劉洋 曹雪瑋 盧美雅 王富軍，3 趙健

（1. 華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237；2. 浙江孚諾醫(yī)藥股份有限公司，東陽(yáng) 322100；3. 上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所，上海 201203）

從植物和細(xì)菌中分離出來(lái)的多種核糖體失活蛋白（Ribosome-inactivating protein，RIP）不可逆的抑制真核生物細(xì)胞蛋白合成，作為一種潛在的抗腫瘤蛋白藥物已被廣泛研究和應(yīng)用［1-3］。2011年發(fā)現(xiàn)的來(lái)源于類(lèi)鼻疽伯克霍爾德菌的致死因子（Burkholderia lethal factor 1，BLF1），是一種新型細(xì)菌來(lái)源的RIP，其表現(xiàn)出一定的抗腫瘤活性［3］。該細(xì)菌因子通過(guò)對(duì)真核生物轉(zhuǎn)錄翻譯因子4A（eukaryotic initiation translation factor 4A，eIF4A）第339位谷氨酰胺的脫酰胺作用，使eIF4A喪失mRNA解螺旋酶活性，將蛋白質(zhì)合成抑制在翻譯起始階段［4-6］。

現(xiàn)有研究結(jié)果表明，與其他一些植物來(lái)源的I型RIP類(lèi)似［7］，BLF1本身自主進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的效率較低，通常難以有效發(fā)揮其抗腫瘤活性。細(xì)胞穿膜肽（Cell penetrating peptide，CPP）是一類(lèi)被廣泛關(guān)注的體內(nèi)藥物運(yùn)輸載體，其可以跨越細(xì)胞膜將寡核苷酸、多肽和蛋白等高效運(yùn)輸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部［8-11］，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)的來(lái)源于人肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子（HB-EGF）的一種高效穿膜肽（命名為HBP），可以將植物來(lái)源的多種I型RIP如苦瓜MAP30、α-MMC和栝樓TCS等有效導(dǎo)入到腫瘤細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮其藥理活性［12-13］。本研究嘗試將HBP與細(xì)菌來(lái)源的BLF1進(jìn)行融合表達(dá)，以通過(guò)提高BLF1進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的效率來(lái)加強(qiáng)其抗腫瘤藥理作用效果。

齊墩烷型皂苷化合物是植物中一類(lèi)重要的藥理活性成分。這類(lèi)植物皂苷通常由一個(gè)或多個(gè)糖鏈連接到五環(huán)三萜皂甙元組成。研究表明，皂苷化合物可以顯著增強(qiáng)植物來(lái)源的皂草素、植物血凝素等I型RIP對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性［14-15］。商陸皂苷甲（EsA）是從藥用植物商路根部分離得到的一種五環(huán)三萜類(lèi)皂苷，已知的生物學(xué)活性包括調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和凋亡以及抗炎癥等［16］。測(cè)試濃度下ESA沒(méi)有表現(xiàn)出溶血作用，因此將其用于研究在ESA存在下BLF1，BLF-HBP重組蛋白進(jìn)入細(xì)胞效率，抗腫瘤活性以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力的變化。

本研究將穿膜肽HBP與BLF1融合，以及與皂苷ESA聯(lián)用，通過(guò)聯(lián)合使用這兩種策略建立了一種提高蛋白藥物藥效的方式，并成功提高蛋白藥物BLF1的抗腫瘤活性，旨為BLF1進(jìn)一步在抗腫瘤領(lǐng)域的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

構(gòu)建在表達(dá)質(zhì)粒pET16b上的BLF1基因及表達(dá)載體構(gòu)建的引物由蘇州泓迅生物科技有限公司合成。大腸桿菌BL21（DE3）和DH5α購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，表達(dá)質(zhì)粒pET16b和EGFPHBP-pET28a為本實(shí)驗(yàn)室保藏。人宮頸癌細(xì)胞（HeLa）、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞（A549）、人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）、人肝癌細(xì)胞（HepG2）均為本實(shí)驗(yàn)室保存。異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、噻唑藍(lán)（MTT）等均購(gòu)自碧云天公司。商陸皂苷甲（EsA）購(gòu)自新鉑化學(xué)技術(shù)有限公司。重組蛋白序列測(cè)定由華大基因完成。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 BLF1-pET28a表達(dá)載體構(gòu)建：以BLF1-pET16b為模板擴(kuò)增BLF1片段，用含NdeⅠ的正向引物5'-GGGTTTGCCATATGCCGAATA GTCTGGAAG-3'與含XhoⅠ的反向引物5'-CCGCTC GAGTTACTGTTTGCGTTGTTGC-3'通過(guò)PCR擴(kuò)增后，再以NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切回收的PCR產(chǎn)物，與同樣雙酶切處理的載體EGFP-HBP-pET28a連接。

BLF1-HBP-pET28a表達(dá)載體構(gòu)建：以BLF1-pET16b為模板擴(kuò)增BLF1片段，用含NdeⅠ的正向引物5'-GGGTTTGCCATATGCCGAATAGTCTGGA AG-3'與含BamH Ⅰ的反向引物5'-CGACGTCGACTT ATTTGTATTTACGCAGG-3'通過(guò)PCR擴(kuò)增后，再以NdeⅠ和BamH Ⅰ雙酶切回收的PCR產(chǎn)物，與同樣雙酶切處理的載體EGFP-HBP-pET28a連接。以大腸桿菌DH5α為宿主菌轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒，以菌液為模板，用上述引物PCR擴(kuò)增，待菌落PCR驗(yàn)證正確后送公司測(cè)序，進(jìn)行序列比對(duì)確認(rèn)重組質(zhì)粒序列正確性。

1.2.2 重組蛋白的表達(dá)與純化 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）菌株，將得到的陽(yáng)性克隆接種到含30 mL LB培養(yǎng)基的錐形瓶中（含50 μg/mL卡那霉素），37℃培養(yǎng)12 h，然后將2%的菌液接種于含200 mL的LB培養(yǎng)基的錐形瓶中于37℃培養(yǎng)，待菌液濃度OD600達(dá)到0.4-0.6時(shí)，加入1 mmol/L IPTG，在16℃下誘導(dǎo)表達(dá)16 h。3 500 r/min離心15 min收集菌體，重懸于緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，10%甘油，0.5 mol/L NaCl，pH 8.5）中，然后超聲破碎，12 000 r/min離心后取上清液在NI-NTA親和層析柱中進(jìn)行親和層析分離。經(jīng)梯度洗滌后，用含有200 mmol/L 咪唑的緩沖液洗脫收集目標(biāo)蛋白。經(jīng)過(guò)透析液（20 mmol/L Tris-HCl，10%甘油，0.5 mol/L NaCl，pH 7.2）透析去除咪唑，以SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白。純化的重組蛋白在過(guò)濾除菌后-80℃保存。

1.2.3 體外細(xì)胞的培養(yǎng) RPMI-1640（10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素）用于培養(yǎng)A549和HeLa細(xì)胞株，DMEM培養(yǎng)基（10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素）用于MCF-7和HepG2細(xì)胞株，培養(yǎng)箱溫度為37℃，并且含有5% CO2。

1.2.4 藥物蛋白的體外細(xì)胞生長(zhǎng)抑制試驗(yàn) 細(xì)胞按每孔1×104個(gè)接種于96孔板中培養(yǎng)24 h。檢測(cè)EsA對(duì)HepG2、MCF-7、A549和HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用時(shí)，將不同濃度的EsA（0、5、25、50、75、100 μmol/L）分別與上述4種細(xì)胞孵育48 h；檢測(cè)BLF1或 BLF1-HBP重 組 蛋 白 對(duì) HepG2、MCF-7、A549和HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制能力時(shí)，將不同濃度梯度（0、0.123、0.37、1.11、3.33、10 μmol/L） 的 BLF1或BLF1-HBP重組蛋白（存在50 μmol/L EsA時(shí)，BLF1或BLF1-HBP重組蛋白濃度為0、0.32、1.6、8、40、200 nmol/L）分別與上述4種細(xì)胞孵育48 h。然后棄去原有培養(yǎng)基，用終濃度0.5 mg/mL的MTT溶液在37℃下孵育3 h。棄去MTT溶液后每孔加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），通過(guò)酶標(biāo)儀（吸收波長(zhǎng)490 nm）測(cè)定每孔的吸光度以確定細(xì)胞存活率。藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的半抑制濃度（IC50）通過(guò)GraphPad Prime 6軟件計(jì)算得到。

1.2.5 激光共聚焦實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞按每孔1×105個(gè)接種在24孔板中并培養(yǎng)24 h。然后在存在或無(wú)50 μmol/L EsA的情況下，用FITC標(biāo)記的50 μmol/L的BLF1或BLF1-HBP與細(xì)胞孵育6 h。隨后，用PBS沖洗細(xì)胞3次，加入4%多聚甲醛（PFA）。固定30 min后，用PBS洗滌細(xì)胞2次，并用DAPI染色45 min。此后，通過(guò)激光掃描共聚焦顯微鏡（LSCM）檢測(cè)BLF1重組蛋白在細(xì)胞中熒光強(qiáng)度。

1.2.6 凋亡分析 將HeLa細(xì)胞按每孔1×106個(gè)接種在6孔板中培養(yǎng)24 h。分別加入50 μmol/L的EsA，0.5 nmol/L BLF1，0.5 nmol/L BLF1-HBP；存在EsA時(shí)，EsA濃度為50 μmol/L，BLF1或BLF1-HBP濃度為0.1、0.5、2.5、5 nmol/L。處理48 h后，收獲細(xì)胞并用PBS洗滌2次。然后將細(xì)胞重新懸浮于100 μL結(jié)合緩沖液中。此后，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶（PI），將細(xì)胞在20℃下在黑暗中孵育20 min，然后加入400 μL結(jié)合緩沖液。通過(guò)FACScan流式細(xì)胞儀對(duì)經(jīng)處理的樣品進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 BLF1重組蛋白的表達(dá)和純化

為了增加BLF1進(jìn)入腫瘤細(xì)胞效率以有效發(fā)揮其藥理活性，首先構(gòu)建了BLF1以及融合了穿膜肽的BLF1-HBP重組表達(dá)載體（圖1-A）并進(jìn)行表達(dá)與純化，兩種目的蛋白在16℃下均為可溶性表達(dá)，然后通過(guò)NI-NTA親和層析純化目的蛋白。純化得到的BLF1（25.5 kD）和BLF1-HBP（28.47 kD）用12%的SDS-PAGE檢測(cè)，凝膠掃描軟件分析顯示兩種蛋白的純度都在90%以上，可用于后續(xù)藥理活性研究。

圖1 BLF1和BLF1-HBP重組蛋白的表達(dá)載體構(gòu)建（A）和重組蛋白的SDS-PAGE分析（B）

2.2 BLF1重組蛋白對(duì)不同種類(lèi)腫瘤細(xì)胞的毒性

用細(xì)胞生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)（MTT法）分別檢測(cè)BLF1和BLF1-HBP重組蛋白對(duì)4種腫瘤細(xì)胞（HepG2、MCF-7、A549和HeLa）的生長(zhǎng)抑制能力。結(jié)果（圖2）表明重組蛋白對(duì)不同種類(lèi)腫瘤細(xì)胞都具有抑制效應(yīng)，且抑制作用具有劑量依賴(lài)性，而且HBP穿膜肽的引入可顯著增強(qiáng)BLF1對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的毒性。融合穿膜肽HBP的BLF1對(duì)MCF-7、A549、HeLa的藥效比沒(méi)有融合穿膜肽的BLF1分別提高6.96倍、15.53倍、47.16倍（表1），單獨(dú)的BLF1對(duì)HepG2細(xì)胞幾乎沒(méi)有顯示出抑制效果，而HBP-BLF1對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制活性明顯提高，其IC50值約20.4 μmol/L。

圖2 BLF1和BLF1-HBP重組蛋白對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的抑制效果

表1 BLF1和BLF1-HBP重組蛋白對(duì)不同種類(lèi)腫瘤細(xì)胞的半抑制濃度（IC50）

2.3 BLF1和BLF1-HBP重組蛋白在EsA存在下對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制效果

穿膜肽HBP引入后BLF1對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的抑制效果均有明顯提升。由于皂苷類(lèi)化合物可顯著增強(qiáng)植物來(lái)源的RIP對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性，因此我們首先對(duì)一些來(lái)源于傳統(tǒng)中藥的皂苷化合物進(jìn)行了篩選，從中選擇了溶血作用最低的EsA，然后以MTT法檢測(cè)5-100 μmol/L的EsA對(duì)4種腫瘤細(xì)胞（HepG2，MCF-7，A549，HeLa）的生長(zhǎng)抑制能力。結(jié)果（圖 3-A）顯示，5-75 μmol/L的EsA對(duì)上述4種腫瘤細(xì)胞沒(méi)有表現(xiàn)出生長(zhǎng)抑制能力，當(dāng)EsA濃度達(dá)到100 μmol/L時(shí)才對(duì)上述4種腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的毒性。我們選擇50 μmol/L的EsA與BLF1和BLF1-HBP重組蛋白聯(lián)用。

隨后我們?cè)?0 μmol/L的EsA存在下，BLF1以及BLF1-HBP重組蛋白對(duì)4種腫瘤細(xì)胞（HepG2，MCF-7，A549，HeLa）的MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3-B及表2所示。以直方圖（圖3-C）直接表示EsA的存在與否對(duì)重組蛋白IC50數(shù)值的影響。結(jié)果顯示，EsA的存在，顯著提高了BLF1以及BLF1-HBP重組蛋白對(duì)4種腫瘤細(xì)胞抑制作用。例如，在EsA存在下，BLF1對(duì)HeLa細(xì)胞IC50值為22.13 nmol/L，未加EsA時(shí)的IC50值則為102 900 nmol/L，因此EsA的存在可使BLF1對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制活性提高約4 650倍；類(lèi)似的情況也出現(xiàn)在融合了HBP的BLF1-HBP重組蛋白上，其在EsA存在下抗腫瘤活性也大大提高，如對(duì)MCF-7細(xì)胞藥效從EsA不存在時(shí)的IC50值6 840 nmol/L下降到0.52 nmol/L，使得BLF1-HBP對(duì)MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制活性增強(qiáng)12 000倍之多。

圖3 僅EsA或BLF1和BLF1-HBP重組蛋白與EsA聯(lián)用時(shí)對(duì)不同類(lèi)型腫瘤細(xì)胞的抑制效果（A，B）及EsA存在下重組蛋白對(duì)不同種類(lèi)腫瘤細(xì)胞的半抑制濃度（IC50）的影響（C）

同時(shí)，同樣在EsA存在下，引入穿膜肽的BLF1-HBP對(duì)MCF-7的抑制作用比未引入穿膜肽的BLF1重組蛋白更是進(jìn)一步提高了約195.3倍。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，穿膜肽HBP的引入，可顯著提高BLF1重組蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制活性；與EsA的聯(lián)用，更能使BLF1重組蛋白的抗腫瘤活性得到進(jìn)一步的發(fā)揮，促進(jìn)RIP在細(xì)胞內(nèi)高效發(fā)揮抑制蛋白質(zhì)合成、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。

表2 BLF1和BLF1-HBP重組蛋白在EsA存在下對(duì)不同種類(lèi)腫瘤細(xì)胞的半抑制濃度（IC50）

2.4 BLF1和BLF1-HBP重組蛋白進(jìn)入細(xì)胞效率分析

為了觀察這種提升是否是由于EsA促進(jìn)重組蛋白進(jìn)入細(xì)胞效率的提高而導(dǎo)致藥效增強(qiáng)，我們以激光共聚焦顯微鏡來(lái)觀察EsA對(duì)兩種重組蛋白進(jìn)入細(xì)胞效率的影響。將FITC標(biāo)記的BLF1及BLF1-HBP重組蛋白（50 μmol/L）在有無(wú)EsA（50 μmol/L）存在下與HeLa細(xì)胞分別孵育6 h，以激光共聚焦顯微鏡觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。研究顯示，沒(méi)有融合穿膜肽的BLF1與HeLa細(xì)胞共孵育后，未能在胞內(nèi)觀察到明顯的熒光信號(hào)，而融合穿膜肽的BLF1-HBP與HeLa細(xì)胞共孵育后可在胞內(nèi)觀察到強(qiáng)烈的熒光信號(hào)（圖4-A），表明HBP可大大促進(jìn)BLF1-HBP重組蛋白的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。同時(shí)也觀察到在EsA存在下，BLF1和BLF1-HBP兩種重組蛋白在HeLa細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度均有提高，與無(wú)EsA時(shí)共孵育后BLF1在HeLa細(xì)胞中幾乎沒(méi)有熒光的情況相比，在EsA存在下共孵育后可觀察到明顯的熒光。在EsA存在下，BLF1-HBP在細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度可比無(wú)EsA時(shí)增強(qiáng)1.4倍（圖4-B），這個(gè)結(jié)果表明，EsA可有效提升BLF1及BLF1-HBP重組蛋白進(jìn)入細(xì)胞的效率，特別是在無(wú)穿膜肽幫助跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的情況下，這種提升效果尤其明顯，當(dāng)然，有穿膜肽的情況下的穿膜效率更高。

圖4 激光共聚焦檢測(cè)FITC標(biāo)記的重組蛋白進(jìn)入細(xì)胞效率（A）及重組蛋白在細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度（B）

2.5 EsA增強(qiáng)BLF1重組蛋白誘導(dǎo)的凋亡

前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果展示了與EsA的合用可大幅度提升BLF1或BLF1-HBP融合蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制能力。為了闡明這種作用效果的抗腫瘤效應(yīng)，我們通過(guò)Annexin V-FITC/FACS法經(jīng)流式細(xì)胞儀對(duì)重組蛋白抗腫瘤活性進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，與HeLa細(xì)胞孵育48 h后，僅用EsA（50 μmol/L）或者BLF1（0.5 nmol/L）處理的HeLa細(xì)胞基本無(wú)凋亡現(xiàn)象（圖5-A）；而且即使在EsA存在下，沒(méi)有融合穿膜肽的BLF1（0.5 nmol/L）誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的活性也很低（僅6.6%，圖5-B）。但融合有穿膜肽的BLF1-HBP（0.5 nmol/L）對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡率則顯著提升（達(dá)41.29%，是前者的6.26倍）。當(dāng)BLF1-HBP濃度為0.1-5 nmol/L時(shí)，其誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率可為9.19%-88.16%（圖5-B）。因此EsA存在下，穿膜肽HBP顯著增強(qiáng)BLF1蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力。

3 討論

圖5 BLF1重組蛋白在HeLa細(xì)胞中誘導(dǎo)的凋亡檢測(cè)（A）及HeLa細(xì)胞的凋亡率直方圖（B）

類(lèi)似于大多數(shù)植物來(lái)源的I型RIP［7］，微生物來(lái)源的BLF1自身也難以自主進(jìn)入細(xì)胞有效發(fā)揮其藥理活性。為提升BLF1的抗腫瘤效果，改善提高其進(jìn)入細(xì)胞的效率不失為一種簡(jiǎn)便有效的策略。本研究將BLF1與課題組前期研究發(fā)現(xiàn)的一種高效人源性穿膜肽HBP融合［17］，在大腸桿菌BL21（DE3）中進(jìn)行表達(dá)并通過(guò)NI-NTA親和層析純化獲得目的蛋白。MTT實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示引入HBP穿膜肽后，BLF1-HBP重組蛋白比引入前對(duì)HeLa細(xì)胞的活性提升了47.16倍，與課題組前期研究報(bào)道的HBP融合RIP后可以有效提升RIP對(duì)腫瘤細(xì)胞毒性的結(jié)果一致［12-13，18］。而且從實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，沒(méi)有融合穿膜肽的BLF1對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)幾乎沒(méi)有抑制效果，而融合穿膜肽的BLF1-HBP對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的活性顯著提高，IC50值達(dá)20.42 μmol/L，穿膜肽HBP的引入拓展了作為RIP成員之一的BLF1毒蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞的適用范圍。融合了穿膜肽HBP后可有效提高BLF1對(duì)4種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，但HBP對(duì)BLF1藥效增強(qiáng)程度對(duì)4種細(xì)胞不完全相同。課題組前期對(duì)HBP的研究表明HBP通過(guò)結(jié)合細(xì)胞表面硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG）進(jìn)入細(xì)胞［12］，因此我們推測(cè)可能是由于不同細(xì)胞表面HSPG表達(dá)種類(lèi)和數(shù)量的差異導(dǎo)致BLF1-HBP對(duì)不同腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制效果各異，其機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

從植物中提取的皂苷可以增強(qiáng)植物來(lái)源的I型RIP的對(duì)其他真核細(xì)胞的毒性［14-15，19］。目前為止，尚未有報(bào)道研究皂苷是否可以增強(qiáng)來(lái)源于細(xì)菌的RIP對(duì)腫瘤細(xì)胞活性。為進(jìn)一步提高微生物來(lái)源的BLF1重組蛋白抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的能力，我們?cè)谇捌诤Y選的基礎(chǔ)上嘗試了將藥用植物商陸來(lái)源的EsA與BLF1重組蛋白聯(lián)用來(lái)考察是否可提升抗腫瘤效果?？紤]到大多數(shù)皂苷具有溶血活性［20］，選擇了低溶血性EsA來(lái)進(jìn)行試驗(yàn)。EsA在50 μmol/L濃度下不表現(xiàn)出溶血活性，也對(duì)細(xì)胞無(wú)生長(zhǎng)抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，低濃度的EsA可顯著提高BLF1或融合了穿膜肽的BLF1對(duì)所測(cè)試的4種腫瘤細(xì)胞的毒性。上述實(shí)驗(yàn)顯示了穿膜肽HBP的引入和皂苷EsA聯(lián)用對(duì)提升BLF1重組蛋白在腫瘤細(xì)胞中活性均發(fā)揮了重要作用。

皂苷作為一種兩性化合物其可通過(guò)與膜脂的相互作用改變膜的通透性［21-22］，使得細(xì)胞膜滲透率發(fā)生變化［23-24］，由此推測(cè)EsA可能改變了細(xì)胞膜的通透性從而提高了重組蛋白進(jìn)入細(xì)胞效率使其有效發(fā)揮生物學(xué)活性，因此用FITC標(biāo)記BLF1和BLF1-HBP重組蛋白，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察EsA的存在是否促進(jìn)了重組蛋白進(jìn)入細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果顯示EsA存在下BLF1和BLF1-HBP在HeLa細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度均有顯著提高，表明EsA確實(shí)有利于促進(jìn)重組蛋白進(jìn)入細(xì)胞的效率。

此外，觀察到EsA存在下BLF1和BLF1-HBP對(duì)4種腫瘤細(xì)胞IC50值降低均非常顯著，如EsA存在下BLF1-HBP對(duì)HeLa的IC50值從無(wú)EsA時(shí)的2 180 nmol/L下降到0.52 nmol/L，藥效提高達(dá)4 192倍。但兩種重組蛋白在EsA存在下細(xì)胞中熒光強(qiáng)度增強(qiáng)倍數(shù)十分有限，如EsA存在下BLF1-HBP在HeLa細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度比無(wú)EsA時(shí)僅增強(qiáng)1.4倍，表明EsA促進(jìn)重組蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞提高藥效并非僅僅由于促進(jìn)藥物蛋白進(jìn)入細(xì)胞的數(shù)量所致。文獻(xiàn)報(bào)道大多數(shù)藥物蛋白一般通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用形成的內(nèi)吞體囊泡進(jìn)入細(xì)胞，隨后被遞送到溶酶體中，大部分在溶酶體酶作用下被降解，只有少量被釋放到細(xì)胞質(zhì)到達(dá)其作用部位，因此嚴(yán)重限制蛋白藥物發(fā)揮藥理活性及其在臨床上的應(yīng)用［25］。由于皂苷可以與細(xì)胞膜上脂質(zhì)相互作用，從而在細(xì)胞膜上形成孔樣結(jié)構(gòu)，因此我們推測(cè)EsA不僅改變了細(xì)胞外周膜的通透性，提高重組蛋白進(jìn)入細(xì)胞效率，同時(shí)可能也作用于胞內(nèi)內(nèi)吞體和溶酶體的單層膜，破壞其完整性，使進(jìn)入內(nèi)吞體/溶酶體的藥物蛋白有效釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)發(fā)揮藥理活性。BLF1必須與細(xì)胞質(zhì)中的核糖體蛋白結(jié)合后才能發(fā)揮抑制細(xì)胞蛋白質(zhì)合成、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。因此，本研究中穿膜肽的應(yīng)用和皂苷的聯(lián)用都有效提高了蛋白藥物在細(xì)胞質(zhì)中濃度，從而顯著提高了藥物蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的抑制效應(yīng)。

4 結(jié)論

通過(guò)將穿膜肽HBP與BLF1融合表達(dá)，增強(qiáng)了BLF1對(duì)多種腫瘤細(xì)胞尤其是抑制肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的活性。植物皂苷EsA聯(lián)用更使得BLF1重組蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖的抑制作用得到進(jìn)一步顯著提高。流式凋亡實(shí)驗(yàn)分析表明EsA通過(guò)強(qiáng)化BLF1-HBP誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞的凋亡途徑而顯著提高其對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性。［1］Walsh MJ, Dodd JE, Haubergue GM, et al. Ribosome-inactivating proteins：potent poisons and molecular tools［J］. Virulence, 2013, 4：774-784.