白 剛， 劉艷春， 錢紅飛

(1. 紹興文理學(xué)院 紡織服裝學(xué)院， 浙江 紹興 312000；2. 浙江省清潔染整技術(shù)研究重點實驗室， 浙江 紹興 312000)

蠶絲砂洗是在各種化學(xué)助劑的作用下，使蠶絲纖維膨化，分子鏈中的肽鍵部分水解，綢面起毛起絨的加工過程。砂洗處理后的蠶絲織物具有手感軟糯、表面微茸、厚重感增加、富有彈性等優(yōu)良性能[1]。傳統(tǒng)的砂洗工藝主要是采用堿劑砂洗，染色綢在這種堿性砂洗液中褪色嚴重，強力下降明顯，并且對環(huán)境污染負荷高，因此，研究既能保持原有色澤，又能保持原有強力的環(huán)保砂洗新技術(shù)越來越受到重視。

蛋白酶可吸附在蠶絲纖維表面，并在吸附位置切斷肽鍵，使表面微纖松散、裸露，在織物表面產(chǎn)生茸毛[2-3]。由于絲素纖維水解僅發(fā)生在表面或附近區(qū)域，因此，蛋白酶砂洗后織物強力損傷相對較小，微絨比較均勻，同時克服了染色稠堿砂洗褪色嚴重的問題。但是，由于游離蛋白酶在熱、堿、酸的作用下易失活，存在穩(wěn)定性差，難以回收等問題，降低了其實際應(yīng)用價值。

酶的固定化技術(shù)可以解決游離酶催化活性不穩(wěn)定的缺陷，提高酶的重復(fù)利用性[4-5]，但酶固定化過程中還存在幾個共性問題：1)固定化可能導(dǎo)致酶的部分失活；2)載體吸附的酶量低；3)酶和載體結(jié)合不牢固，容易脫落[6]。因此，尋找高酶載量、穩(wěn)定性好、相對活力高的固定化酶方法十分必要。

交聯(lián)酶聚集體具有制備過程簡便，單位體積活性高，穩(wěn)定性好等優(yōu)點[7-8]；而納米載體因其良好的生物相容性、高載酶量和較小的傳質(zhì)阻力等顯著特點，也越來越受到重視[9-10]。本文以氨基化納米二氧化硅為載體，將交聯(lián)酶聚集體技術(shù)與載體固定化技術(shù)相結(jié)合制備固載化交聯(lián)蛋白酶聚集體，對固載化交聯(lián)蛋白酶聚集體的制備工藝條件進行優(yōu)化，并對其在蠶絲織物上的砂洗效果進行探討。

1 試驗部分

1.1 試驗材料與儀器

材料：蠶絲彈力緞(78 g/m2)。試劑：木瓜蛋白酶(50萬U/g，北京奧博星生物科技有限公司)，硅烷偶聯(lián)劑KH-550(南京品寧偶聯(lián)劑有限公司)，無水乙醇(BR，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)，戊二醛(天津市光復(fù)精細化工研究所)，F(xiàn)olin酚試劑F030161、L-酪氨酸UA071、干酪素UP007(上海如吉生物科技發(fā)展有限公司)，納米二氧化硅(上海文華化工顏料有限公司)。

儀器：LG10-2.4 A型高速離心機(北京京立離心機有限公司)，JJ-1型精密增力電動攪拌器(常州國華電器有限公司)，UV-2450型紫外可見分光光度計(日本島津株式會社)，JSM-5600LV型掃描電子顯微鏡(日本JEOL電子)，Malvern Zetasizer Nano ZS90型Zeta電位分析儀(英國馬爾文儀器有限公司)，川端KES-FB2型彎曲性能測試儀(日本KATO科技有限公司)，YG(B)811E型織物懸垂性能測試儀(溫州大榮紡織設(shè)備有限公司)，YG(B)871型毛細管效應(yīng)測定儀(西安順智電子科技有限公司)，YG501D型透濕試驗儀(溫州方圓儀器有限公司)，Y561型織物透氣儀(無錫三環(huán)儀器有限公司)，iSGHP-10.5型熱阻濕阻測試儀(美國MTNW公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 固載化交聯(lián)蛋白酶聚集體制備

1)氨基化納米二氧化硅載體的制備。

取一定量的硅烷偶聯(lián)劑KH-550于錐形瓶中，用無水乙醇溶解后加入納米二氧化硅粉末，硅烷偶聯(lián)劑與納米二氧化硅的質(zhì)量比為3∶1，攪拌均勻后在40 ℃的恒溫水浴鍋中振蕩1 h。用離心機以9 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，倒掉上層離心液，用蒸餾水清洗黏在管壁上的固體，反復(fù)離心清洗3次，最終留在離心管里的固體物質(zhì)即為氨基化納米二氧化硅載體，放入烘箱中于90 ℃烘干備用。

2)固載化交聯(lián)蛋白酶聚集體的制備。

采用正交試驗優(yōu)化固載化交聯(lián)蛋白酶聚集體(ICLPAs)的制備工藝，以沉降劑體積、蛋白酶與載體配比、交聯(lián)劑濃度、交聯(lián)時間為試驗因素，酶活回收率為試驗指標(biāo)，L16(44)正交試驗因素水平如表1所示。

表1 ICLPAs制備正交試驗因素水平表

Tab.1 Factors and levels of orthogonal experimentsfor preparing ICLPAs

水平ABCD沉降劑體積/mL載體質(zhì)量/mg交聯(lián)劑質(zhì)量分數(shù)/%交聯(lián)時間/min1210120242024036303604840480

將10 mg木瓜蛋白酶放入20 mL磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH=6.0)中，加入一定量的氨基化納米二氧化硅載體，以乙醇作為沉降劑，混合均勻，之后加入戊二醛交聯(lián)劑，在40 ℃條件下，以200 r/min速度振蕩一定時間后使其充分交聯(lián)，離心，除去上清液，用蒸餾水淋洗3次，得到固載化交聯(lián)蛋白酶聚集體。

1.2.2 固載化交聯(lián)蛋白酶聚集體對蠶絲砂洗整理

整理工藝為：預(yù)浸(45 ℃，30 min，浴比1∶30)—酶砂洗處理(固載化交聯(lián)蛋白酶聚集體8%(o.w.f)，50 ℃，60 min，pH=6，浴比1∶30)—酶滅活(98 ℃，10 min)—水洗—烘干。

1.3 測試方法

1.3.1 蛋白酶的活力測定

按照Folin-酚法測定固定化木瓜蛋白酶活力。蛋白酶活力定義為1 g固體酶粉(或1 mL液體酶)，在40 ℃、pH=7的條件下，1 min水解酪素產(chǎn)生1 μg酪氨酸為1個酶活力單位。酶活力按下式進行計算：

式中：A為酶活力，U/g；C為吸光度；K為吸光常數(shù)(K=97.09，實驗室測定值)；V為反應(yīng)試劑的總體積，mL；t為酶解反應(yīng)時間，min；n為稀釋倍數(shù)。

酶活回收率按下式計算：

式中：E為酶活回收率，%；Ai為固定化酶總活力，U/g；Af為游離酶總活力，U/g。

1.3.2 ICLPAs的熱穩(wěn)定性測試

將游離蛋白酶和ICLPAs各加入pH=6.0的緩沖液20 mL、一定量的干酪素和酶，分別于30，40，50，60，70 ℃水浴中放置50 min后取出，再沸水浴使其失活，測試酶的相對活力。

1.3.3 ICLPAs的酸堿穩(wěn)定性測試

將游離蛋白酶和ICLPAs分別加入pH為4，5，6，7，8的緩沖液20 mL，放入一定量的干酪素，置于40 ℃水浴中放置50 min后取出，再進行沸水浴使其失活，測試酶的相對活力。

1.3.4 ICLPAs的重復(fù)使用性計算

將ICLPAs與底物在最適的反應(yīng)條件下進行催化反應(yīng)，測定酶活力。反應(yīng)結(jié)束后，將ICLPAs過濾沉淀，離心清洗3次，從反應(yīng)體系中分離出來，再重復(fù)上述反應(yīng)，總計重復(fù)10次，按下式計算其相對酶活：

式中：Ar為相對酶活，%；A為每次使用后固定化酶活力，U/g；A0為首次固定化酶活力，U/g。

1.3.5 形貌觀察

采用掃描電鏡觀察游離蛋白酶和ICLPAs的表面微觀形態(tài)，其分辨率為高真空3.0 nm，低真空4.5 nm。

采用Epson V200掃描儀，在分辨率為1 200 dpi條件下對砂洗前后蠶絲織物的表面形態(tài)進行觀察。

1.3.6 Zeta電位測試

采用Zeta電位分析儀測定Zeta電位。

1.3.7 剛?cè)嵝院涂拱櫺詼y試

采用彎曲性能測試儀測試織物彎曲剛度。

采用織物懸垂性能測試儀，根據(jù)GB/T 23329—2009 《紡織品 織物懸垂性的測定》對織物的懸垂性進行測試。

采用織物折皺彈性儀，根據(jù)GB/T 3819—1997《紡織品 織物折痕回復(fù)性的測定 回復(fù)角法》對蠶絲織物的折皺回復(fù)角進行測試。

1.3.8 毛細效應(yīng)測試

采用毛細管效應(yīng)測定儀，根據(jù)FZ/T 01071—2008《紡織品 毛細效應(yīng)試驗方法》對蠶絲織物進行毛效測試。

1.3.9 透濕與透氣性能及熱阻與濕阻的測試

采用透濕試驗儀，根據(jù)GB/T 12704.1—2009《紡織品 織物透濕性試驗方法 第1部分：吸濕法》對蠶絲織物的透濕性能進行測試。

采用織物透氣儀，根據(jù)GB/T 5453—1997《紡織品 織物透氣性的測定》對蠶絲織物的透氣性能進行測試。

采用熱阻濕阻測試儀，根據(jù)GB/T 11048—2008《紡織品 生物舒適性 穩(wěn)態(tài)條件下熱阻和濕阻的測定》對蠶絲織物的熱阻、濕阻進行測試。

1.3.10 斷裂強力測試

采用萬能材料試驗機，根據(jù)GB/T 3923.1—2013《紡織品 織物拉伸性能 第1部分：斷裂強力和斷裂伸長率的測定(條樣法)》對蠶絲織物的斷裂強力進行測試。

2 結(jié)果與討論

2.1 ICLPAs制備工藝優(yōu)化

固載化交聯(lián)蛋白酶聚集體的制備工藝正交試驗優(yōu)化結(jié)果見表2。由表可知，ICLPAs最佳制備工藝為A3B3C1D2，即沉降劑乙醇體積為6 mL，氨基化納米二氧化硅載體質(zhì)量為30 mg，戊二醛質(zhì)量分數(shù)為1%，交聯(lián)時間為40 min，該條件下酶活回收率為92.8%。選取的4個因素影響ICLPAs活力的主次順序為：沉降劑體積>交聯(lián)時間>載體質(zhì)量>交聯(lián)劑質(zhì)量分數(shù)。

2.2 ICLPAs表征分析

2.2.1 表面形態(tài)結(jié)構(gòu)

采用掃描電鏡對游離蛋白酶和ICLPAs的形貌進行表征，結(jié)果如圖1所示?？梢钥闯觯河坞x蛋白酶呈球狀顆粒，單分散性好，粒徑在10～20 μm之間；固載化后的交聯(lián)蛋白酶聚集體形狀呈不規(guī)則的絮狀，比表面積增大，粒徑約為30 μm，沒有明顯的團聚現(xiàn)象。

2.2.2 Zeta 電位

對納米二氧化硅、氨基化二氧化硅載體、游離蛋白酶進行Zeta電位測試，結(jié)果表明：游離蛋白酶表面Zeta電位為-28.1 mV；納米二氧化硅由于表面含有羥基，其表面Zeta電位為-1.12 mV；二者的吸附性和相容性較差。為提高納米二氧化硅負載蛋白酶的能力，采用硅烷偶聯(lián)劑KH-550(γ-氨丙基三乙氧基硅烷)對納米二氧化硅表面進行修飾。在有水條件下，二氧化硅表面的硅羥基與硅烷偶聯(lián)劑上的乙氧基發(fā)生脫羥基反應(yīng)，形成聚硅氧烷類物質(zhì)。經(jīng)過修飾后的納米二氧化硅表面含有很多活性氨基，其表面Zeta電位為3.16 mV，在交聯(lián)劑的作用下，可與很多酶分子發(fā)生發(fā)應(yīng)，從而提高其負載蛋白酶的能力，反應(yīng)機制如圖2、3所示。

表2 ICLPAs制備正交試驗結(jié)果

Tab.2 Results of orthogonal experimentsfor preparing ICLPAs

序號ABCD酶活回收率/%1111152.42122257.23133363.24144454.45212364.86221471.27234159.68243261.29313484.410324387.611331292.812342168.413414281.314423161.115432486.816441378.4K156.870.773.760.4K264.269.369.373.1K383.375.667.573.5K476.965.670.774.2R26.510.06.213.8

圖1 游離蛋白酶和ICLPAs掃描電鏡照片(×1 000)

Fig.1 SEM images of free protease (a) and ICLPAs(b)(×1 000)

圖2 載體制備示意圖

Fig.2 Formation scheme of carrier

圖3 固載化交聯(lián)蛋白酶聚集體的合成路線

Fig.3 Reaction scheme of immobolized crosslinked protease aggregates

圖4 固定化酶的熱穩(wěn)定性

Fig.4 Thermal stability of immobilized enzyme

2.3 ICLPAs的穩(wěn)定性和重復(fù)使用性

2.3.1 ICLPAs的最適催化溫度和熱穩(wěn)定性

游離蛋白酶與ICLPAs的熱穩(wěn)定性如圖4所示，將游離蛋白酶的最大相對活力定為100%?？梢钥闯?，與游離蛋白酶相比，ICLPAs的熱穩(wěn)定性明顯提高，在40～70 ℃范圍內(nèi)都能保持較高的活力。ICLPAs熱穩(wěn)定性的提高是由于蛋白酶交聯(lián)、聚集引起酶的構(gòu)象及酶所攜帶的凈電荷、電荷位置等發(fā)生改變所致。游離蛋白酶的最適反應(yīng)溫度為50 ℃，而經(jīng)過氨基化納米二氧化硅交聯(lián)后的ICLPAs的最適反應(yīng)溫度為60 ℃，高于游離蛋白酶的最適反應(yīng)溫度。

2.3.2 ICLPAs的最適催化pH值和酸堿穩(wěn)定性

游離蛋白酶與ICLPAs的酸堿穩(wěn)定性如圖5所示，將游離蛋白酶的最大相對活力定為100%?？梢钥闯觯坞x蛋白酶與ICLPAs的最適催化pH值均為6.0左右。與游離蛋白酶相比，ICLPAs在pH值為4.0～8.0范圍內(nèi)呈現(xiàn)出較高的相對活力，表明ICLPAs酸堿穩(wěn)定性明顯優(yōu)于游離蛋白酶。

圖5 固定化酶的酸堿穩(wěn)定性

Fig.5 pH stability of immobilized enzyme

2.3.3 ICLPAs的重復(fù)使用性

將固載化交聯(lián)蛋白酶聚集體ICLPAs重復(fù)使用10次，研究其重復(fù)使用性能，結(jié)果見圖6?？梢钥闯觯篒CLPAs重復(fù)使用6次后，其相對酶活力仍保持在71%；重復(fù)使用10次后相對酶活力為51%。試驗結(jié)果表明，ICLPAs重復(fù)使用性能較好。固定化酶的重復(fù)使用性是決定其應(yīng)用的一個重要技術(shù)參數(shù)，固定化酶的重復(fù)使用次數(shù)越多，越有利于其實際應(yīng)用。

圖6 ICLPAs的重復(fù)使用性

Fig.6 Reusability of ICLPAs

2.4 ICLPAs對蠶絲織物的砂洗效果

2.4.1 表面形態(tài)

采用Epson V200掃描儀對ICLPAs砂洗前后蠶絲織物進行掃描，結(jié)果如圖7所示?？梢钥闯?，砂洗前蠶絲織物表面整體上比較光滑，砂洗后纖維發(fā)生帚化、分裂，織物表面呈現(xiàn)出微絨，使織物具有軟糯的手感，并降低了織物的明亮度。

圖7 ICLPAs處理前后織物掃描照片

Fig.7 Images of untreated (a)and ICLPAs-treated samples(b)

2.4.2 織物的剛?cè)嵝院涂拱櫺?/p>

織物的剛?cè)嵝钥梢酝ㄟ^彎曲剛度和懸垂系數(shù)來表示，彎曲剛度越大，懸垂性越差，織物的剛?cè)嵝砸苍讲?。ICLPAs處理前后蠶絲織物的彎曲剛度、懸垂系數(shù)和折皺回復(fù)角如表3所示。可以看出，經(jīng)ICLPAs處理后，蠶絲織物的彎曲剛度和懸垂系數(shù)下降較為明顯。這是因為用ICLPAs對蠶絲織物進行砂洗時，纖維發(fā)生溶脹，ICLPAs吸附在纖維表面并在吸附位置切斷肽鍵，部分絲素發(fā)生降解帚化，使織物表面形成絨毛，對降低紗線間或纖維間的交織阻力具有一定的作用，從而使織物彎曲剛度下降，柔軟性增加，懸垂系數(shù)的減少與彎曲剛度的降低直接相關(guān)。ICLPAs處理后蠶絲織物的折皺回復(fù)角增大，抗皺性提高。這是因為ICLPAs處理后絲素纖維發(fā)生水解和帚化，織物表面產(chǎn)生微絨相互纏結(jié)，既能夠減少織物變形，又能使產(chǎn)生的變形易恢復(fù)。

表3 織物彎曲剛度、懸垂系數(shù)和折皺回復(fù)角

Tab.3 Bending rigidity, drape coefficient and creaserecovery angle of fabrics

樣品彎曲剛度/(cN·cm)懸垂系數(shù)/%折皺回復(fù)角(T+W)/(°)未處理0.024 53.27184ICLPAs處理0.003 11.97225

2.4.3 織物的吸濕性、透氣性、透濕性和熱阻

表4示出ICLPAs處理前后蠶絲織物的吸濕性、透氣性、透濕性、熱阻和濕阻。可以看出，蠶絲織物經(jīng)ICLPAs處理后，透氣性提高，吸濕透濕性提高，濕阻由5.112 m2·Pa/W下降到4.526 m2·Pa/W，熱阻沒有明顯的變化。經(jīng)ICLPAs處理后，部分絲素發(fā)生水解帚化，纖維間空隙增大，表面結(jié)構(gòu)變得疏松，使織物的吸濕性、透氣性、透濕性提高，濕阻下降。

表4 織物的吸濕性、透氣性、透濕性、熱阻和濕阻

Tab.4 Hygroscopicity, air permeability, moisture penetrability, thermal and wet resistance of fabrics

樣品毛細效應(yīng)(30 min)/cm透濕性/(g·m-2·d-1)濕阻/(m2·Pa·W-1)熱阻/(m2·℃·W-1)透氣性/(L·m-2·s-1)未處理 9.11 7115.1120.018 6339.5ICLPAs處理11.32 3034.5260.019 3372.1

2.4.4 織物的斷裂強力

對ICIPAs砂洗前后的蠶絲織物進行斷裂強力測試，測得砂洗前蠶絲織物的斷裂強力為352 N，經(jīng)ICIPAs處理后蠶絲織物的斷裂強力為334 N。這是由于ICIPAs會破壞絲素纖維上的肽鍵，使絲素表面部分大分子水解斷裂，引起織物斷裂強力下降，但織物強力保留率仍為90.3%，不影響其服用性能。

3 結(jié) 論

1)本文以氨基化納米二氧化硅為載體，乙醇為沉降劑，采用交聯(lián)酶聚集體技術(shù)和載體固定化技術(shù)相結(jié)合制備固定化蛋白酶，制備過程中影響固載化交聯(lián)蛋白酶蛋白酶聚集體(ICLPAs)酶活回收率的因素依次為：沉降劑體積>交聯(lián)時間>載體質(zhì)量>交聯(lián)劑質(zhì)量分數(shù)。ICLPAs最優(yōu)制備條件：沉降劑體積為6 mL，載體質(zhì)量為30 g，戊二醛質(zhì)量分數(shù)為1%，交聯(lián)時間為40 min。與游離蛋白酶相比，ICLPAs呈現(xiàn)出更好的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性。

2)利用ICLPAs對蠶絲織物進行砂洗，砂洗后蠶絲織物表面起絨，豐滿蓬松，富有彈性。織物柔軟性、抗皺性、懸垂性得到改善，吸濕性、透濕性和透氣性提高，斷裂強力略有下降。