陳光哲　曾德新　周昊　謝青軒　沈嘉敏

摘要：在我國，副溶血性弧菌被認為是海產(chǎn)品衍生疾病的主要因素，因此急需一種能快速、靈敏、特異、準確地檢測食品中副溶血性弧菌的方法。傳統(tǒng)培養(yǎng)法一直是檢測的金標準，但是其檢測周期較長;分子生物學方法如聚合酶鏈式反應（PCR）、實時熒光定量PCR（qPCR）、環(huán)介導等溫擴增技術(shù)（LAMP）已被廣泛用于食品中副溶血性弧菌的檢測，但是這些方法不能區(qū)分死菌和活菌的DNA，容易造成假陽性。而疊氮溴化丙錠（propidium monoazide，簡稱PMA）等核酸染料的使用可以有效地消除這一弊端。研究者們將PMA處理與PCR（qPCR）結(jié)合，應用于食品中多種食源性致病菌活菌的檢測，但是關(guān)于PMA在副溶血性弧菌檢測中應用的報道并不多見。因此，擬對PMA應用于食品中副溶血性弧菌檢測的可行性進行分析，以便為進一步開展相關(guān)研究提供參考。

關(guān)鍵詞：副溶血性弧菌;活菌檢測;食源性病原菌;疊氮溴化丙錠（PMA）

中圖分類號： TS207.4? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）04-0162-06

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，簡稱VP）是導致胃腸道感染的主要致病菌，廣泛存在于海水、沉積物和各類海鮮（包括牡蠣、蛤蜊、扇貝、章魚、蝦、蟹、龍蝦、克氏原螯蝦和眾多魚類）中[1]。VP感染可引起腹瀉、嘔吐、腹部痙攣，在少數(shù)情況下可引起發(fā)燒[2]，但并不是所有的副溶血性弧菌都具有致病性。該菌的致病性與耐熱直接溶血素（TDH）和耐熱相關(guān)溶血素（TRH）相關(guān)，分別由tdh、trh基因編碼[3-5]。此外，VP的主要毒力因子還有不耐熱溶血毒素（TLH）。研究表明，TLH是一種非典型的磷脂酶，能溶解人和馬的紅細胞，具有副溶血性弧菌種屬的特異性。TDH能在我妻氏血平板上引起β-溶血（神奈川現(xiàn)象），具有致死毒性、心臟毒性、細胞毒性和腸毒素作用;TRH雖然不能引起神奈川現(xiàn)象，但其與TDH有相似的免疫原性和67%的相同氨基酸序列，并同樣具有致死作用和細胞毒性。我國食源性疾病監(jiān)測網(wǎng)站相關(guān)工作人員調(diào)查了其監(jiān)測地區(qū)（16個?。?4年間的8 000多起食物中毒案例，發(fā)現(xiàn)微生物性病原仍然是我國食源性疾病的主要病因（占30%～40%）。近10年來，由交叉污染導致肉類食品或水產(chǎn)品（包括淡水魚污染）而引起的副溶血性弧菌食物中毒已取代沙門氏菌，躍居第1位[6]。因此，迫切需求一種快速、簡便、準確、實用的檢測方法對副溶血性弧菌進行實時監(jiān)控。

用傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測食品中的副溶血性弧菌一般需要經(jīng)歷增菌、選擇性平板培養(yǎng)、生化鑒定等過程，檢測周期長達5～7 d。而對副溶血性弧菌的定量檢測，在對樣品中的病原菌做定量分析后還需要對可疑菌落做定性驗證，使得檢測周期更長[7-10]。分子生物學方法，如實時熒光定量PCR（qPCR）具有快速、檢測靈敏度高的優(yōu)點，但是這類檢測技術(shù)無法區(qū)分死菌和活菌，因為細菌DNA在菌體死亡后還能留存幾天到幾周。因此，使用該檢測技術(shù)用于副溶血性弧菌的定性檢測可能導致假陽性，若用于定量檢測則無法得到準確的數(shù)據(jù)[11-12]。? 疊氮溴化丙錠（PMA）是一種核酸染料，可用于PCR（qPCR），有效排除死菌DNA的干擾，達到特異性檢測活菌的效果[12]。目前，眾多學者已將PMA處理同qPCR結(jié)合應用于各種活菌檢測，包括單增李斯特桿菌[13]、大腸桿菌 O157 ∶ H7[14]、彎曲菌[15]、金黃色葡萄球菌[16]、沙門氏菌[17]等。然而，將上述方法用于副溶血性弧菌檢測的研究尚不多見。因此，本研究僅探討PMA在副溶血性弧菌檢測中應用的必要性和可行性，以期為副溶血性弧菌快速檢測技術(shù)的研究提供新的思路。

1 副溶血性弧菌檢測技術(shù)概述

1.1 傳統(tǒng)培養(yǎng)法

GB 4789.7—2013《食品衛(wèi)生學檢驗 副溶血性弧菌檢驗》中闡述了對副溶血性弧菌檢測的傳統(tǒng)培養(yǎng)方法。該方法包括增菌培養(yǎng)、選擇性平板培養(yǎng)、生化鑒定、血清學反應等過程，整個過程耗時5～7 d。傳統(tǒng)培養(yǎng)法可以得到活的病原菌，為檢測結(jié)果的判定提供了切實有力的證據(jù)，一直是食品檢測的金標準。但是其耗時長，操作繁瑣，給實際檢測工作造成了諸多不便;在市場經(jīng)濟高速發(fā)展的今天，超長的檢測周期也影響了食品貿(mào)易的發(fā)展;而傳統(tǒng)培養(yǎng)法對檢測人員的要求也相對較高，可疑菌落的挑選決定了檢測結(jié)果的準確度，在實際檢測中容易出現(xiàn)人為因素而導致的假陽性或假陰性。

1.2 分子生物學檢測法

應用于副溶血性弧菌檢測的分子生物學檢測方法主要包括聚合酶鏈式反應（PCR）、實時熒光定量PCR（qPCR）、環(huán)介導等溫擴增技術(shù)（LAMP）、變性高效液相色譜檢測技術(shù)（DHPLC）、基因芯片技術(shù)等。PCR技術(shù)有操作簡單、成本低、用時短等特點，已被廣泛用于副溶血性弧菌的檢測[6]，但在靈敏度和多基因檢測方面有一定的局限性。除普通PCR外，多重PCR（MPCR）和巢式PCR也被廣泛應用于副溶血性弧菌的檢測中，它們在一定程度上優(yōu)化了普通PCR，在縮短檢測時間的同時可增強PCR的靈敏度和特異性。qPCR是在PCR反應體系中加入熒光基團，通過檢測聚合酶鏈式反應中產(chǎn)生的熒光信號來實現(xiàn)對VP的定性或定量檢測。與PCR相比，qPCR不需要電泳確認，大大提高了檢測效率，同時該方法在靈敏度、特異性、重復性等方面也更具有優(yōu)勢。qPCR可分為染料法和探針法，其中探針法通過探針可以增強反應收集信號的特異性，只有探針結(jié)合的片段上發(fā)生擴增才能收集到信號，能夠用多重體系反應的方法，能夠預測和提前進行反應條件的優(yōu)化，缺點是要合成探針，成本高;染料法經(jīng)濟實惠，可以作溶解曲線，分析全部PCR產(chǎn)物的Tm值，缺點就是特異性相對于探針法較差。LAMP是在PCR的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，相比于PCR方法，其操作流程更為簡單，靈敏度更高，整個檢測過程僅需15～30 min，且結(jié)果也不需要電泳等途徑判定，憑肉眼觀察顏色即可[18]。但是其顏色也經(jīng)常介于陽性和陰性之間，會導致假陽性、假陰性或無法判斷[19]。DHPLC常用于分子分型和流行病學研究，但也可用于致病菌的檢測。Zhan等利用PCR-DHPLC技術(shù)建立副溶血性弧菌特異基因檢測平臺，可以通過洗脫峰快速判斷結(jié)果[20]。該方法能有效避免PCR產(chǎn)物電泳檢測的后污染，也使檢測成本明顯降低，具有簡便快捷、高通量和自動化的特點，且其準確性和靈敏度高，重復性好，特別適用于大樣本量的快速檢測。除了上述檢測手段外，基因芯片技術(shù)也被應用于副溶血性弧菌的檢測中?；蛐酒梢酝瑫r高通量檢測多株副溶血性弧菌的多個基因及基因表達、SNP突變和缺失，具有很好的特異性和檢測靈敏度，適用于副溶血性弧菌的系統(tǒng)化研究。目前，已有商品化的副溶血性弧菌基因芯片出售。但是基因芯片成本過高，需要特殊的設(shè)備，且檢測流程復雜，并未得到廣泛使用。

1.3 免疫學檢測

目前，免疫學檢測手段也被廣泛應用于副溶血性弧菌的檢測，免疫學檢測主要是利用抗原-抗體特異性結(jié)合的方法鑒別病原菌，具有特異性強、操作簡單、耗時短等優(yōu)點。目前常見的用于副溶血性弧菌檢測的免疫學手段有酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（ELISA）、免疫膠體金技術(shù)和生物傳感器技術(shù)。Zhong等基于IgY建立了用于VP檢測的夾心ELISA法，該方法的檢測靈敏度達到2.5萬CFU/mL，耗時僅4 h[21];王報貴等研制了用于VP檢測的膠體金試紙條，其檢測靈敏度為 106 CFU/mL[22];孔繁德等研發(fā)的VP膠體金試紙條的檢測靈敏度可以達到3.592萬CFU/mL[23]。目前，用于VP檢測的商品化ELISA試劑盒及膠體金試紙條已被廣泛用于檢測機構(gòu)中，與分子生物學方法相比，它們耗時更短，操作更加簡單方便，但是其檢測靈敏度卻相對偏低。

除了上述常用的方法外，生物傳感器技術(shù)[24]、上轉(zhuǎn)換發(fā)光免疫層析技術(shù)也可用于副溶血性弧菌的檢測[25]，通過與分子生物學檢測技術(shù)或免疫學檢測技術(shù)結(jié)合，可進一步優(yōu)化副溶血性弧菌的檢測方法，可以在提高檢測靈敏度、增強穩(wěn)定性等方面發(fā)揮積極作用。

然而，值得注意的是，除了傳統(tǒng)培養(yǎng)法外，上述檢測方法均不能鑒別活菌和死菌。受死菌的干擾，分子生物學檢測法和免疫學檢測法容易產(chǎn)生假陽性而導致誤判，特別是在定量檢測中更無法提供真實的檢測數(shù)據(jù)。

2 活菌檢測技術(shù)

有效檢測食品中的VP活菌是評估食品潛在危害并及時做好防控措施的關(guān)鍵和必要條件。除了傳統(tǒng)培養(yǎng)法，有2種方法可以快速檢測食品中的活菌。第1種是通過反轉(zhuǎn)錄（q）PCR檢測mRNA的方法[26-27]。有研究表明，由于細菌的轉(zhuǎn)錄過程對細胞內(nèi)外的RNA酶特別敏感，細菌的mRNA含量會在細菌死亡后急劇下降，因此mRNA的檢測不同于基于DNA的檢測，mRNA僅可在活的且有活力的細胞中被檢測到?；谶@一理論，反轉(zhuǎn)錄定量PCR（RT-PCR）已被應用于多種食源性致病菌的檢測，包括腸出血性大腸桿菌、單增李斯特桿菌、沙門氏菌、弧菌屬及彎曲菌屬等[28-36]。然而，這種檢測方法需要表達目的基因，而基因的表達在外界影響下易發(fā)生改變。此外，RNA在復雜的食品基質(zhì)中容易降解?？偟膩碚f，使用反轉(zhuǎn)錄PCR（qPCR）技術(shù)更適合基因表達研究，而不適合用于食源性病原菌檢測系統(tǒng)[37]。還有些研究指出，mRNA會在細胞死亡后快速消失[26]，而其他研究者則表示，轉(zhuǎn)錄過程在細胞死亡后還會持續(xù)較長一段時間[38-39]。第2種檢測技術(shù)可稱為活性PCR（V-PCR）或活性qPCR（V-qPCR），這種方法依賴于對完整細胞膜內(nèi)DNA的檢測。V-（q）PCR技術(shù)，分為活性鑒別和（q）PCR擴增2個步驟。目前有2種物質(zhì)常被用于活性鑒別階段，即疊氮溴化乙錠（edthidium monoazide，簡稱EMA）和疊氮溴化丙錠（propidium monoazide，簡稱PMA），它們是2種對DNA具有高度親和力的光敏DNA染料，會被完整的細菌細胞壁排斥，但是能進入受損的細胞壁或細胞膜[40]。進入細胞后，當暴露在強光下時，由于有疊氮基團的存在，上述2種分子染料能與DNA偶聯(lián)。強光的作用會形成高活性氮自由基，該自由基團能與其附近包括DNA在內(nèi)的任何有機分子結(jié)合生成穩(wěn)定的共價氮碳鍵，經(jīng)過上述核酸染料修飾的DNA將無法進行后續(xù)PCR擴增。當EMA/PMA等核酸染料在強光作用下與DNA偶聯(lián)結(jié)合的同時，強光也會促使多余的核酸染料與水分子結(jié)合而生成不具有活性的羥胺（hydroxylamine），因此，完整細胞內(nèi)的DNA在此過程中不會受到核酸染料的影響[41]。經(jīng)過核酸染料處理后，后續(xù)的PCR（qPCR）能特異地擴增細胞膜完整的即活菌內(nèi)的DNA，實現(xiàn)有效鑒別活菌的目的（圖1）。與mRNA檢測相比，V-（q）PCR更穩(wěn)定，可操作性更強，受到眾多學者的認可[42-46]。

3 PMA與EMA的比較

PMA、EMA具有幾乎相同的排除死菌DNA干擾的功能，但是它們在穿透細胞膜方面有差異。有研究指出，由于化學成分的差異，EMA在信號抑制方面的作用優(yōu)于PMA，而PMA在鑒別死菌-活菌方面的能力要強于EMA[46]。Nocker等指出，PMA的膜穿透力比EMA差，可能與它們攜帶的電荷數(shù)量有關(guān)，他們用4種革蘭氏陽性菌和4種革蘭氏陰性菌比較EMA和PMA的穿透能力，結(jié)果表明，EMA對細胞膜的穿透能力比PMA強，但EMA對活菌DNA具有一定的破壞性[40]。Cawthorn等也指出，EMA對活菌DNA有損害，他們采用與嬰幼兒配方奶粉相關(guān)的阪崎腸桿菌作為研究對象，結(jié)果顯示，當用100、50、10 μg/mL PMA處理阪崎桿菌活菌時，總DNA的回收率分別為95%、96%、97%，而用相同濃度的EMA處理時，總DNA的回收率則分別降低為74%、82%、92%，當分別使用上述3種濃度的PMA或EMA作用于死菌（熱滅活）時，總DNA的回收率均為0%，從而充分證明了這2種核酸染料在排除死菌干擾方面的能力以及EMA的破壞力[47]。此外，有研究者指出，EMA在選擇性擴增活菌DNA方面的能力不如PMA，作為繼EMA之后用于活菌檢測研究的核酸染料，PMA是一種有效的替代品，更受研究者青睞[48]。

4 PMA在副溶血性弧菌檢測中的應用

將PMA處理同（q）PCR結(jié)合用于活菌檢測的技術(shù)已被廣泛應用于各種食源性致病菌，包括大腸桿菌O157 ∶ H7[49-51]、沙門氏菌[52-53]、金黃色葡萄球菌[11，45]、單增李斯特桿菌[11，54]、彎曲菌[15，55]等的檢測。然而，PMA在副溶血性弧菌活菌檢測中的應用并不多見，僅有少數(shù)研究者作了相關(guān)報道。Zhu等將PMA與qPCR結(jié)合，用于檢測海鮮食品中副溶血性弧菌活菌，通過與傳統(tǒng)培養(yǎng)法和qRCR法比較，表明PMA-qPCR在副溶血性弧菌活菌檢測中更具有優(yōu)勢[42]。在該試驗設(shè)計中，研究者使用了70株不同來源的副溶血性弧菌和120份樣品，充分證實了該方法的準確性和可行性;同時研究者也指出，他們構(gòu)建的檢測體系也存在一定的缺陷，對于活菌的有效檢出，受到了菌液濃度的約束。

筆者所在實驗室也對PMA在副溶血性弧菌活菌檢測中的應用作了探索性研究，選擇tdh（GenBank登錄號：AY249144.1）作為目的基因，設(shè)計引物及探針如下：TDH-F：5′-TTGAGCTTCCATCTGTCCCTTTTCCTG-3′;TDH-R：5′-TGACCGGAGCTTGGGTATTA-3′;TDH-P：5′-FAM-TTGGCTGCATTCAAAACATC-TAMRA-3′。將60×106 CFU/mL菌液經(jīng)10倍梯度稀釋至6.0×100 CFU/mL，經(jīng)Real-Time PCR后，用CT值與菌液濃度構(gòu)建標準曲線，可獲得其檢測靈敏度達6 CFU/mL（圖2）。為了驗證PMA的功效，設(shè)計4個試驗組，分別為活菌（PMA處理）、死菌（PMA處理）、活菌（未用PMA處理）、死菌（未用PMA處理），其菌液濃度均為6.0×106 CFU/mL，其中死菌經(jīng)煮沸滅活得到。對于未用PMA處理組，將其菌液提取DNA（TIANGEN，TIANamp Bacteria DNA Kit，DP302）后用于Real-Time PCR擴增[TaKaRa，Premix Ex Taq（probe qPCR），RR390A]，具體步驟嚴格按操作說明書執(zhí)行。對于PMA處理組，菌液先經(jīng)PMA處理，流程如下：在 1 mL 菌液中加入PMA，使其終濃度為50 μmol/L，充分振蕩混勻，于暗處靜置5 min，將菌液置于距650 W鹵素燈20 cm處，強光照射2 min，促使PMA與DNA交聯(lián)[49]。此后菌液同未處理組一樣，經(jīng)DNA提取純化后用Real-Time PCR擴增，結(jié)果見圖3?？梢钥闯?，PMA處理能有效鑒別副溶血性弧菌死菌和活菌，當菌液濃度高達6.0×106 CFU/mL 時能充分抑制死菌DNA的PCR擴增，而對活菌無影響。

顯然，將PMA與（q）PCR結(jié)合，對于實現(xiàn)副溶血性弧菌活菌的快速檢測是切實可行的。鑒于食品中有害副溶血性弧菌檢測及副溶血性弧菌定量檢測的要求，將PMA應用于副溶血性弧菌的快速檢測具有很好的應用前景，針對不同食品基質(zhì)中副溶血性弧菌的檢測也有待于學者們的進一步研究。

5 結(jié)論

副溶血性弧菌常見于水產(chǎn)品中[56-57]，用傳統(tǒng)的培養(yǎng)法對食品中的副溶血性弧菌進行檢測一般需要4～5 d，涉及到定量檢測則需要7 d，其檢測流程復雜，對檢測人員要求較高，在可疑菌落挑選方面容易造成人為因素的假陽性或假陰性，此外，5～7 d 的檢測周期，會極大影響水產(chǎn)品的品質(zhì)，增加水產(chǎn)品的貿(mào)易成本，造成經(jīng)濟損失。鑒于傳統(tǒng)培養(yǎng)法的弊端，迫切需要一種快速、靈敏度高、特異性強的食品中副溶血性弧菌的檢測方法。分子生物學方法如PCR、qPCR及LAMP具有檢測靈敏度高、特異性強和耗時短等優(yōu)點，但是上述方法均不能區(qū)分活菌和死菌，用于食品中副溶血性弧菌的檢測容易導致假陽性的結(jié)果。為了解決特異性檢測活菌的難題，有研究者使用了反轉(zhuǎn)錄PCR檢測mRNA的方法，然而由于mRNA提取難度大且易降解，該方法并未廣泛使用。此外也有學者研究表明，mRNA并不能代表活細胞，他們指出，RNA的轉(zhuǎn)錄在細胞死亡后的一段時間仍會進行。EMA/PMA等核酸染料也被應用到食品中活菌的檢測，并得到了眾多學者的認可。近期，研究者們對將EMA/PMA與PCR、qPCR或LAMP等技術(shù)結(jié)合用于食品中活菌的檢測做了廣泛研究，該方法不僅被應用于活菌的定性檢測，也被應用于活菌的定量檢測，不僅適用于單一菌種的檢測，也適用于多種致病菌的混合檢測，不僅被應用于純培養(yǎng)物的檢測，也被應用到各種食品基質(zhì)的檢測。總的來說，這是一種檢測食品中活菌切實有效的手段。值得注意的是，眾多學者對EMA/PMA在E.coli O157 ∶ H7、沙門氏菌（Salmonella）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等食源性致病菌活菌檢測中的應用做了研究和報道，而對于副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）僅有少數(shù)報道，急需廣大學者進一步探索。

PMA-qPCR是目前使用較多的一種方法，具有快速、特異性強、靈敏度高和定量檢測等優(yōu)點;PCR同生物染料結(jié)合也有較高的檢測靈敏度，雖然不及qPCR，但是該方法可以設(shè)計大片段的目的條帶，可以避免紫外線（UV）滅活或其他原因造成的假陽性或假陰性結(jié)果;EMA/PMA-LAMP法檢測靈敏度不及qPCR，但是其操作簡單，適用于大量樣本的處理。

EMA和PMA同作為具有鑒別功能的核酸染料，對其優(yōu)越性的比較也受到了廣大學者的探討。多數(shù)學者認為，EMA在抑制死菌DNA參與PCR擴增的同時，也能穿透部分活菌的細胞膜并抑制其DNA擴增，從而對實際檢測結(jié)果造成偏差。PMA比EMA更適合食品基質(zhì)中活菌的快速檢測。隨著核酸染料在活菌檢測技術(shù)中的成熟發(fā)展，EMA也逐步被PMA替代。食品中副溶血性弧菌活菌快速檢測技術(shù)的研究對PMA的選擇也無可置疑。當然，也有學者指出，PMA存在缺陷：PMA處理時的強光照射會對菌體造成殺傷;當PCR或qPCR的目的片段過短時，易造成PMA與目的片段結(jié)合疏漏，從而導致PMA對死菌DNA的抑制不完全;菌液濃度過高或特殊的成團菌體形態(tài)會影響PMA的穿透力，從而影響PMA的處理效果[16，40，42，52，54，58-61]。但是這些缺點并非不能解決，對于強光引起的高溫殺傷，可以在PMA處理時用冰浴對菌液降溫;對于小目的片段的影響，可以設(shè)計特異性強的引物或設(shè)計巢式PCR;對于菌液濃度及特殊菌體形態(tài)的影響，可以通過稀釋及濾膜過濾分解成團菌體。另外，對于濃度過低或復雜基質(zhì)的情況，可以通過磁珠富集優(yōu)化。此外，對于部分革蘭氏陽性菌細胞膜成分復雜的情況，可以用sodium lauroyl sarcosinate（月桂基巰基乙酸）來增強PMA對死菌細胞膜的通透性。也有學者針對PMA處理工藝進行研究，他們研發(fā)的微流體裝置能簡單、快速地完成PMA標記[62]，為PMA用于食品病原性活菌的快速檢測提供了新的動力?？傊?，PMA在食品中副溶血性弧菌快速檢測中的應用是切實可行的，也應受到廣泛關(guān)注，豐富的水產(chǎn)品種類、不同的水質(zhì)環(huán)境、定性或定量的不同要求以及上述PMA存在的弊端，都有待于廣大學者的進一步研究。

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