伍冰倩　劉妮妮　楊鑫豪　張靚　周澤建　張紅　匡奕敩　趙珩

摘要：為獲得純化的斑馬魚TRIM23（tripartite motif 23）重組蛋白并研究其免疫功能，試驗采用逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）技術(shù)擴增TRIM23全長序列，將其與原核表達載體pGEX-4T-1連接并轉(zhuǎn)化至E.coli Rosetta感受態(tài)細胞，用異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)表達，利用谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（GST）蛋白純化介質(zhì)純化目的蛋白后，將其與嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）孵育，檢測抑菌活性。結(jié)果顯示，重組表達載體pGEX-TRIM23在宿主菌Rosetta中表達出約91 ku的重組蛋白，且蛋白部分以可溶形式存在于上清中，經(jīng)體外抑菌試驗檢測發(fā)現(xiàn)，TRIM23蛋白能夠抑制嗜水氣單胞菌的增殖?；谝陨涎芯浚茰yTRIM23在斑馬魚抗細菌免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮作用。

關(guān)鍵詞：新型免疫分子;TRIM23;斑馬魚;原核表達;嗜水氣單胞菌

中圖分類號： S942.5? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）04-0153-04

近年來，我國的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展，但隨著高密度集約化養(yǎng)殖模式的大面積推廣，魚類疾病時有發(fā)生，其中細菌性疾病暴發(fā)較頻繁，是水產(chǎn)養(yǎng)殖面臨的主要難題之一[1]。嗜水氣單胞菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖中很常見的致病菌，屬于弧菌科（Vibrionaceae）氣單胞菌屬（Aeromonas），它在水環(huán)境中廣泛存在，能感染鯉魚、銀鯽、草魚、青魚及中華鱉等絕大多數(shù)淡水魚類，并可引發(fā)細菌性敗血癥，該魚病危害范圍廣，流行季節(jié)長，可導(dǎo)致魚類大量死亡，造成巨大的經(jīng)濟損失[2]。因此，嗜水氣單胞菌受到廣泛關(guān)注，常作為一種代表性病原菌被用于相關(guān)研究中。

在長期進化過程中，真核生物體內(nèi)逐漸形成了特定的宿主蛋白來抵御病原體的入侵，TRIM（tripartite motif，三結(jié)構(gòu)域蛋白家族）就屬于其中一類，該蛋白幾乎存在于所有多細胞動物中，因N端擁有保守的由1個RING結(jié)構(gòu)域、1個或2個B-box結(jié)構(gòu)、1個卷曲螺旋（coil-coiled）組成的RBCC基序，所以也被稱為RBCC蛋白[3]，許多研究表明，TRIM蛋白具有抗菌、抗病毒功能，能夠參與調(diào)節(jié)相關(guān)免疫信號通路[4]。魚類TRIM蛋白由ftr基因和btr基因編碼，ftr基因起源不明，是魚類所特有的，在病毒侵染下能夠表達編碼蛋白，而btr基因起源于哺乳動物TRIM39的直接同源基因。ftr基因和btr基因編碼的TRIM蛋白種類非常多，僅在斑馬魚中就存在240種[5-6]，但關(guān)于其研究進展緩慢，至今絕大部分魚類TRIM蛋白家族成員的功能還是未知的。

TRIM23蛋白是TRIM蛋白家族成員之一，擁有ARF結(jié)構(gòu)域[7]。目前研究表明，人TRIM23蛋白是免疫信號通路中的重要調(diào)節(jié)因子，參與調(diào)控機體的先天性抗病毒免疫反應(yīng)及炎癥反應(yīng)，Arimoto等發(fā)現(xiàn)病毒侵染細胞時，TRIM23能夠使NEMO分子的K27泛素化，進而激活NF-κB及IRF3信號通路[8];另外，Poole等研究表明，TRIM23通過與巨細胞病毒的基因產(chǎn)物UL144相互作用，能夠加強UL144與TRAF6之間的互作，從而上調(diào)NF-κB的活性[9]。TRIM蛋白在硬骨魚中具有免疫活性，推測TRIM23在魚類免疫方面也起到了作用。因此，本研究以斑馬魚TRIM23為研究對象，構(gòu)建pGEX-TRIM23原核表達載體，對蛋白進行誘導(dǎo)表達及純化，通過將TRIM23與嗜水氣單胞菌在體外孵育，初步研究TRIM23對嗜水氣單胞菌繁殖的影響，為深入研究斑馬魚TRIM23的免疫功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗地點 試驗于2016年6月至2017年9月于中央民族大學生命與環(huán)境科學學院進行。

1.1.2 試驗動物 斑馬魚由筆者所在實驗室繁殖保存，飼養(yǎng)約1周后，解剖分離其腎臟，立即用液氮處理后，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 表達載體及菌株 pGEX-4T-1原核表達載體、嗜水氣單胞菌菌株由筆者所在實驗室保存;E.coli Top10感受態(tài)細胞及E.coli Rosetta（DE3）感受態(tài)細胞均購自天根生化公司。

1.1.4 酶和試劑 TRIzol Reagent，購自拜力生物公司;M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，購自普洛麥格公司;Pfu高保真酶、pEASY-Blunt克隆載體，購自全式金生物公司;限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ、Sal Ⅰ及T4 DNA連接酶，購自NEB公司;Taq聚合酶、DL2000 DNA marker、6×loading buffer，購自TaKaRa公司;質(zhì)粒小量提取試劑盒、凝膠回收試劑盒，購自天根生化公司;預(yù)染蛋白marker，購自Fermentas公司;谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（GST）蛋白純化介質(zhì)，購自碧云天公司;氨芐青霉素、異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、三羧基甲基氨基甲烷（Tris）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、溶菌酶，購自索萊寶科技公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 在GenBank上得到斑馬魚TRIM23基因的全長序列，根據(jù)所得序列，用Prime 5.0軟件設(shè)計合成1對寡核苷酸引物，上游引物包含EcoR Ⅰ酶切位點，序列為5′-CGGAATTCTATGGCCGCTGCTGTCG-3′，下游引物包含Sal Ⅰ酶切位點，序列為5′-GCGTCGACCGGCCACATCCAGAACCC-3′，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.2 斑馬魚TRIM23基因的擴增 取成年斑馬魚的腎臟，用TRIzol法提取腎臟總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，再以cDNA為模板PCR擴增TRIM23全長序列。PCR反應(yīng)體系總體積為 50 μL，含1 μL模板DNA，5 μL 10×buffer，2.5 μL 10 μmmol/L 上游引物，2.5 μL 10 mmol/L下游引物，1.5 μL 2.5 mmol/L dNTP，1 μL Pfu高保真酶，36.5 μL ddH2O。PCR擴增條件如下：94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸4 min，循環(huán)32次;72 ℃延伸10 min，4 ℃終止。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收，連接至pEASY克隆載體，轉(zhuǎn)化到E.coli Top10感受態(tài)細胞中，篩選陽性克隆。

1.2.3 重組載體pGEX-TRIM23的構(gòu)建 利用限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ雙酶切pEASY-TRIM23克隆載體及pGEX-4T-1 表達載體，分別回收純化酶切產(chǎn)物，用T4 DNA連接酶將2個目的片段于16 ℃連接過夜后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coli Top10感受態(tài)細胞，在含有氨芐青霉素（Amp）LB固體培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化菌落，提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶 EcoR Ⅰ 和Sal Ⅰ進行雙酶切驗證，篩選陽性克隆送至北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.4 TRIM23蛋白的誘導(dǎo)表達 將測序正確的pGEX-TRIM23重組載體轉(zhuǎn)化至E.coli Rosetta感受態(tài)細胞中，篩選轉(zhuǎn)化菌落。挑選單克隆接種至含有Amp LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。次日，按1 ∶ 100的比例將培養(yǎng)過夜的菌液轉(zhuǎn)接于200 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min 繼續(xù)培養(yǎng)至D600 nm=0.6左右，加入IPTG，設(shè)置終濃度為0.5、1.0 mmol/L，30 ℃、170 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)5 h。離心收集菌體，加入適當PBS（即磷酸緩沖鹽溶液，含140 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4，1.8 mmol/L KH2PO4，pH值為7.3）重懸，超聲破碎裂解，4 ℃、10 000 r/min 離心20 min，分別取 20 μL 裂解液上清和沉淀進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），檢測融合蛋白的表達情況。

1.2.5 TRIM23蛋白的純化 將收集的菌體重懸于PBS中，加入終濃度為1 mg/mL的溶酶菌，混勻，冰上放置30 min，超聲破碎，然后于4 ℃、10 000 r/min離心20 min，收集上清。往上清中加入平衡好的GST標簽蛋白純化介質(zhì)，4 ℃緩慢搖動60 min后，將混合物裝入1 mL親和層析純化柱中，打開純化柱底部的蓋子，在重力作用下使柱內(nèi)液體流出，洗滌純化柱5次，每次加入2個柱體積的PBS，接著洗脫目的蛋白10次，每次用1個柱體積的洗脫緩沖液[50 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L 谷胱甘肽（GSH），pH值為8.0]，分別收集各穿柱液進行SDS-PAGE檢測。

1.2.6 體外檢測TRIM23蛋白對嗜水氣單胞菌的影響 將嗜水氣單胞菌接種至LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，按1 ∶ 100的比例將培養(yǎng)過夜的菌液轉(zhuǎn)接于100 mL LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃振蕩培養(yǎng)3 h，10 000 r/min離心1 min收集菌體并用TBS（即三乙醇胺緩沖鹽溶液，含50 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaCl，pH值為7.5）沖洗3次，然后用TBS+Ca2+緩沖液（含 10 mmol/L CaCl2的TBS緩沖液）重懸至1×105 CFU/mL，備用。

1.2.6.1 檢測不同濃度TRIM23蛋白對嗜水氣單胞菌的影響 將細菌重懸液分裝到1.5 mL無菌離心管中，每管 100 μL，加入純化的TRIM23蛋白，設(shè)置濃度梯度0、6、12、24、30、36、42 μg/mL，用TBS補足總體積至200 μL，25 ℃孵育3 h，按一定比例稀釋菌液，取50 μL均勻涂布于LB固體培養(yǎng)上，28 ℃培養(yǎng)過夜，計數(shù)。

1.2.6.2 檢測TRIM23在不同時間對嗜水氣單胞菌的影響 將細菌重懸液分裝到1.5 mL無菌離心管中，每管100 μL，加入純化的TRIM23蛋白（蛋白終濃度為30 μg/mL），用TBS補足總體積至200 μL，對照組不加TRIM23蛋白，設(shè)置時間梯度0、1、2、4 h，25 ℃孵育。按一定比例稀釋菌液，取50 μL均勻涂布于LB固體培養(yǎng)上，28 ℃培養(yǎng)過夜，計數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 TRIM23基因的擴增

由圖1可知，以斑馬魚腎臟cDNA為模板進行TRIM23基因的PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到 1 731 bp 的單一條帶，與目的基因大小相符。

2.2 重組載體pGEX-TRIM23的雙酶切鑒定

將重組載體pGEX-TRIM23用EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ雙酶切后，經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖2所示，在接近 2 000 bp 處有1條被切下的條帶，說明TRIM23基因已被連入pGEX-4T-1質(zhì)粒中。對所得陽性克隆進行基因測序，測序結(jié)果表明，連入pGEX-4T-1載體中的TRIM23基因與GenBank中TRIM23基因的堿基序列一致，閱讀框正常，說明原核表達載體pGEX-TRIM23構(gòu)建成功。

2.3 TRIM23蛋白的誘導(dǎo)表達

將重組載體 pGEX-TRIM23 轉(zhuǎn)化到Rosetta感受態(tài)細胞中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)至D600 nm為0.6時，加入終濃度分別為0.5、1.0 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)3 h，收集細菌超聲裂解，分別取裂解液上清和沉淀進行SDS-PAGE檢測。由圖3可知，在泳道3～4和泳道6～7中，95 ku區(qū)域均出現(xiàn)了目的條帶，融合蛋白分子量大小約為91 ku，與預(yù)期目的蛋白大小一致，表明TRIM23蛋白被成功誘導(dǎo)表達，且以可溶性和包涵體的形式分別存在于上清及沉淀中。

2.4 TRIM23蛋白的純化

將收集的菌液用超聲破碎裂解后，離心獲取上清，與GST標簽蛋白純化介質(zhì)孵育，分別取上樣流穿液、洗滌液、洗脫液進行SDS-PAGE分析。由圖4可知，泳道4～5為與GST標簽蛋白純化介質(zhì)孵育后的流穿液，其中未出現(xiàn)目的條帶，說明TRIM23蛋白已經(jīng)特異性結(jié)合到純化介質(zhì)上，經(jīng)PBS多次洗滌純化柱，泳道6中基本不存在明顯雜帶，說明非特異性結(jié)合在純化介質(zhì)上的雜蛋白已經(jīng)被洗脫下來，泳道7～8為蛋白洗脫液，在95 ku區(qū)域內(nèi)均出現(xiàn)明顯條帶，說明TRIM23蛋白被成功洗脫下來。

2.5 TRIM23對嗜水氣單胞菌的影響

2.5.1 不同濃度TRIM23蛋白對嗜水氣單胞菌的影響 將終濃度為0、6、12、24、30、36、42 μg/mL的TRIM23蛋白分別與嗜水氣單胞菌在室溫下孵育3 h，隨后測定活細菌數(shù)，由圖5可知，當TRIM23蛋白濃度≥12 μg/mL時，試驗組的細菌數(shù)量均低于空白對照組，且隨著蛋白濃度的增加，細菌數(shù)量呈現(xiàn)減少的趨勢， 但當?shù)鞍诐舛仍黾又?0 μg/mL時，細菌數(shù)量趨于穩(wěn)定。

2.5.2 TRIM23蛋白在不同時間對嗜水氣單胞菌的影響 將終濃度為24 μg/mL的TRIM23蛋白與嗜水氣單胞菌分別孵育0、1、2、4 h，測定活細菌數(shù)，由圖6可知，在整個孵育過程中，空白對照組及TRIM23處理試驗組的細菌數(shù)均有一定的增長，但孵育1、2、4 h時，TRIM23處理試驗組的細菌數(shù)均低于對照組的細菌數(shù)，說明TRIM23蛋白能夠抑制嗜水氣單胞菌的增殖。

3 討論與結(jié)論

TRIM蛋白的免疫功能近年來一直倍受關(guān)注，研究成果頗豐，如Yap等發(fā)現(xiàn)TRIM5具有限制鼠白血病病毒（murine leukemia virus，簡稱MLV）的能力[10];TRIM56能夠與牛腹瀉病毒（bovine diarrhoea virus，簡稱BDV）的氨基蛋白酶結(jié)合，從而限制BDV的復(fù)制[11];Uchil等全面分析了人類及小鼠中55種具備抗逆轉(zhuǎn)錄病毒活性的TRIM蛋白，發(fā)現(xiàn)其中約有20種擁有干擾逆轉(zhuǎn)錄病毒進入細胞及釋放的能力[12];Gack等研究表明，TRIM25能夠泛素化RIG-I，進而激活RIG-I信號通路[13];TRIM21能夠與PIN1分子的互作，以阻止PIN1與IRF3的結(jié)合，從而增強IRF3的穩(wěn)定性，最終加強Ⅰ型干擾素的表達[14]。但就目前的研究而言，TRIM蛋白免疫功能的研究主要集中在人、小鼠等物種，而關(guān)于魚類的研究報道很少，尚存在大量空白，因此本研究探討斑馬魚TRIM23蛋白表達及其對嗜水氣單胞菌的影響，為深入研究TRIM23的免疫功能提供實踐基礎(chǔ)。

細菌性感染是制約水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的一個重要因素[15]，而嗜水氣單胞菌是引發(fā)淡水魚類敗血癥的主要致病菌，一旦感染魚類，就會造成魚類的大量死亡[16-18]。為了初步研究TRIM23蛋白的免疫功能，筆者利用含有GST融合標簽的pGEX-4T-1原核表達載體進行蛋白的體外表達，獲得純化的TRIM23蛋白后，將其與嗜水氣單胞菌孵育，發(fā)現(xiàn)該蛋白對嗜水氣單胞菌的增殖有一定的抑制作用，這表明TRIM23參與了斑馬魚抗細菌免疫應(yīng)答反應(yīng)，但是其具體的作用機制仍需進一步研究，對人TRIM23的研究表明，其在病毒感染時以泛素連接酶身份參與激活NF-κB信號通路，那么在細菌感染過程中，斑馬魚TRIM23能否同樣參與調(diào)控NF-κB信號通路也有待試驗證實。

本研究構(gòu)建了pGEX-TRIM23原核表達載體，成功獲得了純化的GST-TRIM23融合蛋白，并發(fā)現(xiàn)其能夠抑制嗜水氣單胞菌的增殖，這為探尋與TRIM23相互作用的蛋白，闡明TRIM23參與斑馬魚抗細菌免疫反應(yīng)的機制奠定了良好的基礎(chǔ)。

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