劉偉　王多文　何彩　李強(qiáng)　史星雲(yún)　劉鵬

摘要：以鏈格孢（Alternaria spp.）為靶標(biāo)菌從農(nóng)田土壤中分離到1株芽孢桿菌。通過形態(tài)學(xué)特征、生理生化分析及16S rDNA序列分析等對菌株進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，菌株LKYLW-1為萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus，GenBank登錄號為MF375905）;對鏈格孢的抑菌帶寬為15.8 mm;采用菌絲生長抑制法、孢子萌發(fā)法測定LKYLW-1的抑菌作用，發(fā)現(xiàn)菌株LKYLW-1代謝產(chǎn)物對鏈格孢絲有致畸作用;菌株LKYLW-1發(fā)酵液對孢子萌發(fā)抑制率為96.60%;EC50為6.93 mL/L;飽和度為25%;硫酸銨獲得的抑菌物質(zhì)對鏈格孢的抑菌活性較高，抑菌圈直徑達(dá)42.01 mm。

關(guān)鍵詞：芽孢桿菌;抑菌活性;拮抗;鏈格孢屬靶標(biāo)真菌;形態(tài)學(xué)特征;生理生化分析;16S rDNA序列分析

中圖分類號： S476;S182? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）04-0091-03

多種作物的黑斑病是由鏈格孢屬真菌（Alternaria spp.）引起的[1]，鏈格孢屬真菌會導(dǎo)致作物產(chǎn)量和品質(zhì)受到嚴(yán)重影響，鏈格孢屬真菌同時也是蔬菜貯藏過程中的主要病害菌，能引起多種瓜果、蔬菜的腐敗，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。使用農(nóng)藥能暫時控制黑斑病的大面積傳播，然而其副作用也引起了人們的重視。

生物防治因其對人畜安全、環(huán)境兼容性好、而且不易產(chǎn)生抗藥性而倍受關(guān)注。王繼華等從冷凍菌種甘油中分離到1株芽孢桿菌，能產(chǎn)生抑制鏈格孢真菌的物質(zhì)[3];趙陽國等從土壤中分離出1株枯草芽孢桿菌，該菌對農(nóng)林業(yè)危害真菌鏈格孢菌具有強(qiáng)烈的抑制作用[4]。芽孢桿菌防治植物病害的作用機(jī)制主要有與病原菌競爭營養(yǎng)和生態(tài)位點、分泌抗菌物質(zhì)抑制病原菌的生長以及激發(fā)植物系統(tǒng)抗病性[5]。本研究通過形態(tài)學(xué)特征、生理生化分析及16S rDNA序列分析等方法，鑒定出1株從農(nóng)田土壤中分離到的芽孢桿菌，能夠強(qiáng)烈抑制鏈格孢屬真菌的生長。

1 材料與方法

1.1 材料

供試鏈格孢：本研究用菌由甘肅省釀酒葡萄苗木快繁工程技術(shù)研究中心葡萄病理實驗室保存、提供。

土壤樣品：從甘肅省武威市林業(yè)科學(xué)研究院采集農(nóng)田土壤30份。

培養(yǎng)基：溶菌肉湯（LB）固體培養(yǎng)基用于分離和保存分離的芽孢桿菌;LB液體培養(yǎng)基用于發(fā)酵分離芽孢桿菌;馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基用于對峙培養(yǎng)。

試驗時間：2016年8月。

1.2 方法

1.2.1 土壤拮抗芽孢桿菌的分離和篩選 芽孢桿菌的分離采用稀釋涂布法[6]。將采集的土樣稱取10 g，加入裝有 90 mL 無菌水并放有玻璃珠的250 mL錐形瓶中，80 ℃水浴30 min，再充分振蕩30 min，10倍倍比稀釋，涂布分離。純化的細(xì)菌經(jīng)革蘭氏染色和芽孢染色，顯示菌體呈桿狀、產(chǎn)芽孢、G+的分離物為芽孢桿菌。將分離得到的芽孢桿菌進(jìn)行編號，觀察菌落形態(tài)。

采用平板對峙法進(jìn)行拮抗芽孢桿菌的篩選，將已培養(yǎng)3 d的鏈格孢用5 mm打孔器打孔，將菌餅移到PDA培養(yǎng)基中央，28 ℃培養(yǎng)24 h后，在離真菌等距離的四周接上待測芽孢桿菌，28 ℃培養(yǎng)4 d后，測量抑菌帶的寬度，篩選效果最好的1株芽孢桿菌進(jìn)行研究[7-8]。

1.2.2 拮抗芽孢桿菌的抑菌活性測定 對鏈格孢菌絲影響的研究采用平板對峙法[9]，在PDA平板中央接鏈格孢菌餅，在距離中心3 cm的兩側(cè)接種培養(yǎng)48 h且生長良好的拮抗芽孢桿菌，28 ℃倒置培養(yǎng)4 d。觀察靠近芽孢桿菌抑菌圈邊緣菌絲的生長情況，以遠(yuǎn)離拮抗芽孢桿菌的邊緣菌絲為對照，顯微觀察菌絲的生長情況。

拮抗芽孢桿菌無菌發(fā)酵濾液的制備：將發(fā)酵液經(jīng) 10 000 r/min 離心過濾，0.22 μm濾膜過濾除菌得到無菌發(fā)酵液。將鏈格孢孢子制備成孢子懸浮液（400倍顯微鏡下，每個視野中可看到20個孢子），將制備好的拮抗芽孢桿菌無菌發(fā)酵液與病原菌孢子配制成0、50、100、200、500 mL/L系列濃度的孢子懸浮液，以清水為對照，每個處理3次重復(fù)。28 ℃恒溫培養(yǎng)8～10 h，檢查對照處理的孢子萌發(fā)情況（以孢子芽管長度大于孢子短半徑時判為萌發(fā)），孢子萌發(fā)抑制率=（對照孢子萌發(fā)率-處理孢子萌發(fā)率）/對照孢子萌發(fā) 率×100%[10-11]。

1.2.3 拮抗芽孢桿菌的鑒定

1.2.3.1 菌體形態(tài)、培養(yǎng)特征觀察及生理生化指標(biāo)測定參照柳鳳等的方法[12]。

1.2.3.2 16S rDNA基因序列測定及其系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建參照Todorov等的方法[13] 提取細(xì)菌基因組DNA為模板，以7f（5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′）和1 540r（5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′）[生工生物工程（上海）股份有限公司合成]為上、下游引物，擴(kuò)增菌株的16S rDNA。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送往該公司進(jìn)行序列測定，測序結(jié)果用Blast軟件在GenBank中進(jìn)行同源性比較，并提交注冊登錄號，進(jìn)行序列分析。

1.2.4 拮抗芽孢桿菌抑菌物質(zhì)的提取 將拮抗芽孢桿菌LKYLW-1接種到LB液體培養(yǎng)基中，對照為LB液體培養(yǎng)基，28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，10 000 r/min離心 20 min，去菌體，加入不同質(zhì)量濃度的硫酸銨，使硫酸銨飽和度分別為10%、20%、25%、30%、35%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%，4 ℃下靜置沉淀24 h，棄上清，沉淀用25 mmol/L磷酸緩沖液溶解，透析脫鹽后與鏈格孢對峙培養(yǎng)，5 d后用濾紙片法[14]測定抑菌圈大小。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 16.0軟件、Duncans方法對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗芽孢桿菌的篩選結(jié)果

2.1.1 拮抗芽孢桿菌的篩選 從甘肅省武威市林業(yè)科學(xué)研究院農(nóng)田30份土壤中，分離得到151株芽孢桿菌。經(jīng)鏈格孢篩選后，得到抗鏈格孢活性較強(qiáng)的芽孢桿菌3株，其中LKYLW-1菌株對鏈格孢的拮抗活性較好，抑菌帶寬為 15.8 mm，如圖1所示。故后續(xù)試驗均以LKYLW-1菌株為拮抗菌。

2.2 LKYLW-1的抑菌活性

2.2.1 對鏈格孢菌絲生長的影響 圖2結(jié)果顯示，對照菌絲生長細(xì)長而均勻，細(xì)胞結(jié)構(gòu)較為清晰，并無膨大畸形現(xiàn)象（圖2-a）。LKYLW-1菌株主要使菌絲體膨大變粗，生長畸形，菌絲頂端和分枝處較為膨大;菌絲分枝增多，粗而短;菌絲體內(nèi)部細(xì)胞原生質(zhì)體分布不均勻，濃縮成不規(guī)則體，部分菌絲內(nèi)有原生質(zhì)流出形成空殼的現(xiàn)象（圖2-b）。

2.2.2 對鏈格孢孢子萌發(fā)的抑制作用 由圖3可知，無菌發(fā)酵液對孢子萌發(fā)有明顯的抑制作用，孢子萌發(fā)抑制率為 96.60%，EC50為6.93 mL/L。

2.2.4 LKYLW-1菌株的鑒定

2.2.4.1 菌株LKYLW-1培養(yǎng)性狀、形態(tài)學(xué)特征及生理生化特征 在LB固體培養(yǎng)基上，LKYLW-1菌落呈乳白色、不透明、菌落光滑、中間凹陷、邊緣隆起。透過電鏡顯示 LKYLW-1 呈桿狀，長約2 μm，革蘭氏陽性，周生鞭毛，芽孢呈橢圓形（圖4）。將菌株LKYLW-1的形態(tài)特征和生理生化特性（表1）與《常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》中有關(guān)細(xì)菌的描述進(jìn)行比較，確定此菌株為芽孢桿菌屬，菌株基本可以確定為萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus）。

2.2.4.2 16S rDNA序列分析 以LKYLW-1基因組DNA為模板，用引物7f和1 540r進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測得該菌株的16S rDNA核苷酸序列長度為1 492 bp，GenBank登錄號為MF375905。將該序列與GenBank中的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行相似性分析，結(jié)果表明，與親緣關(guān)系相近的前100個序列全為芽孢桿菌屬;前20個序列中， 有13株為萎縮芽孢桿菌菌株;且菌株LKYLW-1與它們都具有99%以上的同源，其中與萎縮芽孢桿菌（登錄號：CP022653.1、CP021500.1、KR085882.1、CP011802.1、CP010778.1、CP007640.1、KF751643.1、CP002207.1）的同源性最高，達(dá)到了100%。綜合生理生化特征將其鑒定為萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus）LKYLW-1。

2.2.5 LKYLW-1菌株的抑菌物質(zhì)對鏈格孢的抑菌活性 由表2可知，菌株LKYLW-1能夠分泌胞外抑菌物質(zhì)，在硫酸銨飽和度≥35%時無沉淀析出，即對鏈格孢無抑菌活性，而硫酸銨飽和度為10%～30%時，獲得的抑菌物質(zhì)對鏈格孢均具有抑菌活性，但抑菌活性不同。其中，硫酸銨飽和度為25%時獲得的抑菌物質(zhì)抑菌圈直徑最大，即抑菌活性最高，抑菌圈直徑達(dá)42.01 mm（圖5）。

3 結(jié)論與討論

本研究從農(nóng)田土壤中分離篩選出拮抗芽孢桿菌，一方面增大了成功篩選出拮抗菌的可能性，另一方面將其施用于作物時無毒無害。芽孢桿菌是自然界中廣泛存在的一種非致病性細(xì)菌，能產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，其中大部分是多肽，主要抑制革蘭氏陽性菌，有些還能抑制霉菌、革蘭氏陰性菌和酵母[15]。本研究中LKYLW-1菌株在距離鏈格孢中心3 cm的2側(cè)接種培養(yǎng)48 h后，可使菌絲體膨大變粗，生長畸形;菌絲體內(nèi)部細(xì)胞原生質(zhì)體分布不均勻，濃縮成不規(guī)則體，部分菌絲內(nèi)有原生質(zhì)流出形成空殼的現(xiàn)象，最終可能會導(dǎo)致菌絲不能正常分化產(chǎn)生孢子，影響其繁殖，不過抑菌機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

本研究的目的是通過篩選找到對鏈格孢有明顯拮抗作用的菌株，并對其進(jìn)行初步研究，拓寬了鏈格孢拮抗菌的篩選范圍，為今后鏈格孢引起的病害生物防治奠定了基礎(chǔ)。今后將對菌株LKYLW-1進(jìn)行深入研究，包括發(fā)酵條件優(yōu)化，拮抗蛋白的分離、提取，以及拮抗蛋白的純化測序等，使其商品化生產(chǎn)。

參考文獻(xiàn)：

[1]王岱峰. 南美洲首次發(fā)現(xiàn)由番薯生鏈格孢引起的甘薯葉斑病和莖枯病[J]. 園藝與種苗，1995（6）：44-45.

[2]曹健康. 杏采后黑斑病潛伏侵染時期、機(jī)制及控制[D]. 蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2002.

[3]王繼華，李 晶，楊茹冰，等. 一株拮抗鏈格孢（Alternaria spp.）抗生素產(chǎn)生菌研究[J]. 哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)報，2006，38（9）：1594-1596，1604.

[4]趙陽國，任南琪，程玉鵬. 一株芽孢桿菌的分類鑒定及其抑菌產(chǎn)物特性[J]. 微生物學(xué)雜志，2006，26（6）：1-6.

[5]Lugtenberg B，Kamilova F. Plant-growth-promoting rhizobacteria[J]. Annual Review of Microbiology，2009（1）：541-556.

[6]Niemann H，losekann T，de Beer D，et al. Novel microbial communities of the Haakon Mosby mud volcano and their role as a methane sink[J]. Nature，2006，443（5227）：854-858.

[7]周棱波，黎定軍，陳 武，等. 煙草赤星病拮抗菌的篩選[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011（3）：100-101，104.

[8]儲慧清，方敦煌，孔光輝，等. 拮抗菌AM6代謝產(chǎn)物防治煙草赤星病試驗[J]. 煙草科技，2004（4）：42-44.

[9]李愛榮，安德榮. 兩株生防熒光假單胞桿菌的室內(nèi)篩選試驗[J]. 微生物學(xué)雜志，2003，23（4）：11-13.

[10]慕立義，吳文君，王開運(yùn). 植物化學(xué)保護(hù)研究方法[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1997.

[11]吳文君. 植物化學(xué)保護(hù)實驗技術(shù)指導(dǎo)[M]. 陜西：陜西科學(xué)與技術(shù)出版社，1998.

[12]柳 鳳，歐雄常，何 紅，等. 紅樹內(nèi)生菌AmS2菌株對芒果炭疽病菌的抑制作用[J]. 植物保護(hù)學(xué)報，2010，37（5）：453-458.

[13]Todorov S D，Meincken M，Dicks L M T. Factors affecting the adsorption of bactcriocins ST194BZ and ST23LD to Lactobacillus sakei and Enterococcns sp.[J]. Journal of General and Applied Microbiology，2006，52：159-167.

[14]單文榮，李俊霞，劉花粉. 濾紙片法篩選不同活性物對棉花黃萎病菌抑制效果研究[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，2010，26（19）：285-289.

[15]劉 靜，王 軍，姚建明，等. 枯草芽孢桿菌JA抗菌物特性的研究及抗菌肽的分離純化[J]. 微生物學(xué)報，2004，44（4）：511-513. 賈橋東，張保全，王衛(wèi)民，等. 煙草白粉病的研究進(jìn)展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（4）：94-97.