林永佳， 楊董超， 張佩華， 顧 巖

(1. 東華大學 紡織面料技術(shù)教育部重點實驗室， 上海 201620；2. 上海交通大學醫(yī)學院 附屬第九人民醫(yī)院， 上海 200011)

靜電紡絲技術(shù)是利用外加電場使聚合物溶液帶電，在噴頭末端形成懸垂的錐狀液滴，當液滴表面的電荷斥力超過其表面張力時，液滴表面會高速噴射出射流，經(jīng)過電場的拉伸細化及溶劑的揮發(fā)，纖維固化沉積于接收板上，形成納米纖維膜[1]。由靜電紡絲制得的纖維膜具有孔隙率高、纖維精細程度高、比表面積大、均一性好等優(yōu)點，能夠從納米尺度上模仿天然細胞外基質(zhì)，可作為細胞生長的多孔支架，促進細胞的遷移和增殖[2-3]。再生絲素蛋白(RSF)無毒且具有良好的生物相容性及可降解性等[4-5]，在生物醫(yī)用領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。脫細胞真皮基質(zhì)(ADM)是一種多孔性的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其主要成分為膠原蛋白，可促進新生血管及上皮的形成[6-7], 具有良好的生物相容性。

目前，關(guān)于靜電紡RSF的研究已不僅僅滿足于單一組分的RSF，更多的是通過共混引入1個或者多個組分，從而使RSF在組織工程中的應(yīng)用更加廣泛。蔡江瑜等[8]通過靜電紡絲技術(shù)制備了絲素蛋白/聚乳酸-聚己內(nèi)酯納米纖維支架，結(jié)果顯示支架能夠有效促進兔骨-腱愈合。蔣丹[9]以膀胱脫細胞基質(zhì)/RSF混合水溶液進行靜電紡絲，利用膀胱脫細胞基質(zhì)內(nèi)源性生物信號因子來增加共混膜的生物活性。盡管關(guān)于靜電紡RSF的研究報道很多，但將ADM與RSF共混進行靜電紡的研究報道很少。將ADM與RSF共混于紡絲液中，通過靜電紡絲技術(shù)制備出RSF/ADM共混納米纖維膜，不僅在結(jié)構(gòu)上模仿了天然細胞外基質(zhì)，具有高孔隙率、高比表面積等特點，且添加的ADM增加了RSF的細胞識別位點，促進RSF上細胞的增殖與黏附[10]，其可用于創(chuàng)面修復(fù)的組織工程中，具有一定的醫(yī)用發(fā)展前景。

本文將RSF與ADM按照一定質(zhì)量比共混溶于甲酸中進行靜電紡絲，探討不同質(zhì)量濃度的共混紡絲液及RSF/ADM質(zhì)量比對納米纖維形態(tài)及性能的影響，并通過體外接種細胞，初步考察了RSF/ADM共混納米纖維膜的生物相容性。

1 實驗部分

1.1 實驗原料與儀器

桑蠶繭，產(chǎn)自江蘇徐州；脫細胞真皮基質(zhì)(ADM，DC-ADM-a 型)，江蘇優(yōu)創(chuàng)生物醫(yī)學科技有限公司；尿素(分析純)，上海凌峰化學試劑有限公司；無水溴化鋰(純度為99%)，薩恩化學技術(shù)有限公司；甲酸(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司；C2C12細胞株，中國科學院細胞庫；CCK-8試劑，凱基生物技術(shù)有限公司；透析袋(截留相對分子質(zhì)量為14 000)，上海雷布斯網(wǎng)絡(luò)科技有限公司；醫(yī)用一次性注射針管(5 mL)，市售。

FA2004 型電子天平，上海良平儀器儀表有限公司；SHJ-6 A 型磁力攪拌水浴鍋，常州迅生儀器有限公司；DHG-9 145 A型電熱鼓風干燥箱，上海一恒科技有限公司；LGJ-10 型真空冷凍干燥機，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；KDS100型注射泵，美國KD Scientific公司；DW-P303-AADCD1型高壓直流電源，東文高壓電源(天津)有限公司；TM-3000型臺式掃描電子顯微鏡，日本日立公司；ARES型流變儀，美國TA Instruments公司；Spectrum Two型傅里葉變換紅外光譜儀，英國Perkin Elmer公司；DSC 4000型差式掃描量熱儀，鉑金埃爾默儀器(上海)有限公司；Synergy H1型多功能酶標儀，美國Bio Tek公司；Thermo 371型二氧化碳培養(yǎng)箱，美國Thermo Scientific 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 絲素蛋白的提取

絲素蛋白的提取步驟為脫膠，溶解，透析，凍干[11]，其實驗過程如下。

脫膠：將桑蠶繭剪碎，置于8 mol/L的尿素溶液(浴比為1∶30)中，于90 ℃水浴3 h后取出脫膠蠶繭，然后采用去離子水洗凈后于60 ℃烘干。重復(fù)以上步驟3次，得到絲素蛋白。

溶解：將絲素蛋白溶解于9.3 mol/L的溴化鋰溶液中(浴比為1∶10)，于60 ℃水浴溶解，待冷卻后用紗布過濾未溶解的雜質(zhì)得到絲素蛋白溶液備用。

透析：將經(jīng)過前處理后的透析袋徹底洗凈后裝入絲素蛋白溶液，采用去離子水透析48 h。

凍干：將經(jīng)過透析的絲素蛋白水溶液經(jīng)冷凍干燥72 h后制得RSF。

1.2.2 靜電紡納米纖維膜的制備

將RSF與ADM按不同的質(zhì)量比(10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5)共混溶于甲酸中，配制一定質(zhì)量濃度的靜電紡絲液。將紡絲液在室溫攪拌24 h后靜置脫泡裝入5 mL的一次性醫(yī)用注射器(針頭型號為18#)中進行靜電紡絲。靜電紡絲工藝參數(shù)為：電壓16 kV，推注速度0.7 mL/h，接收距離15 cm。采用接地的金屬板接收靜電紡納米纖維膜。

1.2.3 形貌觀察與直徑測量

將靜電紡納米纖維膜剪成0.3 cm×0.3 cm后貼于導(dǎo)電膠上并進行噴金處理，通過掃描電子顯微鏡觀察纖維的形態(tài)，并使用Image J軟件隨機選取50根纖維測量其直徑，計算直徑不勻率。

1.2.4 紡絲液黏度測定

將不同質(zhì)量濃度的RSF/ADM共混紡絲液靜置脫泡后，采用ARES 流變儀測定其在不同剪切速率下的黏度值。測試溫度為(25±1)℃，頻率掃描范圍為0.1～1 000 Hz。

1.2.5 化學結(jié)構(gòu)測試

將靜電紡納米纖維膜從鋁箔上剝下，通過傅里葉變換紅外光譜儀對其進行結(jié)構(gòu)分析，掃描范圍為4 000～400 cm-1。

1.2.6 熱學性能測試

將靜電紡納米纖維膜從鋁箔上剝下，稱取3～5 mg，并記錄質(zhì)量。采用DSC 4000 型差示掃描量熱儀對靜電紡納米纖維膜進行熱學性能測試。測試溫度區(qū)間為 30～400 ℃，升溫速率為10 ℃/min。

1.2.7 細胞增殖實驗

將C2C12細胞株(小鼠骨骼肌細胞)制備成5×104個/mL的細胞懸濁液，按照每孔100 μL將細胞懸液加入96孔板中。取尺寸為0.25 cm×0.25 cm的RSF/ADM 共混納米纖維膜放入96孔板對應(yīng)孔中，另外設(shè)置無材料的空白對照組。放置于37 ℃，體積分數(shù)為5%的二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)，每2 d更換1次培養(yǎng)液。分別于第1、3、5、7 d取出對應(yīng)時間點的96孔板加入10 μL的CCK-8試劑，在37 ℃孵育2 h后，使用多功能酶標儀測試各孔中的光吸收值(OD值)。

2 結(jié)果與討論

2.1 紡絲液質(zhì)量濃度對纖維形態(tài)的影響

固定RSF與ADM 的質(zhì)量比為9∶1，分別配制9、11、13、15 g/mL的共混紡絲液制備共混納米纖維膜，其掃描電鏡照片如圖1所示，平均直徑及其不勻率如表1所示。

圖1 不同質(zhì)量濃度的RSF/ADM共混納米 纖維膜形態(tài)(×3 000)

Fig.1 Morphologies of different mass concentrations of RSF/ADM blended nanofibers(×3 000)

從圖1和表1可以看出，當質(zhì)量濃度從9 g/mL增加至15 g/mL，纖維形態(tài)先從較細的、不規(guī)整包含珠狀物纖維到逐漸規(guī)整，再到再次出現(xiàn)珠狀物變化，纖維直徑的不勻率也隨之上升。當紡絲液質(zhì)量濃度較低時，分子鏈之間的纏結(jié)不足，紡絲時無法形成連續(xù)完整的纖維而帶有珠狀物或者紡錘形。隨著質(zhì)量濃度逐漸的增加，納米纖維的形態(tài)逐漸規(guī)整，當質(zhì)量濃度達到11 g/mL時珠狀物開始明顯減少。當質(zhì)量濃度進一步上升，分子鏈之間的纏結(jié)增加，噴射流需要在電場內(nèi)克服更大的表面張力去分化拉伸細化成絲，因而在同樣的工藝參數(shù)下，納米纖維的直徑逐漸增大且不勻率上升，紡絲過程逐漸變得困難，質(zhì)量濃度為15 g/mL時便出現(xiàn)紡絲液在針頭被拉長且堵塞針頭的現(xiàn)象，且鋁箔上會收集到部分沒有被拉伸細化的液滴。盡管質(zhì)量濃度為11 g/mL時所測得納米纖維的直徑及CV值均較13 g/mL小，但在掃描電鏡的觀測過程中發(fā)現(xiàn)質(zhì)量濃度為11 g/mL時所獲得的共混納米纖維膜依然存在些許紡錘形纖維，且紡絲效率不如質(zhì)量濃度為13 g/mL時。綜合考慮，選擇13 g/mL作為后續(xù)實驗的基礎(chǔ)參數(shù)。

表1 不同質(zhì)量濃度的RSF/ADM 共混納米纖維的直徑

Tab.1 Different mass concentrations of RSF/ADMblended nanofibers in diameter

質(zhì)量濃度/(g·mL-1)平均直徑/nmCV值/%935841.61146224.51361630.41568535.6

2.2 RSF與ADM質(zhì)量比對纖維形態(tài)的影響

在固定紡絲液的質(zhì)量濃度為13 g/mL，紡絲電壓為16 kV，推注速度為0.7 mL/h，接收距離為15 cm的靜電紡工藝參數(shù)下，分別配制RSF與ADM不同質(zhì)量比的紡絲液，制備的納米纖維形態(tài)如圖2所示。

圖2 不同質(zhì)量比的共混納米纖維形態(tài)(×3 000)

Fig.2 Morphologies of nanofibers with different blending ratios (×3 000)

表2示出不同質(zhì)量比的RSF/ADM共混納米纖維的平均直徑及其不勻率。

表2 不同質(zhì)量比的RSF/ADM共混納米纖維的直徑

Tab.2 Diameter of RSF/ADM nanofibers withdifferent blend ratios

RSF與ADM質(zhì)量比平均直徑/nmCV值/%10∶061819.09∶161630.48∶250738.17∶349836.36∶449924.85∶5——

從圖2及表2可以看出，在同樣的工藝參數(shù)下，隨著ADM占比的提高，紡出的納米纖維形態(tài)逐漸變得不規(guī)整，纖維平均直徑呈現(xiàn)減小的趨勢，且在紡絲過程中，溶液的表觀流動性下降，可紡性變差。使用流變儀分別對RSF與ADM質(zhì)量比為10∶0、9∶1、8∶2的紡絲液進行不同剪切速率下液體黏度的測定，得到流變曲線圖，如圖3所示。結(jié)果顯示，隨著ADM在紡絲液中占比的提高，溶液的黏度呈現(xiàn)升高的趨勢。這是由于ADM中的主要成分為膠原蛋白，具有一定的剛性，當ADM的含量增加的同時，紡絲液中膠原蛋白的含量也隨之增加，因而紡絲液中分子鏈剛性增加，使溶液的表觀流動性降低。盡管增加的ADM使得紡絲液中分子鏈間依然存在較多的結(jié)合點，使紡絲液的黏度呈現(xiàn)一個較高的水平；但ADM中膠原蛋白剛性的特點不利于分子鏈形成足夠強度的有效纏結(jié)[12]，能夠形成有效纏結(jié)的柔性長鏈RSF又由于ADM的增加而相應(yīng)降低，使其不足以克服電場力的牽伸作用，因此，隨著ADM占比的提高，納米纖維逐漸呈紡錘形及球形再到無法紡出納米纖維。

圖3 不同質(zhì)量比的RSF/ADM共混 紡絲液的流變曲線

Fig.3 Rheological curves of different proportions of RSF/ADM blend spinning solution

2.3 共混納米纖維膜的性能分析

2.3.1 化學結(jié)構(gòu)分析

對納米纖維膜進行紅外光譜測試得知：幾種納米纖維膜均在3 285 cm-1附近呈現(xiàn)蛋白質(zhì)的酰胺A帶，即N—H鍵的伸縮振動峰；在3 083 cm-1附近呈現(xiàn)蛋白質(zhì)的酰胺B帶，即C—H鍵的伸縮振動峰。圖4示出不同質(zhì)量比的共混納米纖維膜在波數(shù)為1 700～1 450 cm-1區(qū)間的紅外光譜圖。蛋白質(zhì)的酰胺I在1 650 cm-1處呈α螺旋結(jié)構(gòu)，在1 640～1 625 cm-1處呈β折疊結(jié)構(gòu)，在1 655 cm-1處呈無規(guī)構(gòu)象；酰胺Ⅱ在1 545 cm-1處呈α螺旋結(jié)構(gòu)，在1 525～1 515 cm-1處呈β折疊結(jié)構(gòu)，在1 545～1 535 cm-1處呈無規(guī)構(gòu)象[13]。隨著共混納米纖維膜中ADM占比的提高，共混納米纖維膜的酰胺I的吸收峰分別為1 648、1 646、1 644、1 644、1 634 cm-1，從圖4也可看出，吸收峰在向右移動，即其酰胺I逐漸向β折疊構(gòu)象靠近。純RSF的酰胺Ⅱ吸收峰出現(xiàn)在1 533 cm-1處，呈無規(guī)構(gòu)象；純ADM酰胺Ⅱ吸收峰出現(xiàn)在1 521 cm-1處，呈β折疊構(gòu)象。而共混納米纖維膜中，隨著ADM占比的提高，共混納米纖維膜的酰胺Ⅱ的吸收峰分別在1 517、1 516、1 516 cm-1處，即其酰胺Ⅱ逐漸呈β折疊構(gòu)象。與純RSF相比，特征吸收峰基本相同，但共混納米纖維膜的β化程度提高了，這是由于ADM與RSF之間形成ADM氫鍵所致。

圖4 不同質(zhì)量比共混納米纖維膜的紅外光譜圖

Fig.4 Infrared spectra of nanofiber membranes with different blending ratioes

2.3.2 熱性能分析

圖5示出RSF與ADM質(zhì)量比為10∶0、9∶1、8∶2時共混納米纖維膜的DSC曲線?？梢钥闯觯?種納米纖維膜在75 ℃附近有1個明顯的吸熱峰，在175 ℃左右有1個階梯狀上升的轉(zhuǎn)變峰。其中：75 ℃的吸熱峰為3種納米纖維膜的失水峰；175 ℃的轉(zhuǎn)變峰是RSF納米纖維的玻璃化轉(zhuǎn)變峰[14]；而260 ℃附近的吸放熱峰可能是由于無規(guī)卷曲或者是α螺旋向β轉(zhuǎn)變所引起的[15]；275 ℃后的峰則是納米纖維膜熱分解所致[16]。 RSF的熱分解溫度與其分子的聚集態(tài)有關(guān)，結(jié)晶度越高，則熱分解所需的能量越高[17]。通過DSC曲線可以得到3種納米纖維膜熱分解所需的能量，分別是114.55、297.90、383.68 J/g。隨著ADM占比的提高，熱分解所需的能量隨之上升，圖中的分解峰的峰型也越來越尖銳，因而以RSF與ADM質(zhì)量比為8∶2的結(jié)晶度最高，這與紅外光譜測試所得到的結(jié)果一致。共混納米纖維膜中ADM占比提高，使得RSF結(jié)構(gòu)中的部分無規(guī)結(jié)構(gòu)及α螺旋逐步向β折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，因而使得共混納米纖維膜中的結(jié)晶度比純RSF高。

圖5 不同質(zhì)量比共混納米纖維膜的DSC曲線

Fig.5 DSC curves a with different blending ratioes of nanofiber membranes

2.4 生物相容性分析

表3示出細胞C2C12在共混納米纖維膜(RSF與ADM質(zhì)量比為9∶1)及空白對照組分別培養(yǎng)1、3、5、7 d后的OD值。可以看出，隨著時間的延長，RSF/ADM共混納米纖維膜及空白對照組的OD值均逐步增大。其中，第1天共混納米纖維膜的OD值略低于空白對照組，但差異性并不顯著(P>0.05)；第5、7天共混納米纖維膜與空白對照組的OD值基本接近，差異性不顯著(P>0.05)；第3天共混納米纖維膜的OD值明顯高于對照組，差異性顯著(P<0.01)。由此說明，靜電紡絲過程中所使用的有機溶劑甲酸沒有殘留，C2C12細胞能夠在RSF/ADM共混納米纖維膜上正常生長、增殖，所制得的RSF/ADM共混納米纖維膜沒有細胞毒性，生物相容性較好。

表3 細胞在不同基質(zhì)上培養(yǎng)后的OD值

Tab.3 OD value of cells after culture ondifferent substrates

時間/dOD值共混納米纖維膜空白P值10.771±0.0830.859±0.0310.13531.660±0.0231.311±0.045<0.0152.644±0.0592.552±0.0280.05172.823±0.0522.829±0.0390.878

3 結(jié) 論

1)在固定再生絲素蛋白(RSF)與脫細胞真皮基質(zhì)(ADM)質(zhì)量比為9∶1的條件下，隨著紡絲液質(zhì)量濃度的降低，所制得的共混納米纖維的直徑逐漸減小，紡絲過程從可紡性較差堵塞針頭到紡絲過程較為穩(wěn)定，再到紡絲出現(xiàn)紡錘形、球形變化。在質(zhì)量濃度為13 g/mL時，所紡得的RSF/ADM納米纖維的形態(tài)較為均勻，平均直徑為616 nm，可紡性較好。

2)其他條件相同的情況下，隨著共混紡絲液中ADM占比的提高，RSF/ADM紡絲液的表觀流動性逐步降低，黏度提高，可紡性逐漸變差，纖維形態(tài)規(guī)整性下降，直至最后無法形成纖維。

3)與純RSF納米纖維膜相比，RSF/ADM共混納米纖維膜中隨ADM加入比例的提高， RSF與ADM中的主體成分膠原蛋白形成了氫鍵，部分無規(guī)構(gòu)型及α螺旋結(jié)構(gòu)逐漸向β折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，共混納米纖維膜的結(jié)晶度提高。

4)細胞增殖實驗的結(jié)果表明，靜電紡過程中使用的有機溶劑甲酸沒有殘留，細胞可以在RSF/ADM共混納米纖維膜上正常生長、增殖，具有良好的生物相容性。