劉洋 曹雪瑋 盧美雅 王富軍，3 趙健

（1. 華東理工大學生物反應器工程重點實驗室，上海 200237；2. 浙江孚諾醫(yī)藥股份有限公司，東陽 322100；3. 上海中醫(yī)藥大學中藥研究所，上海 201203）

從植物和細菌中分離出來的多種核糖體失活蛋白（Ribosome-inactivating protein，RIP）不可逆的抑制真核生物細胞蛋白合成，作為一種潛在的抗腫瘤蛋白藥物已被廣泛研究和應用［1-3］。2011年發(fā)現(xiàn)的來源于類鼻疽伯克霍爾德菌的致死因子（Burkholderia lethal factor 1，BLF1），是一種新型細菌來源的RIP，其表現(xiàn)出一定的抗腫瘤活性［3］。該細菌因子通過對真核生物轉(zhuǎn)錄翻譯因子4A（eukaryotic initiation translation factor 4A，eIF4A）第339位谷氨酰胺的脫酰胺作用，使eIF4A喪失mRNA解螺旋酶活性，將蛋白質(zhì)合成抑制在翻譯起始階段［4-6］。

現(xiàn)有研究結(jié)果表明，與其他一些植物來源的I型RIP類似［7］，BLF1本身自主進入腫瘤細胞的效率較低，通常難以有效發(fā)揮其抗腫瘤活性。細胞穿膜肽（Cell penetrating peptide，CPP）是一類被廣泛關(guān)注的體內(nèi)藥物運輸載體，其可以跨越細胞膜將寡核苷酸、多肽和蛋白等高效運輸進入細胞內(nèi)部［8-11］，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)的來源于人肝素結(jié)合表皮生長因子（HB-EGF）的一種高效穿膜肽（命名為HBP），可以將植物來源的多種I型RIP如苦瓜MAP30、α-MMC和栝樓TCS等有效導入到腫瘤細胞內(nèi)發(fā)揮其藥理活性［12-13］。本研究嘗試將HBP與細菌來源的BLF1進行融合表達，以通過提高BLF1進入腫瘤細胞的效率來加強其抗腫瘤藥理作用效果。

齊墩烷型皂苷化合物是植物中一類重要的藥理活性成分。這類植物皂苷通常由一個或多個糖鏈連接到五環(huán)三萜皂甙元組成。研究表明，皂苷化合物可以顯著增強植物來源的皂草素、植物血凝素等I型RIP對腫瘤細胞的毒性［14-15］。商陸皂苷甲（EsA）是從藥用植物商路根部分離得到的一種五環(huán)三萜類皂苷，已知的生物學活性包括調(diào)節(jié)免疫應答，誘導細胞增殖和凋亡以及抗炎癥等［16］。測試濃度下ESA沒有表現(xiàn)出溶血作用，因此將其用于研究在ESA存在下BLF1，BLF-HBP重組蛋白進入細胞效率，抗腫瘤活性以及誘導細胞凋亡能力的變化。

本研究將穿膜肽HBP與BLF1融合，以及與皂苷ESA聯(lián)用，通過聯(lián)合使用這兩種策略建立了一種提高蛋白藥物藥效的方式，并成功提高蛋白藥物BLF1的抗腫瘤活性，旨為BLF1進一步在抗腫瘤領(lǐng)域的應用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

構(gòu)建在表達質(zhì)粒pET16b上的BLF1基因及表達載體構(gòu)建的引物由蘇州泓迅生物科技有限公司合成。大腸桿菌BL21（DE3）和DH5α購自北京康為世紀生物科技有限公司，表達質(zhì)粒pET16b和EGFPHBP-pET28a為本實驗室保藏。人宮頸癌細胞（HeLa）、人非小細胞肺癌細胞（A549）、人乳腺癌細胞（MCF-7）、人肝癌細胞（HepG2）均為本實驗室保存。異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、噻唑藍（MTT）等均購自碧云天公司。商陸皂苷甲（EsA）購自新鉑化學技術(shù)有限公司。重組蛋白序列測定由華大基因完成。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 BLF1-pET28a表達載體構(gòu)建：以BLF1-pET16b為模板擴增BLF1片段，用含NdeⅠ的正向引物5'-GGGTTTGCCATATGCCGAATA GTCTGGAAG-3'與含XhoⅠ的反向引物5'-CCGCTC GAGTTACTGTTTGCGTTGTTGC-3'通過PCR擴增后，再以NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切回收的PCR產(chǎn)物，與同樣雙酶切處理的載體EGFP-HBP-pET28a連接。

BLF1-HBP-pET28a表達載體構(gòu)建：以BLF1-pET16b為模板擴增BLF1片段，用含NdeⅠ的正向引物5'-GGGTTTGCCATATGCCGAATAGTCTGGA AG-3'與含BamH Ⅰ的反向引物5'-CGACGTCGACTT ATTTGTATTTACGCAGG-3'通過PCR擴增后，再以NdeⅠ和BamH Ⅰ雙酶切回收的PCR產(chǎn)物，與同樣雙酶切處理的載體EGFP-HBP-pET28a連接。以大腸桿菌DH5α為宿主菌轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒，以菌液為模板，用上述引物PCR擴增，待菌落PCR驗證正確后送公司測序，進行序列比對確認重組質(zhì)粒序列正確性。

1.2.2 重組蛋白的表達與純化 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）菌株，將得到的陽性克隆接種到含30 mL LB培養(yǎng)基的錐形瓶中（含50 μg/mL卡那霉素），37℃培養(yǎng)12 h，然后將2%的菌液接種于含200 mL的LB培養(yǎng)基的錐形瓶中于37℃培養(yǎng)，待菌液濃度OD600達到0.4-0.6時，加入1 mmol/L IPTG，在16℃下誘導表達16 h。3 500 r/min離心15 min收集菌體，重懸于緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，10%甘油，0.5 mol/L NaCl，pH 8.5）中，然后超聲破碎，12 000 r/min離心后取上清液在NI-NTA親和層析柱中進行親和層析分離。經(jīng)梯度洗滌后，用含有200 mmol/L 咪唑的緩沖液洗脫收集目標蛋白。經(jīng)過透析液（20 mmol/L Tris-HCl，10%甘油，0.5 mol/L NaCl，pH 7.2）透析去除咪唑，以SDS-PAGE檢測目的蛋白。純化的重組蛋白在過濾除菌后-80℃保存。

1.2.3 體外細胞的培養(yǎng) RPMI-1640（10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素）用于培養(yǎng)A549和HeLa細胞株，DMEM培養(yǎng)基（10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素）用于MCF-7和HepG2細胞株，培養(yǎng)箱溫度為37℃，并且含有5% CO2。

1.2.4 藥物蛋白的體外細胞生長抑制試驗 細胞按每孔1×104個接種于96孔板中培養(yǎng)24 h。檢測EsA對HepG2、MCF-7、A549和HeLa細胞生長抑制作用時，將不同濃度的EsA（0、5、25、50、75、100 μmol/L）分別與上述4種細胞孵育48 h；檢測BLF1或 BLF1-HBP重 組 蛋 白 對 HepG2、MCF-7、A549和HeLa細胞的生長抑制能力時，將不同濃度梯度（0、0.123、0.37、1.11、3.33、10 μmol/L） 的 BLF1或BLF1-HBP重組蛋白（存在50 μmol/L EsA時，BLF1或BLF1-HBP重組蛋白濃度為0、0.32、1.6、8、40、200 nmol/L）分別與上述4種細胞孵育48 h。然后棄去原有培養(yǎng)基，用終濃度0.5 mg/mL的MTT溶液在37℃下孵育3 h。棄去MTT溶液后每孔加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），通過酶標儀（吸收波長490 nm）測定每孔的吸光度以確定細胞存活率。藥物對腫瘤細胞的半抑制濃度（IC50）通過GraphPad Prime 6軟件計算得到。

1.2.5 激光共聚焦實驗 將細胞按每孔1×105個接種在24孔板中并培養(yǎng)24 h。然后在存在或無50 μmol/L EsA的情況下，用FITC標記的50 μmol/L的BLF1或BLF1-HBP與細胞孵育6 h。隨后，用PBS沖洗細胞3次，加入4%多聚甲醛（PFA）。固定30 min后，用PBS洗滌細胞2次，并用DAPI染色45 min。此后，通過激光掃描共聚焦顯微鏡（LSCM）檢測BLF1重組蛋白在細胞中熒光強度。

1.2.6 凋亡分析 將HeLa細胞按每孔1×106個接種在6孔板中培養(yǎng)24 h。分別加入50 μmol/L的EsA，0.5 nmol/L BLF1，0.5 nmol/L BLF1-HBP；存在EsA時，EsA濃度為50 μmol/L，BLF1或BLF1-HBP濃度為0.1、0.5、2.5、5 nmol/L。處理48 h后，收獲細胞并用PBS洗滌2次。然后將細胞重新懸浮于100 μL結(jié)合緩沖液中。此后，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶（PI），將細胞在20℃下在黑暗中孵育20 min，然后加入400 μL結(jié)合緩沖液。通過FACScan流式細胞儀對經(jīng)處理的樣品進行分析。

2 結(jié)果

2.1 BLF1重組蛋白的表達和純化

為了增加BLF1進入腫瘤細胞效率以有效發(fā)揮其藥理活性，首先構(gòu)建了BLF1以及融合了穿膜肽的BLF1-HBP重組表達載體（圖1-A）并進行表達與純化，兩種目的蛋白在16℃下均為可溶性表達，然后通過NI-NTA親和層析純化目的蛋白。純化得到的BLF1（25.5 kD）和BLF1-HBP（28.47 kD）用12%的SDS-PAGE檢測，凝膠掃描軟件分析顯示兩種蛋白的純度都在90%以上，可用于后續(xù)藥理活性研究。

圖1 BLF1和BLF1-HBP重組蛋白的表達載體構(gòu)建（A）和重組蛋白的SDS-PAGE分析（B）

2.2 BLF1重組蛋白對不同種類腫瘤細胞的毒性

用細胞生長抑制實驗（MTT法）分別檢測BLF1和BLF1-HBP重組蛋白對4種腫瘤細胞（HepG2、MCF-7、A549和HeLa）的生長抑制能力。結(jié)果（圖2）表明重組蛋白對不同種類腫瘤細胞都具有抑制效應，且抑制作用具有劑量依賴性，而且HBP穿膜肽的引入可顯著增強BLF1對不同腫瘤細胞的毒性。融合穿膜肽HBP的BLF1對MCF-7、A549、HeLa的藥效比沒有融合穿膜肽的BLF1分別提高6.96倍、15.53倍、47.16倍（表1），單獨的BLF1對HepG2細胞幾乎沒有顯示出抑制效果，而HBP-BLF1對HepG2細胞的抑制活性明顯提高，其IC50值約20.4 μmol/L。

圖2 BLF1和BLF1-HBP重組蛋白對不同腫瘤細胞的抑制效果

表1 BLF1和BLF1-HBP重組蛋白對不同種類腫瘤細胞的半抑制濃度（IC50）

2.3 BLF1和BLF1-HBP重組蛋白在EsA存在下對腫瘤細胞的抑制效果

穿膜肽HBP引入后BLF1對不同腫瘤細胞的抑制效果均有明顯提升。由于皂苷類化合物可顯著增強植物來源的RIP對腫瘤細胞的毒性，因此我們首先對一些來源于傳統(tǒng)中藥的皂苷化合物進行了篩選，從中選擇了溶血作用最低的EsA，然后以MTT法檢測5-100 μmol/L的EsA對4種腫瘤細胞（HepG2，MCF-7，A549，HeLa）的生長抑制能力。結(jié)果（圖 3-A）顯示，5-75 μmol/L的EsA對上述4種腫瘤細胞沒有表現(xiàn)出生長抑制能力，當EsA濃度達到100 μmol/L時才對上述4種腫瘤細胞表現(xiàn)出明顯的毒性。我們選擇50 μmol/L的EsA與BLF1和BLF1-HBP重組蛋白聯(lián)用。

隨后我們在50 μmol/L的EsA存在下，BLF1以及BLF1-HBP重組蛋白對4種腫瘤細胞（HepG2，MCF-7，A549，HeLa）的MTT實驗結(jié)果如圖3-B及表2所示。以直方圖（圖3-C）直接表示EsA的存在與否對重組蛋白IC50數(shù)值的影響。結(jié)果顯示，EsA的存在，顯著提高了BLF1以及BLF1-HBP重組蛋白對4種腫瘤細胞抑制作用。例如，在EsA存在下，BLF1對HeLa細胞IC50值為22.13 nmol/L，未加EsA時的IC50值則為102 900 nmol/L，因此EsA的存在可使BLF1對腫瘤細胞抑制活性提高約4 650倍；類似的情況也出現(xiàn)在融合了HBP的BLF1-HBP重組蛋白上，其在EsA存在下抗腫瘤活性也大大提高，如對MCF-7細胞藥效從EsA不存在時的IC50值6 840 nmol/L下降到0.52 nmol/L，使得BLF1-HBP對MCF-7細胞的生長抑制活性增強12 000倍之多。

圖3 僅EsA或BLF1和BLF1-HBP重組蛋白與EsA聯(lián)用時對不同類型腫瘤細胞的抑制效果（A，B）及EsA存在下重組蛋白對不同種類腫瘤細胞的半抑制濃度（IC50）的影響（C）

同時，同樣在EsA存在下，引入穿膜肽的BLF1-HBP對MCF-7的抑制作用比未引入穿膜肽的BLF1重組蛋白更是進一步提高了約195.3倍。這些實驗結(jié)果表明，穿膜肽HBP的引入，可顯著提高BLF1重組蛋白對腫瘤細胞生長的抑制活性；與EsA的聯(lián)用，更能使BLF1重組蛋白的抗腫瘤活性得到進一步的發(fā)揮，促進RIP在細胞內(nèi)高效發(fā)揮抑制蛋白質(zhì)合成、誘導細胞凋亡的作用。

表2 BLF1和BLF1-HBP重組蛋白在EsA存在下對不同種類腫瘤細胞的半抑制濃度（IC50）

2.4 BLF1和BLF1-HBP重組蛋白進入細胞效率分析

為了觀察這種提升是否是由于EsA促進重組蛋白進入細胞效率的提高而導致藥效增強，我們以激光共聚焦顯微鏡來觀察EsA對兩種重組蛋白進入細胞效率的影響。將FITC標記的BLF1及BLF1-HBP重組蛋白（50 μmol/L）在有無EsA（50 μmol/L）存在下與HeLa細胞分別孵育6 h，以激光共聚焦顯微鏡觀察實驗結(jié)果。研究顯示，沒有融合穿膜肽的BLF1與HeLa細胞共孵育后，未能在胞內(nèi)觀察到明顯的熒光信號，而融合穿膜肽的BLF1-HBP與HeLa細胞共孵育后可在胞內(nèi)觀察到強烈的熒光信號（圖4-A），表明HBP可大大促進BLF1-HBP重組蛋白的跨膜轉(zhuǎn)運。同時也觀察到在EsA存在下，BLF1和BLF1-HBP兩種重組蛋白在HeLa細胞中的熒光強度均有提高，與無EsA時共孵育后BLF1在HeLa細胞中幾乎沒有熒光的情況相比，在EsA存在下共孵育后可觀察到明顯的熒光。在EsA存在下，BLF1-HBP在細胞中的熒光強度可比無EsA時增強1.4倍（圖4-B），這個結(jié)果表明，EsA可有效提升BLF1及BLF1-HBP重組蛋白進入細胞的效率，特別是在無穿膜肽幫助跨膜轉(zhuǎn)運的情況下，這種提升效果尤其明顯，當然，有穿膜肽的情況下的穿膜效率更高。

圖4 激光共聚焦檢測FITC標記的重組蛋白進入細胞效率（A）及重組蛋白在細胞中的熒光強度（B）

2.5 EsA增強BLF1重組蛋白誘導的凋亡

前期實驗結(jié)果展示了與EsA的合用可大幅度提升BLF1或BLF1-HBP融合蛋白對腫瘤細胞的生長抑制能力。為了闡明這種作用效果的抗腫瘤效應，我們通過Annexin V-FITC/FACS法經(jīng)流式細胞儀對重組蛋白抗腫瘤活性進行分析。結(jié)果顯示，與HeLa細胞孵育48 h后，僅用EsA（50 μmol/L）或者BLF1（0.5 nmol/L）處理的HeLa細胞基本無凋亡現(xiàn)象（圖5-A）；而且即使在EsA存在下，沒有融合穿膜肽的BLF1（0.5 nmol/L）誘導HeLa細胞凋亡的活性也很低（僅6.6%，圖5-B）。但融合有穿膜肽的BLF1-HBP（0.5 nmol/L）對HeLa細胞凋亡率則顯著提升（達41.29%，是前者的6.26倍）。當BLF1-HBP濃度為0.1-5 nmol/L時，其誘導的細胞凋亡率可為9.19%-88.16%（圖5-B）。因此EsA存在下，穿膜肽HBP顯著增強BLF1蛋白誘導細胞凋亡的能力。

3 討論

圖5 BLF1重組蛋白在HeLa細胞中誘導的凋亡檢測（A）及HeLa細胞的凋亡率直方圖（B）

類似于大多數(shù)植物來源的I型RIP［7］，微生物來源的BLF1自身也難以自主進入細胞有效發(fā)揮其藥理活性。為提升BLF1的抗腫瘤效果，改善提高其進入細胞的效率不失為一種簡便有效的策略。本研究將BLF1與課題組前期研究發(fā)現(xiàn)的一種高效人源性穿膜肽HBP融合［17］，在大腸桿菌BL21（DE3）中進行表達并通過NI-NTA親和層析純化獲得目的蛋白。MTT實驗的結(jié)果顯示引入HBP穿膜肽后，BLF1-HBP重組蛋白比引入前對HeLa細胞的活性提升了47.16倍，與課題組前期研究報道的HBP融合RIP后可以有效提升RIP對腫瘤細胞毒性的結(jié)果一致［12-13，18］。而且從實驗中也發(fā)現(xiàn)，沒有融合穿膜肽的BLF1對HepG2肝癌細胞的生長幾乎沒有抑制效果，而融合穿膜肽的BLF1-HBP對肝癌細胞HepG2的活性顯著提高，IC50值達20.42 μmol/L，穿膜肽HBP的引入拓展了作為RIP成員之一的BLF1毒蛋白對腫瘤細胞的適用范圍。融合了穿膜肽HBP后可有效提高BLF1對4種腫瘤細胞的生長抑制作用，但HBP對BLF1藥效增強程度對4種細胞不完全相同。課題組前期對HBP的研究表明HBP通過結(jié)合細胞表面硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG）進入細胞［12］，因此我們推測可能是由于不同細胞表面HSPG表達種類和數(shù)量的差異導致BLF1-HBP對不同腫瘤細胞生長抑制效果各異，其機制有待于進一步研究。

從植物中提取的皂苷可以增強植物來源的I型RIP的對其他真核細胞的毒性［14-15，19］。目前為止，尚未有報道研究皂苷是否可以增強來源于細菌的RIP對腫瘤細胞活性。為進一步提高微生物來源的BLF1重組蛋白抑制腫瘤細胞生長增殖的能力，我們在前期篩選的基礎(chǔ)上嘗試了將藥用植物商陸來源的EsA與BLF1重組蛋白聯(lián)用來考察是否可提升抗腫瘤效果?？紤]到大多數(shù)皂苷具有溶血活性［20］，選擇了低溶血性EsA來進行試驗。EsA在50 μmol/L濃度下不表現(xiàn)出溶血活性，也對細胞無生長抑制作用。實驗結(jié)果顯示，低濃度的EsA可顯著提高BLF1或融合了穿膜肽的BLF1對所測試的4種腫瘤細胞的毒性。上述實驗顯示了穿膜肽HBP的引入和皂苷EsA聯(lián)用對提升BLF1重組蛋白在腫瘤細胞中活性均發(fā)揮了重要作用。

皂苷作為一種兩性化合物其可通過與膜脂的相互作用改變膜的通透性［21-22］，使得細胞膜滲透率發(fā)生變化［23-24］，由此推測EsA可能改變了細胞膜的通透性從而提高了重組蛋白進入細胞效率使其有效發(fā)揮生物學活性，因此用FITC標記BLF1和BLF1-HBP重組蛋白，通過激光共聚焦顯微鏡觀察EsA的存在是否促進了重組蛋白進入細胞數(shù)量，結(jié)果顯示EsA存在下BLF1和BLF1-HBP在HeLa細胞中的熒光強度均有顯著提高，表明EsA確實有利于促進重組蛋白進入細胞的效率。

此外，觀察到EsA存在下BLF1和BLF1-HBP對4種腫瘤細胞IC50值降低均非常顯著，如EsA存在下BLF1-HBP對HeLa的IC50值從無EsA時的2 180 nmol/L下降到0.52 nmol/L，藥效提高達4 192倍。但兩種重組蛋白在EsA存在下細胞中熒光強度增強倍數(shù)十分有限，如EsA存在下BLF1-HBP在HeLa細胞中的熒光強度比無EsA時僅增強1.4倍，表明EsA促進重組蛋白對腫瘤細胞提高藥效并非僅僅由于促進藥物蛋白進入細胞的數(shù)量所致。文獻報道大多數(shù)藥物蛋白一般通過受體介導的內(nèi)吞作用形成的內(nèi)吞體囊泡進入細胞，隨后被遞送到溶酶體中，大部分在溶酶體酶作用下被降解，只有少量被釋放到細胞質(zhì)到達其作用部位，因此嚴重限制蛋白藥物發(fā)揮藥理活性及其在臨床上的應用［25］。由于皂苷可以與細胞膜上脂質(zhì)相互作用，從而在細胞膜上形成孔樣結(jié)構(gòu)，因此我們推測EsA不僅改變了細胞外周膜的通透性，提高重組蛋白進入細胞效率，同時可能也作用于胞內(nèi)內(nèi)吞體和溶酶體的單層膜，破壞其完整性，使進入內(nèi)吞體/溶酶體的藥物蛋白有效釋放進入細胞質(zhì)發(fā)揮藥理活性。BLF1必須與細胞質(zhì)中的核糖體蛋白結(jié)合后才能發(fā)揮抑制細胞蛋白質(zhì)合成、誘導細胞凋亡的作用。因此，本研究中穿膜肽的應用和皂苷的聯(lián)用都有效提高了蛋白藥物在細胞質(zhì)中濃度，從而顯著提高了藥物蛋白對腫瘤細胞生長增殖的抑制效應。

4 結(jié)論

通過將穿膜肽HBP與BLF1融合表達，增強了BLF1對多種腫瘤細胞尤其是抑制肝癌細胞HepG2細胞生長的活性。植物皂苷EsA聯(lián)用更使得BLF1重組蛋白對腫瘤細胞的增殖的抑制作用得到進一步顯著提高。流式凋亡實驗分析表明EsA通過強化BLF1-HBP誘導HeLa細胞的凋亡途徑而顯著提高其對腫瘤細胞的毒性。［1］Walsh MJ, Dodd JE, Haubergue GM, et al. Ribosome-inactivating proteins：potent poisons and molecular tools［J］. Virulence, 2013, 4：774-784.