莊倩倩　 陳少鵬　 劉洪章

摘要：利用RACE技術、Genome Walking技術及PCR技術，從紫萼玉簪中克隆得到長度分別為336、1 320 bp的GASA基因HvGASA和脂肪酸去飽和酶基因HvFAD的cDNA全長序列，分別編碼111、399個氨基酸，其中HvFAD基因所編碼的蛋白為跨膜蛋白。qRT-PCR分析結果表明，2條基因隨自然地溫的降低均上調表達，而且在地溫降至3 ℃時發(fā)生劇烈的表達量變化，說明HvGASA、HvFAD基因與紫萼玉簪的抗寒性具有密切關系。

關鍵詞：紫萼玉簪;HvGASA基因;HvFAD基因;基因克隆;基因表達;抗寒性

中圖分類號： S682.1+90.1? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）04-0055-06

紫萼玉簪（Hosta ventricosa）又稱紫花玉簪、紫玉簪，為百合科玉簪屬多年生宿根草本植物，在我國主要分布于東北、華東、西南、廣西等地[1]，自然生長于林下、溪邊。紫萼玉簪花紫色、無香味，葉卵圓形，有較高的觀賞價值，作為重要的觀賞植物被廣泛應用于園林地被、花境及盆栽。玉簪屬其他植物觀賞性狀豐富，如具有白色花朵、花朵具有香氣等，但這些玉簪屬植物多數不耐寒，無法在東北地區(qū)自然越冬，這嚴重阻礙了玉簪屬植物在東北地區(qū)的應用推廣，然而紫萼玉簪具有極耐寒的特性，是唯數不多的能夠在東北地區(qū)自然越冬的玉簪屬植物之一，故推測紫萼玉簪具有其他玉簪屬植物所不具備的抗寒相關基因及抗寒機理。本研究通過探究紫萼玉簪中與抗寒功能相關的基因，為今后摸清紫萼玉簪的抗寒機理及利用分子育種方法進行抗寒玉簪新品種培育提供參考。

GASA（gibberellic acid-stimulated Arabidopsis）基因家族最早在擬南芥中發(fā)現(xiàn)[2]，后來在很多其他植物中發(fā)現(xiàn)了與其相似的蛋白，如水稻（Oryza sativa）OsGASR1基因和OsGASR2基因[3]、草莓（Fragaria ananassa）GAST1-like基因、矮牽牛（Petunia hybrida）GIP基因[4]等。GASA編碼基因數量眾多，大多數成員受赤霉素（GA）調控[5]。GASA蛋白又稱Snakin蛋白，是一類CRP（cysteine-rich peptides）蛋白。CRP蛋白是植物中富含半胱氨酸的小分子多肽，其在植物生長發(fā)育和逆境反應中具有重要的作用[6]。GASA蛋白中富含半胱氨酸，半胱氨酸是形成二硫鍵所必需的，而二硫鍵的形成對維持蛋白質空間構象的穩(wěn)定具有非常重要的作用。GASA蛋白在低溫、高鹽等非生物脅迫應答中具有重要作用，此外也參與多項生長發(fā)育活動，如種子萌發(fā)、根的形成、莖的生長、花和果實發(fā)育及蟲害、病菌等生物脅迫，在激素信號轉導等過程中亦發(fā)揮重要的調控作用[7]。

脂肪酸去飽和酶（fatty acid desaturase，F(xiàn)AD）是不飽和脂肪酸合成途徑中重要的酶物質，F(xiàn)AD基因是油酸合成的關鍵酶基因。當植物處于低溫環(huán)境時，F(xiàn)AD通過調節(jié)脂肪酸不飽和度來調節(jié)膜的流動性[8]，保護膜結構不受破壞，從而達到提高植物抗寒性的作用。目前FAD基因在許多植物中被發(fā)現(xiàn)及研究，其中有關抗寒性研究的植物種類也很多，包括馬齒莧、棉花、橄欖、白蕓豆、馬鈴薯等[9]。此外，不飽和脂肪酸與植物的抗旱[10]、耐鹽[11]、抗重金屬、抗病、細胞識別以及組織免疫等方面也密切相關[12-13]。

1 材料與方法

1.1 材料采集與處理

從2015年9月15日至11月24日，隨著長春地區(qū)由秋季轉入冬季，氣溫及地溫逐漸降低，每隔7 d于當日07：00進行采樣，每次采集的樣品依次編號為A～K。每次采樣對校園內同地點種植的紫萼玉簪根系進行采集，并測定實時地溫（距離地表10 cm處），記錄當天最高及最低氣溫，將根系泥土用去離子水沖洗干凈，吸干表面的水分，液氮速凍后置于 -80 ℃ 冰箱保存，具體采樣的氣候條件見表1。

1.2 DNA提取、總RNA提取、完整性檢驗及反轉錄cDNA

紫萼玉簪根系總DNA提取采用改良CTAB法[14]，總RNA提取使用RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA、RNA的完整性、降解程度及是否存在污染，采用超微量紫外光分光光度計測定二者濃度。采用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒（TaKaRa公司）將提取的紫萼玉簪根系RNA進行反轉錄cDNA，制備好的cDNA置于-20 ℃冰箱保存。

1.3 HvGASA、HvFAD基因的克隆

筆者所在課題組前期進行了紫萼玉簪轉錄組測序工作，建立了以抗寒性為基礎的轉錄組數據庫，測序材料為紫萼玉簪的根系。在轉錄組測序數據庫中篩選出2條功能注釋與GASA、FAD相關的差異表達基因（differentially expressed gene，DEG）進行下一步分析，序列在測序數據庫中的ID分別為c18557.graph_c0、c60584.graph_c0。在美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）數據庫中進行BLASTp比對，發(fā)現(xiàn)c18557.graph_c0蛋白序列與石刁柏（Asparagus officinalis）的AoGASA基因（XP_02027448.1）及大蒜（Allium sativum）AsGASA基因（AEX55233.1）分別具有66%、59%的一致性，故命名為HvGASA基因;c60584.graph_c0蛋白序列與石刁柏的脂肪酸去飽和酶AoFAD（XP_0202441744.1）具有85%的一致性，故命名為HvFAD基因。

以紫萼玉簪根系cDNA為模板，采用3′RACE及5′ Genome Walking的方法進行HvGASA、HvFAD基因ORF全長克隆，試驗具體操作方法詳見3′-Full RACE Core Set with PrimeScriptTM RTase（TaKaRa公司）使用說明書及Genome Walking Kit（TaKaRa公司）使用說明書。使用Primer 5.0進行引物設計，并委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行引物合成及測序，引物信息見表2。

1.4 生物信息學分析

利用Ex PASy-Prot Param和Ex PASy-Prot Scale在線分析氨基酸序列的疏水性和理化性質。通過Expasy網站（http：//www.expasy.org/）將該cDNA序列翻譯為氨基酸序列。通過NCBI網站的在線BLAST分析工具（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中的BLASTp工具對核苷酸序列進行比對庫檢（比對數據庫選擇NR，替換計分矩陣選擇BLOSUM62，其他采用默認參數），檢索與該蛋白序列相似度較高的序列。然后選取比對結果中E-value較低且Querycover較高的序列，用CLUSTX2進行多序列比對。采用Signal P4.1預測其是否具有信號肽。將多序列比對結果輸出為NEXUS格式，用PUAP 4.0和Modeltest 3.7檢驗最優(yōu)的氨基酸替換模型，然后在GTR+I+G（廣義時間可逆）模型下用最大似然法構建進化樹。在NCBI網站使用BLASTp程序進行庫檢，數據庫采用PDB，搜索結果與目的基因氨基酸序列相似性較高且已知蛋白晶體的序列，并選擇與目的基因相似度較高且分辨率較高的3個晶體結構作為參考，然后用Modeller 9.1軟件，構建三維結構。用PSORT Ⅱ在線分析軟件對蛋白質序列進行分析。

1.5 qRT-PCR表達量分析

qRT-PCR使用的引物序列見表2，以報道的Actin基因為內參基因[15]，設置3次重復試驗。試驗試劑采用SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ（Tli RNaseH Plus）（TaKaRa公司），儀器使用7300 Fast Real Time PCR System（ABI公司）。

2 結果與分析

2.1 總DNA提取、總RNA提取及檢驗

紫萼玉簪根系總DNA提取凝膠電泳結果見圖1，D260 nm/D280 nm為1.925，DNA濃度為486 μg/μL。根系總RNA的凝膠電泳結果見圖2，D260 nm/D280 nm為2.031，RNA濃度為 209 μg/μL。

2.2 HvGASA、HvFAD基因的克隆

用3′RACE和5′Genome Walking的方法進行HvGASA、HvFAD基因3′末端和5′末端的克隆，PCR凝膠電泳檢測結果見圖3，切膠回收測序后，利用DNAMAN進行全長序列拼接后，再進行Blast序列比對，獲得具有完整ORF框的2條基因序列：HvGASA（336 bp，圖3-a）、HvFAD（1 320 bp，圖3-b）。

2.3 生物信息學分析

2.3.1 HvGASA基因

2.3.1.1 理化性質分析、多序列比對 HvGASA基因的序列全長為336 bp，編碼的蛋白質全長111個氨基酸，分子量為27.95 ku，等電點（pI）為5.24。利用推測的HvGASA氨基酸序列在NCBI數據庫中進行BLASTp搜索，并從其序列比對結果中挑選相似性較高的12條GASA蛋白序列，進一步與HvGASA進行多序列比對，結果如圖4所示。通過SMART網站及ExPASy-ProtScale網站對氨基酸序列進行分析，發(fā)現(xiàn)GASA蛋白N端1～23個氨基酸為信號肽序列（圖4中方框區(qū)域），C末端具有由12個半胱氨酸殘基組成的高度保守的GASA結構域（圖4中箭頭所指部位），兩者之間是極性氨基酸殘基組成的可變親水區(qū)域，黑色背景區(qū)域為保守性較高區(qū)域。

2.3.1.2 構建進化樹 利用PUAP 4.0對13條GASA蛋白序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)GASA蛋白可被分為2大類（圖5），其中桐油樹（Jatropha curcas，NP_001295614.1 ）、毛果楊（Populus trichocarpa，XP_002307720.1）、蕪菁（Brassica rapa，XP_009112561.1）、巨桉（Eucalyptus grandis，XP_010060208.1）、芝麻（Sesamum indicum，XP_011092868.1）等8條序列聚為一類;HvGASA與石刁柏（Asparagus officinalis，XP_020274408.1）、大蒜（Allium sativum，AEX55233.1）關系較近，與鐵皮石斛（Dendrobium catenatum，XP_010688394.1）、甜菜（Beta vulgarias，XP_010690459.1）聚為一類。

2.3.1.3 蛋白質三級結構預測 用Modeller 9.1軟件構建三維結構，構建出的HvGASA蛋白三維結構如圖6所示。

2.3.1.4 亞細胞定位分析 用PSORTⅡ在線分析軟件對蛋白質序列進行分析，得到HvGASA蛋白的亞細胞定位結果為39.1%的可能性在線粒體，30.4%的可能性在細胞外，17.4%的可能性在細胞核內，8.7%的可能性在細胞漿，4.3%的可能性在囊泡中。

2.3.2 HvFAD基因

2.3.2.1 理化性質分析、多序列比對 HvFAD基因的序列全長為1 320 bp，編碼399個氨基酸，具有3個跨膜結構，說明FAD是跨膜蛋白，分子量50.98 ku，等電點（pI）為8.85。利用推測的HvFAD基因編碼的氨基酸序列在NCBI數據庫中進行BLASTp搜索，并從其序列比對結果中挑選相似性較高的12條FAD蛋白序列，進一步與HvFAD的編碼氨基酸進行多序列比對。多序列比對結果如圖7所示，圖中方框標識區(qū)域為該基因的3個跨膜結構，黑色背景區(qū)域為保守性較高區(qū)域。

2.3.2.2 構建進化樹 HvFAD基因與石刁柏（Asparagus officinalis，XP_020241744.1）100%同源，與菠蘿（Ananas comosus，XP_020082614.1）、小果野蕉（Musa acuminata，XP_00938546.1）、油棕（Elaeis guineensis，XP_010942103.1）、海棗（Phoenix dactylifera，XP_008799646.1）聚為一類，詳見圖8。

2.3.2.3 蛋白質三級結構預測 用Modeller 9.1軟件構建三維結構，構建出的HvFAD蛋白三維結構如圖9所示。

2.3.2.4 亞細胞定位分析 用PSORTⅡ在線分析軟件對蛋白質序列進行分析，得到該蛋白的亞細胞定位結果為55.6%可能性定位于內質網，44.4%可能性定位于線粒體。這與報道中EuFAD3-1（杜仲，Eucommia ulmoides）基因通過亞細胞定位發(fā)現(xiàn)其編碼的蛋白質定位于內質網的結果[16]相似。

2.4 qRT-PCR分析表達量

通過qRT-PCR試驗，獲得HvGASA、HvFAD基因在紫萼玉簪入冬自然降溫過程中的表達量變化，結果見圖10。

2.4.1 HvGASA基因qRT-PCR分析 通過qRT-PCR試驗發(fā)現(xiàn)，紫萼玉簪中GASA基因的表達量在入秋降溫過程中有3個明顯的降溫階段（17.2～11.5、11.5～3、3～-1.0 ℃），HvGASA基因表達量均呈現(xiàn)上升趨勢，而最后一次降溫中HvGASA基因上調表達的幅度明顯大于前2個階段降溫，說明3 ℃低溫對紫萼玉簪產生了較明顯的脅迫作用，致使HvGASA基因大量表達以抵御逆境脅迫，而當降溫程度減弱甚至稍有回升時，HvGASA基因表達量又表現(xiàn)出下調趨勢。

2.4.2 HvFAD基因qRT-PCR分析 紫萼玉簪FAD基因在入秋降溫過程中有3個明顯的降溫階段（17.2～11.5、11.5～3、3～-1.0 ℃），HvFAD基因表達量均呈現(xiàn)上升趨勢，且 11.5～3 ℃的降溫幅度中，HvFAD基因上調表達幅度最明顯。

3 討論

GASA編碼基因數量眾多，不同的GASA基因家族成員可以具有相同或相反的功能，甚至同一GASA基因家族成員具有多種生物學功能。本研究通過低溫差異背景下進行的轉錄組測序，經Unigene組裝及差異表達基因分析、基因功能注釋等工作，從測序數據庫中篩選得到HvGASA基因。曾有文獻報道GASA基因與環(huán)境溫度相關，Ko等研究表明，擬南芥GASA4基因的表達與溫度有關，研究發(fā)現(xiàn)該基因與玉米（Zea mays）的耐熱基因TTO 6（Thermo-tolerance 6）存在69%的相似性;GASA4基因過表達下，轉基因擬南芥植株的抗熱性顯著增強，認為可能是GASA4蛋白作為胞外熱擊信號分子或者作為分子伴侶通過穩(wěn)定內質網上的與熱擊因子HSE（heat shock element）有關的BiP蛋白（binding protein），從而提高了轉基因植株的耐熱性[17]。張強等研究發(fā)現(xiàn)，大馬士革玫瑰（Rosa damascena）的GASA4-like基因與擬南芥（Arabidopsis thaliana）GASA4氨基酸及玉米耐熱基因TTO6氨基酸均有較高的相似性。通過對GenBank的Blast分析及基因序列分析發(fā)現(xiàn)，大馬士革玫瑰GASA4-like基因與高溫和鹽脅迫下誘導表達的基因高度同源，其序列中發(fā)現(xiàn)了多個MYB、MYC轉錄因子識別位點和誘導抗性響應基因轉錄的W-box，表明GASA4-like的蛋白可能也參與了植物的抗性調節(jié)過程[18]。本試驗中發(fā)現(xiàn)，自然降溫過程中HvGASA基因會隨著降溫而發(fā)生上調表達，且降溫幅度大，表達量上調幅度也增加，而當溫度略有回升時，HvGASA基因發(fā)生下調表達，說明紫萼玉簪GASA基因與植物抗寒性具有密切的關系，并成正向相關，而玉簪的GASA基因是否還參與系統(tǒng)發(fā)育等方面的建成，還有待于進一步研究。

植物受低溫脅迫時引起的受害反應主要是由于低溫破壞了細胞膜系統(tǒng)的結構和流動性，而脂肪酸是細胞膜脂的主要成分，適當的增加植物體內不飽和脂肪酸的比例，可明顯提高植物的抗寒性。根據雙鍵的位置和功能等可將不飽和脂肪酸分為ω-3和ω-6 2種類型[19]，目前對ω-3脂肪酸去飽和酶基因研究多集中在FAD3基因，據文獻報道該基因已從紫蘇（Perilla frutescens）等植物中成功分離克隆出來，經試驗驗證該基因的過量表達可顯著提高植物體內不飽和脂肪酸的比例，而提高植物的抗寒性[20]。ω-3脂肪去飽和酶屬于膜結合脫氫酶，有研究表明，擬南芥的脂肪酸脫氫酶基因FAD3和FAD7基因在常溫下可正常表達，而FAD8基因只有在溫度≤20 ℃ 時才表達[19]。本試驗中HvFAD基因隨自然降溫而發(fā)生上調表達，原因是FAD基因上調表達的結果是增加了不飽和脂肪酸的含量，從而提高膜脂的流動性，最終使得植物的耐凍性得到提高。有研究證明，脂肪酸的代謝和修飾在細胞的內質網或胞質中進行[21]，本研究中對紫萼玉簪的FAD基因的亞細胞定位預測結果與之相符合。

通過上述2條與抗寒相關基因在不同地溫環(huán)境中表達量分析發(fā)現(xiàn)，2條基因均在3 ℃附近表現(xiàn)出明顯的表達量變化，由此可推測紫萼玉簪根系對于3 ℃以上低溫環(huán)境不敏感，3 ℃ 以上低溫對紫萼玉簪根系組織的影響相對較小，而3 ℃以下的低溫會明顯影響其正常生理活動，致使大量抗寒相關基因迅速發(fā)生表達量變化，以達到抵御低溫所帶來的危害。

4 結論

從紫萼玉簪中克隆得到HvGASA、HvFAD基因的cDNA全長序列，長度分別為336、1 320 bp，分別編碼111、399個氨基酸，其中HvFAD基因所編碼的蛋白為跨膜蛋白。qRT-PCR分析結果表明，2條基因隨自然地溫的降低均發(fā)生上調表達，而且在地溫降至3 ℃時發(fā)生劇烈的表達量變化，說明HvGASA和HvFAD與紫萼玉簪的抗寒性具有密切的關系。

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