劉暢 吳長景 竇愷 劉志華 何正權(quán) 張福麗 龐麗 宋昊躍 葛紅蓮

摘? ? 要：為探究棘孢木霉CBS 433.97（Trichoderma asperellum CBS 433.97）的活性代謝產(chǎn)物在促進植物生長與抑制病原菌等方面的功能，本研究初步分離了棘孢木霉代謝產(chǎn)物，并分析了其活性成分對尖孢鐮刀菌MC-1和CS-5的抑菌效果，同時研究了棘孢木霉代謝產(chǎn)物中的活性成分對小麥的株高、根長和發(fā)芽率的影響。用不同的萃取劑萃取棘孢木霉發(fā)酵液中的活性成分，正丁醇萃取相獲得的粗提物對MC-1與CS-5的抑菌效果最好。進一步對正丁醇萃取相獲得的粗提物進行薄層層析，獲得了4個組分TA1，TA2，TA3和TA4，4個組分對MC-1與CS-5均無明顯抑制作用，但組分TA3在濃度為1 g·L-1時，對小麥生長具有明顯的促進作用。由此可見，棘孢木霉CBS 433.97代謝產(chǎn)物中具有能夠抑制病原菌的生長、促進植物生長發(fā)育的活性成分，具有較好的開發(fā)潛力。

關(guān)鍵詞：棘孢木霉;抑菌;促生長;活性代謝產(chǎn)物;初步分離

中圖分類號：S476? ? ? ? ? ? 文獻標(biāo)識碼：A? ? ? ? ?DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2019.07.001

Abstract： To explore the functions of active metabolites of Trichoderma asperellum CBS 433.97 on promoting plants growth and inhibitting phytopathogen， the metabolites were separated preliminarily， and the inhibitions of active components on Fusarium oxysporum MC-1 and Fusarium oxysporum CS-5 ， as well as the effects of the active components from T. asperellum CBS 433.97 metabolites on plant height， root length and germination rate of wheat were analyzed. The active components of the fermentation broth from T. asperellum CBS 433.97 were extracted with different ectracting agent， the crude extracts obtained by the n-butanol extraction phase had the best inhibitory effect on MC-1 and CS-5. The crude extracts from the n-butanol phase were further extracted by TLC， and four components， TA1， TA2， TA3 and TA4， were obtained. The four components had no significant inhibitory effect on MC-1 and CS-5. However， component TA3 of 1 g·L-1 significantly promoted germination and growth of wheat. The results showed that the metabolites of T. asperellum CBS 433.97 possessed active components that could inhibit phytopathogen， as well as promote growth and development of plants. Therefore， this Trichoderma strain has good development potential.

Key words： Trichoderma asperellum; inhibition; growth promotion; active metabolites; prefractionation

植物根際促生微生物是植物生長體系中不可缺少的一環(huán)，這些微生物能夠促進植物生長及營養(yǎng)吸收，甚至能保護植物免受病蟲害侵襲[1-2]。由于世界人口不斷增加，以及城市發(fā)展和氣候變化等因素導(dǎo)致了可耕地不斷縮減，實際生產(chǎn)中，人們在需要更多糧食的同時還要減少資源投入[3]。而微生物資源的利用在有效解決當(dāng)前這一問題的同時，有利于土壤的改良[4]。

近年來，真菌代謝產(chǎn)物逐漸成為了生物藥劑與農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中生物農(nóng)藥和肥料研發(fā)的重要來源[5-7]。作為一種非致病性腐生真菌，木霉菌（Trichoderma spp.）是世界上著名的生防因子，可以寄生于植物根系，促進根系生長發(fā)育，提高植物對病蟲害的抗性，目前為止代謝產(chǎn)物已廣泛應(yīng)用于植物的生物防治中[8-9]。相關(guān)研究表明，木霉菌代謝產(chǎn)物具有抵抗植物病原菌、調(diào)節(jié)植物生長、促進植物根系發(fā)育與細胞活力等功能[10-12]。隨著木霉菌次級代謝產(chǎn)物在植物保護與生物防治中的潛力被挖掘出來，對未來農(nóng)業(yè)科技發(fā)展將具有重大意義[13]。但與鏈霉菌等真菌相比，木霉菌代謝產(chǎn)物研究及產(chǎn)品開發(fā)還相對較少。因此，本研究預(yù)對棘孢木霉CBS 433.97代謝產(chǎn)物進行初步分離，并對這些代謝產(chǎn)物的抑菌活性及促植物生長功能進行了分析，以期為木霉菌來源的生物農(nóng)藥等產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

供試菌株：木霉菌株為棘孢木霉CBS 433.97（Trichoderma asperellum CBS 433.97）購于中國農(nóng)業(yè)微生物保藏中心;尖孢鐮刀菌菌株Fusarium oxysporum MC-1（苦瓜枯萎病病原菌）與F. oxysporum CS-5（黃瓜枯萎病病原菌），均由本試驗室保藏;小麥（Triticum aestivum）為西農(nóng)979。

主要試劑： G-254硅膠粉（化學(xué)純），購于青島海洋化工有限公司;羧甲基纖維素鈉（分析純），購于天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司。其他試劑均為分析純。

棘孢木霉液體發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉40 g，MgSO4·7H2O 0.4 g，ZnSO4 0.001 g，MnSO4 0.001 g，NH4NO3 0.8 g，NaCl 0.7 g，蒸餾水定容至1 000 mL。1×105 Pa滅菌20 min。

PDA固體培養(yǎng)基：土豆200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 000 mL。1×105 Pa滅菌20 min。

PDA液體培養(yǎng)基：土豆200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水定容至1 000 mL。1×105 Pa滅菌20 min。

1.2 方 法

1.2.1 棘孢木霉與其代謝產(chǎn)物的抑菌性分析試驗 （1）平板對峙試驗。用直徑為9 mm的打孔器分別截取培養(yǎng)3 d的棘孢木霉和培養(yǎng)5 d的病原菌菌塊，兩菌塊分別放置在PDA固體培養(yǎng)基的一端，二者相距4 cm，每組3個重復(fù)。接種完成后，28 ℃溫度條件下培養(yǎng)。根據(jù)棘孢木霉與2種病原菌在平板中的對峙情況計算棘孢木霉對病原菌MC-1和CS-5的抑菌率，計算公式如下。

抑菌率=×100%

（2）棘孢木霉發(fā)酵液制備。將在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d的棘孢木霉菌菌餅接種于PDA液體培養(yǎng)基中，28 ℃溫度條件下、180 r·min-1震蕩培養(yǎng)7 d。將棘孢木霉發(fā)酵液轉(zhuǎn)接到容量為120 L的液體菌種發(fā)酵罐內(nèi)，液體菌種發(fā)酵罐內(nèi)的培養(yǎng)基為棘孢木霉液體發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵20 d。發(fā)酵好的棘孢木霉發(fā)酵液用于代謝產(chǎn)物抑菌活性測定。

（3）棘孢木霉發(fā)酵液抑菌活性測定。采用含藥培養(yǎng)基平板法[14]，按照棘孢木霉代謝產(chǎn)物與PDA固體培養(yǎng)基體積比為1∶10、1∶50、1∶100的比例分別加到PDA固體培養(yǎng)基中并混均，對照為PDA固體培養(yǎng)基。用打孔器打制MC-1與CS-5的菌餅分別接種于含棘孢木霉代謝產(chǎn)物的培養(yǎng)基中心，將平板倒置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每組3個重復(fù)。培養(yǎng)4 d后，測量各組實驗菌落直徑大小，計算棘孢木霉代謝產(chǎn)物對MC-1和CS-5的抑菌率。

抑菌率=×100%

1.2.2 棘孢木霉代謝產(chǎn)物的分離 （1）最佳萃取劑的確定。在棘孢木霉代謝產(chǎn)物中分別加入等體積的正丁醇、乙酸乙酯和石油醚進行萃取，萃取相用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行減壓濃縮蒸干，然后用甲醇溶解，獲得粗提物。將粗提物的濃度調(diào)整至1 g·L-1，作為母液備用。將粗提物母液分別稀釋至濃度為0.1，0.01和0.001 g·L-1溶液，4 ℃保存?zhèn)溆?，對照為甲醇。將病菌MC-1和CS-5用打孔器打成菌餅接種于PDA固體平板中央，將各濃度的粗提物與甲醇分別吸取100 μL滴加到接種于平板上的菌餅上，每組3個重復(fù)，放置28 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 d，觀察現(xiàn)象，測量菌落直徑，用于計算粗提物對病原菌的抑菌率，確定最佳萃取溶劑。

（2）薄層層析。應(yīng)用張量[15]的方法制備硅膠板。將待測的粗提物樣品用毛細管（直徑0.5 mm）點樣于活化好的硅膠板上，分別用氯仿和甲醇的不同比例的混合溶劑作為展開劑進行展開，在紫外燈下或用碘蒸氣進行顯色觀察來確定最佳的展開劑。

（3）收集組分。將薄層層析獲得的各組分從硅膠板上刮下，溶于甲醇中。在超凈工作臺內(nèi)將有機溶劑吹干，稱各組分質(zhì)量，用定量無菌水溶解各組分置于EP管內(nèi)，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 薄層層析獲得的各組分功能分析? ? （1）抑菌功能分析。將在PDA液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d的MC-1和CS-5菌液吸取1 mL與100 mL PDA固體培養(yǎng)基混均倒板，將無菌濾紙片均勻放置于含MC-1和CS-5菌液培養(yǎng)基上，然后分別吸取各組分溶液與無菌水各100 μL滴加到濾紙片上，每組3個重復(fù)，放置28 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 d，觀察抑菌圈的大小，計算各組分對病原菌的抑菌率。

（2）促生長功能分析。將上述的各組分分別用無菌蒸餾水稀釋成濃度為1 g·L-1，100 mg·L-1，10 mg·L-1，

1 mg·L-1，100 μg·L-1，10 μg·L-1，1 μg·L-1和100 ng·L-1的溶液。小麥種子（西農(nóng)979）用75%的乙醇消毒2 min，無菌水洗6遍，再用2%的次氯酸鈉消毒2 min，無菌水洗6遍。用上述不同濃度的各組分溶液分別浸泡小麥種子30 min。同時，用不同濃度的IAA（1 g·L-1，100 mg·L-1，10 mg·L-1，1 mg·L-1，100 μg·L-1，

10 μg·L-1，1 μg·L-1和100 ng·L-1）和無菌水作為對照。無菌濾紙平鋪到培養(yǎng)皿中，然后分別加入7 mL相應(yīng)的各組分溶液，最后將上述處理過的小麥種子接種到濾紙上，每皿10顆，每組3個重復(fù)。測定小麥種子在24 h和48 h的發(fā)芽率，生長第15天時測定小麥幼苗的根長及株高。試驗結(jié)果表明（數(shù)據(jù)未在本文中列出），IAA在濃度為100 μg·L-1時，小麥種子發(fā)芽率最高，24 h和48 h時的發(fā)芽率分別為75%和90%。培養(yǎng)15 d后，IAA促進小麥種子根部生長的最適濃度為100 μg·L-1;促進小麥幼苗株高的最適濃度為10 μg·L-1。IAA處理小麥根長、株高和發(fā)芽率的最佳濃度分別作為此次試驗的陽性對照;無菌水處理組作為本次試驗的陰性對照。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Excel 2010 和SPSS 16.0 對數(shù)據(jù)進行計算與方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 棘孢木霉與其代謝產(chǎn)物的抑菌活性分析

采用平板對峙法分析了棘孢木霉對植物病原尖孢鐮刀菌MC-1和CS-5的拮抗作用。結(jié)果顯示，棘孢木霉對2種病原菌均具有不同程度的拮抗作用，其中對MC-1的抑菌率為36.4%，對CS-5的抑菌率為62.0%（圖1）。采用含藥培養(yǎng)基法分析棘孢木霉代謝產(chǎn)物對MC-1和CS-5抑制效果。結(jié)果顯示，在棘孢木霉發(fā)酵液與PDA比例為1∶10時對MC-1的抑菌率為13.04%，抑菌效果顯著高于其他處理;在棘孢木霉發(fā)酵液與PDA比例為1∶10時對CS-5的抑菌率為18.75%，抑菌效果顯著高于其他處理（圖2）。

2.2 棘孢木霉代謝產(chǎn)物的分離

2.2.1 最佳萃取劑的確定 經(jīng)過萃取，乙酸乙酯和正丁醇均萃取出活性物質(zhì)，但是石油醚沒有萃取出活性物質(zhì)（結(jié)果未列出），故本研究只列出了乙酸乙酯萃取相與正丁醇萃取相對CS-5和MC-1的抑菌試驗。不同濃度的各萃取相粗提物對CS-5和MC-1的抑菌效果見圖3。從圖3中可以看出1 g·L-1的正丁醇萃取相對CS-5和MC-1的抑菌效果均為最好，對MC-1的抑菌率達到57.14%，對CS-5的抑菌率達到50.45%。故在接下來對棘孢木霉代謝物進行分離時，采用正丁醇作為萃取相進行大量萃取。

2.2.2 展開劑的選擇 本試驗探索的展開劑比例有以下幾種，氯仿∶甲醇=9∶1，10∶1，8∶2，7∶3和6∶4，待展開完畢后，將硅膠板晾干，用碘蒸氣進行顯色，展開劑比例為氯仿∶甲醇=9∶1的展開效果最好（圖4），得到四條帶，自下而上分別標(biāo)記為TA1，TA2，TA3，TA4。2.3 薄層層析獲得的各組分功能分析

2.3.1 抑菌作用 對TA1，TA2，TA3和TA4 4個組分的抑菌活性分別進行了分析，由圖5可知，分離得到的4個組分均無明顯抑菌效果（圖5）。2.2.1部分研究表明該菌株代謝物具有抑制病原菌的潛能，因此此部分的結(jié)論與2.2.1部分相矛盾，原因可能是抑菌活性物質(zhì)在TA1，TA2，TA3和TA4 4個組分之外。

2.3.2 TA1，TA2，TA3和TA4 4個組分的促生長作用分析 小麥種子用各組分不同濃度的溶液培養(yǎng)15 d后根長與株高見圖6和圖7。由圖6可知，組分TA1在濃度為1 g·L-1時，小麥種子根生長最快，與IAA相比根長增長了25.94%，與無菌水相比根長增長了63.67%;組分TA2在濃度為10 μg·L-1時，小麥種子根部生長最快，與IAA相比根長增加了0%，與無菌水相比根長增加了29.96%;組分TA3在濃度為1 g·L-1時，小麥種子根部生長最快，與IAA相比根長增加了36.31%，與無菌水相比根長增加了77.15%;組分TA4在濃度為10 mg·L-1時，小麥種子根部生長最快，與IAA相比根長增加了1.73%，與無菌水相比根長增加了32.21%。

由圖7可知，組分TA1在濃度為1 g·L-1時，小麥幼苗生長最好，與IAA相比無明顯的促進幼苗生長的作用，與無菌水相比株高增長了15.45%;組分TA2在濃度為100 mg·L-1時，小麥幼苗生長最好，與IAA相比無促進幼苗生長作用，與無菌水相比株高增長了8.89%;組分TA3在濃度為1 g·L-1時，小麥幼苗生長最好，與IAA相比株高增長了5.26%，與無菌水相比株高增長了31.09%;組分TA4在濃度為100 μg·L-1時，小麥幼苗生長最好，與IAA相比無促進幼苗生長作用，與無菌水相比根部長度增長了8.48%。

小麥種子用各組分不同濃度的溶液培養(yǎng)的發(fā)芽率見圖8和圖9。種子培養(yǎng)24 h時，無菌水處理的小麥種子發(fā)芽率為65%。由圖8可知，TA1在濃度為1 μg·L-1時發(fā)芽率為75%，發(fā)芽率最高，與IAA相比發(fā)芽率相同，與無菌水相比提高了10%;TA2在濃度為1 g·L-1，100 mg·L-1時發(fā)芽率為65%，發(fā)芽率最高，與IAA相比發(fā)芽率較低，與無菌水發(fā)芽率相同;TA3在濃度為1 μg·L-1 時發(fā)芽率為80%，發(fā)芽率最高，與IAA相比發(fā)芽率提高5%，與無菌水相比發(fā)芽率提高15%，TA4在濃度為1 mg·L-1，1 μg·L-1時，發(fā)芽率最高，小麥種子發(fā)芽率達到80%，與IAA相比發(fā)芽率提高5%，與無菌水相比發(fā)芽率提高15%。

種子培養(yǎng)48 h時，無菌水處理的小麥種子發(fā)芽率為65%。由圖9可知，TA1在濃度為1μg·L-1時發(fā)芽率為85%，發(fā)芽率最高，與IAA相比發(fā)芽率較低，與無菌水相比提高了20%;TA2在濃度為1 μg·L-1時發(fā)芽率為75%，發(fā)芽率最高，與IAA相比發(fā)芽率較低，與無菌水發(fā)芽率相同提高了10%;TA3在濃度為1 μg·L-1 時發(fā)芽率為95%，發(fā)芽率最高，與IAA相比發(fā)芽率提高5%，與無菌水相比發(fā)芽率提高30%，TA4在濃度為100 mg·L-1時，發(fā)芽率最高，與IAA的發(fā)芽率相同，與無菌水相比發(fā)芽率提高25%。

3 結(jié)論與討論

本研究初步確定了棘孢木霉代謝產(chǎn)物中具有抑制尖孢鐮刀菌MC-1與CS-5的活性物質(zhì)，但本試驗中獲得的4個組分對兩種病原菌均無明顯抑制作用，表明現(xiàn)階段暫時未追蹤到能夠抑制MC-1和CS-5生長的活性物質(zhì)，接下來的工作中還將繼續(xù)進行追蹤，并采用更多的病原菌進行物質(zhì)的抑菌活性分析。

雖然本研究未得到對病原菌MC-1和CS-5具有抑菌活性的物質(zhì)，但在本研究中初步獲得的4個組分TA1，TA2，TA3，TA4均對小麥幼苗具有不同程度的促生長作用，其中TA3在濃度為1 g·L-1時的促生長作用最為顯著，對小麥根部生長的促進作用與IAA相比提高了36.31%，與無菌水相比提高了77.15%;對小麥幼苗株高的促生長作用與IAA相比增加了5.26%，與無菌水相比提高了31.09%;培養(yǎng)第48 h后，1 μg·L-1的TA3處理后小麥種子發(fā)芽率達到了95%，與IAA相比提高了5%，與無菌水相比提高了30%。表明組分TA3能夠促進小麥幼苗生長。

本研究只采用薄層層析和一種展開劑比例分離得到了4個組分，并且僅分析了棘孢木霉對尖孢鐮刀菌的抑制作用以及對小麥根長、株高和發(fā)芽率的影響。后續(xù)研究將進一步應(yīng)用高效液相色譜分析、質(zhì)譜分析和盆栽試驗等對棘孢木霉活性代謝產(chǎn)物進行分離和功能分析，為棘孢木霉CBS 433.97的進一步應(yīng)用奠定基礎(chǔ)和提供理論依據(jù)。

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