巴夾鉗固定，懸掛于支架上，頭部距離臺面5 cm。實驗環(huán)境要求黑暗，無明顯噪音。總共懸浮6 min，前2 min不計時，在測試的后4 min的時間內(nèi)，觀察和測量不動的持續(xù)時間。整個測試分別由箱體正上方的攝像記錄觀察，攝像背景與小鼠毛色呈明顯反差，白色小鼠采用黑色背景。實驗結(jié)束后拿下錄像帶，此時小鼠的不動時間為它們被懸掛后徹底靜止不動的時間[10]。

1.4.3 抗炎藥理活性

Solifenacin-1801和陽性對照藥物吲哚美辛溶于聚乙二醇-400，小鼠隨機分組，雌雄各半，每組8只。實驗時，小鼠進行腹腔注射給藥100 mg·kg-1，使用的媒介溶劑和藥物溶液的注射體積均為每只鼠給藥0.1 mL。給藥0.5 h后，小鼠左耳內(nèi)外兩面涂抹二甲苯，用量為0.05 mL·200-1·g-1，為實驗組；右耳朵不涂抹，作為對照組，小鼠二甲苯致耳腫脹的抗炎模型[11]。炎癥造模15 min后，頸脫臼處死小鼠，使用小鼠耳打孔機中直徑6 mm的打孔模具分別在同一位置打下小鼠左右雙耳的耳片。記錄其質(zhì)量，計算腫脹度和腫脹率。以左右兩側(cè)耳片質(zhì)量差作為腫脹程度的指標，實驗組與對照組的腫脹程度進行統(tǒng)計學處理。抗炎作用強度以腫脹度和腫脹率(%)表示。

腫脹度=左耳質(zhì)量-右耳質(zhì)量；腫脹率-[(左耳質(zhì)量-右耳質(zhì)量)/左耳重量]×100%

1.4.4 鎮(zhèn)痛實驗

小鼠隨機分組，雌雄各半，一組8只。實驗時，小鼠進行腹腔注射給藥。給藥30 min后進行實驗，腹腔注射1.2%的冰乙酸生理鹽水溶液進行疼痛造模[12]，注射劑量為每只鼠0.2 mL(即0.1 mL·10-1·g-1)，觀察并記錄造模后15 min內(nèi)小鼠出現(xiàn)的扭體現(xiàn)象的次數(shù)。小鼠出現(xiàn)扭體反應(yīng)的現(xiàn)象為：四肢延伸，腹部收縮內(nèi)凹，臀部扭轉(zhuǎn)的一系列動作，只出現(xiàn)了腹部內(nèi)凹收縮和蜷縮成團并伴有微微震顫的狀態(tài)不計為小鼠的扭體反應(yīng)狀態(tài)。統(tǒng)計藥物在醋酸致痛模型中對小鼠扭體反應(yīng)的抑制率和鎮(zhèn)痛百分率。

抑制率%=（空白組鼠扭體次數(shù)均數(shù)-給藥組鼠扭體次數(shù)均數(shù)）/空白組鼠扭體反應(yīng)均數(shù)×100%

鎮(zhèn)痛百分率%=（給藥組無扭體反應(yīng)數(shù)-空白組無扭體反應(yīng)數(shù)）/空白組扭體反應(yīng)數(shù)×100%

1.5 統(tǒng)計方法

抗抑郁活性的定量評價采用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，組間比較用t檢驗，P＜0.05為具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 Solifenacin-1801光譜數(shù)據(jù)

對目標化合物采用IR、1H-NMR、13C-NMR和MS確定結(jié)構(gòu)，產(chǎn)率和光譜數(shù)據(jù)。產(chǎn)率71.8%，熔點116.4-118.3 °C。IR(KBr)cm-1:3288，1719，1618，1247.1H NMR(CDCl3，300 MHz):δ 2.86-2.98(2H，t，-CH2-)，3.73-3.87(2H，t，-CH2-)，4.48(1H，s，-CH)，6.45(1H，s，-CH)，6.67(1H，s，-NH)，6.90-7.10(4H，m，-C6H4)，6.95-7.31 (5H，m，-C6H5)，7.25-7.40 (5H，m，-C6H5).13C NMR (CDCl3，75 MHz):δ 28.38，40.13，45.10，57.81，126.40，127.17，127.24，127.50，127.65，128.25，128.40，128.48，128.60，135.09，136.52，139.47，142.82，157.49.MS([M+1]+):342.

2.2 抗抑郁活性

小鼠強迫游泳實驗結(jié)果如表1。化合物Solifenacin-1801在三種劑量10，20和30 mg·kg-1均顯著抑制小鼠強迫游泳的不動時間，顯示一定的抗抑郁活性。Solifenacin-1801在30 mg·kg-1給藥劑量下與空白組比具有顯著性差異（P＜0.001），Solifenacin-1801在20 mg·kg-1給藥劑量下，其抑制率為74.2%，其抑制率與陽性對照藥氟西汀相似，而Solifenacin-1801在30 mg·kg-1給藥劑量下其抑制率為84.4%，好于陽性對照藥氟西汀，顯示出顯著抗抑郁活性。

表1 Solifenacin-1801小鼠強迫游泳試驗抗抑郁活性Tab.1 Antidepressant activity of Solifenacin-1801 in the FST

為了進一步確認Solifenacin-1801抗抑郁活性，對Solifenacin-1801進行小鼠懸尾實驗，結(jié)果如表2。Solifenacin-1801小鼠懸尾試驗抑制小鼠不動時間結(jié)果與在FST實驗相似。Solifenacin-1801在20和30 mg·kg-1給藥劑量下，其抑制率分別為39.0%和43.1%，其抑制率與陽性對照藥氟西汀相似，顯示一定的抗抑郁活性。

表2 Solifenacin-1801小鼠懸尾試驗抗抑郁活性Tab.2 Antidepressant activity of Solifenacin-1801 in the TST

2.3 Solifenacin-1801抗炎和鎮(zhèn)痛活性

據(jù)文獻報道抑郁與炎癥和疼痛有一定的相關(guān)，為此，Solifenacin-1801采用小鼠耳腫脹模型和醋酸致痛模型進行小鼠的抗炎活性和鎮(zhèn)痛活性評價，實驗結(jié)果見表3。Solifenacin-1801在100 mg·kg-1的給藥劑量下，Solifenacin-1801的抗炎率為77.4%，鎮(zhèn)痛率為96.3%，其抗炎抑制活性與陽性藥吲哚美辛相比活性低，而鎮(zhèn)痛活性與陽性對照藥相似，與空白組相比具有顯著性差異（P＜0.001），顯示一定的抗炎與鎮(zhèn)痛活性。

小鼠強迫游泳實驗和懸尾實驗被動接受抑郁癥的兩個經(jīng)典的應(yīng)激模型，從而誘發(fā)動物絕望的狀態(tài)，在小鼠中實驗具有良好的可靠性和預測性[13-14]。兩種模式，小鼠都是處于全力掙扎但又無法掙脫的局限壓迫的環(huán)境中，一段時間后，動物即被誘導出小鼠抑郁狀態(tài)的特征行為（行為絕望狀態(tài)-不動狀態(tài)），這反過來又可能反映了人類的抑郁癥[15]。一些研究表明，這些急性試驗的陽性結(jié)果對單胺轉(zhuǎn)運氧化酶具有良好的、優(yōu)異的預測效果，這對人身上受試抗抑郁藥的治療效果是一個重要的機制干擾[16]。

表3 Solifenacin-1801的抗炎和鎮(zhèn)痛活性Tab.3 Anti-inflammatory and analgesic activities of Solifenacin-1801

Solifenacin-1801在3個劑量（10，20和30 mg·kg-1）條件下給藥30 min后，能夠顯著的降低強迫游泳試驗和懸尾試驗中小鼠的不動時間，顯示出顯著的抗抑郁作用，并在10～30 mg·kg-1的劑量下具有以劑量依賴性。我們發(fā)現(xiàn)在100 mg·kg-1給藥劑量下，Solifenacin-1801不僅抗抑郁活性顯著，其同樣還顯示出顯著的抗炎與鎮(zhèn)痛活性，Solifenacin-1801的抗炎率為77.4%，鎮(zhèn)痛率為96.3%。進一步說明了Solifenacin-1801的抗抑郁作用機制，可能還通過炎癥免疫假說的細胞介質(zhì)傳導或與疼痛抑郁合并癥機制有關(guān)，起到抗抑郁療效。

Solifenacin-1801顯著的抗抑郁、抗炎鎮(zhèn)痛的生物活性，綜合分析炎性反應(yīng)和疼痛與抑郁癥研究進展，免疫炎性反應(yīng)是抑郁癥的發(fā)病機制之一，炎性過程與部分抑郁癥的發(fā)生發(fā)展相關(guān)聯(lián)，而非全部抑郁癥[17-18]，抑郁癥存在以高炎性狀態(tài)為抑郁標志的“亞型”免疫炎性[19]，抗抑郁藥可能大多具有抗感染療效。

3 結(jié)論

本研究以 (S)-1-苯基-1，2，3，4-四氫異喹啉為起始原料，經(jīng)成酯和胺解交換反應(yīng)得到目標化合物Solifenacin-1801，而后經(jīng)IR、1H-NMR、13C-NMR和高質(zhì)譜確定其結(jié)構(gòu)。

抗抑郁活性實驗表明，Solifenacin-1801在10，20和30 mg·kg-1劑量條件下，均能顯著降低小鼠強迫游泳和小鼠懸尾不動時間，顯示一定的抗抑郁活性。尤其在30 mg·kg-1給藥劑量下，與空白對照組相比具有顯著性差異（P＜0.001），其抑制率與陽性對照藥氟西汀相似，具有很好的抗抑郁活性。

另外，Solifenacin-1801在耳腫脹抗炎實驗和醋酸致痛實驗顯示，在100 mg·kg-1的給藥劑量下與空白對照組相比具有顯著性差異（P＜0.001），顯示出顯著的抗炎與鎮(zhèn)痛活性，進一步證明抑郁與體內(nèi)的炎癥和疼痛有關(guān)。此研究，為尋找炎癥和疼痛誘導引發(fā)的抑郁合并癥類的抗抑郁藥提供了實驗理論依據(jù)。