鄒坤 崔紅艷 薛緣 張少偉 路麗麗 趙志輝 蘇瑛

（廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湛江 524088）

早期卵泡的發(fā)育在家禽繁殖性狀有著至關(guān)重要的作用，它主要受下丘腦-垂體-卵巢軸分泌的激素調(diào)控［1］。促卵泡素受體（Follicle stimulating hormone，F(xiàn)SHR）和雌激素受體（Estrogen alpha，ESR1）是卵泡發(fā)育的重要激素受體，其表達(dá)量高低與家禽產(chǎn)蛋量顯著相關(guān)［2］。近些年，針對FSHR在家禽的研究主要集中在雞，研究發(fā)現(xiàn)FSHR在雞的表達(dá)主要在性腺且初次表達(dá)也是在性腺，它是通過介導(dǎo)FSH激活cAMP信號通路促進(jìn)顆粒細(xì)胞分泌促黃體生成素、生長轉(zhuǎn)化因子（Transforming growth factor，TGF）、雌激素（Estrogen，ES）等激素和生長因子，同時通過信號分子激活TGF-β、ERK以及AKT等信號通路共同作用促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖，從而促進(jìn)卵泡的發(fā)育和成熟［3］。Xu等［4］發(fā)現(xiàn)FSHR的單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）與番鴨的產(chǎn)蛋量顯著相關(guān)，且發(fā)現(xiàn)番鴨FSHR與雞（93.2%）、綠頭鴨（95.7%）具有高度同源性。ESR1則是一個多功能基因，它表達(dá)在動物體內(nèi)絕大多數(shù)組織，且在不同組織中功能也不同。ESR1既可以通過介導(dǎo)ES激活ERK信號通路，調(diào)節(jié)磷酸化作用增強或抑制功能基因的轉(zhuǎn)錄，又可以介導(dǎo)Caspase信號通路使細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子和白細(xì)胞介素調(diào)控顆粒細(xì)胞凋亡或癌變［5-6］。但大量研究表明ESR1在動物卵巢的主要作用是控制動物產(chǎn)仔數(shù)和促進(jìn)性成熟［7-8］。此外，ESR的PvuⅡ多態(tài)性與動物的繁殖性狀密切相關(guān)［8］。

雷州黑鴨是分布于雷州半島海灘的優(yōu)質(zhì)灘涂鴨種，其主要以蝦蟹貝類為食，且具有開產(chǎn)期早（120 d）、產(chǎn)蛋期長（2年）、產(chǎn)蛋量高（280/500 d）、綠殼率高（80%）等特性［9］。通過對其解剖發(fā)現(xiàn)其卵巢具有豐富的卵泡（圖1），在繁殖性能具有巨大的開發(fā)價值。綜上所述，F(xiàn)SHR和ESR對雷州黑鴨的繁殖性能可能有密切的關(guān)系。因此，本研究通過對雷州黑鴨FSHR和ESR1基因在性腺軸的表達(dá)規(guī)律研究和產(chǎn)蛋關(guān)聯(lián)分析，旨在揭示2個基因?qū)字莺邙喸缙谛韵俚恼{(diào)控機制以及對繁殖性能的影響，為雷州黑鴨分子育種提供靶位點以及為優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源的開發(fā)提供理論依據(jù)。

圖1 180日齡雷州黑鴨和卵巢組織

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用雷州黑鴨由湛江市坡頭區(qū)恒成種養(yǎng)合作社提供，所有鴨單籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)水平、大小、體型、世代均一致。隨機挑選25只雷州黑鴨用于采集下丘腦、垂體、卵巢組織測量FSHR和ESR1表達(dá)量（0、30、60、90和120 d，每個時期5只），117只飼喂至300 d用于FSHR和ESR1的繁殖性狀關(guān)聯(lián)分析，統(tǒng)計開產(chǎn)期（FEA）、開產(chǎn)蛋重（FEW）、開產(chǎn)體重（FIW）、120 d產(chǎn)蛋數(shù)（120E）、180 d產(chǎn)蛋數(shù)（180E）、240 d產(chǎn)蛋數(shù)（240E）、300 d產(chǎn)蛋數(shù)（300E）及300 d蛋品質(zhì)測試，指標(biāo)包括蛋重、蛋形指數(shù)、蛋殼強度、哈夫單位、蛋黃重、蛋白重和蛋白高度。在300 d，每個個體采血1 mL用于提取DNA，篩選SNP。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取和cDNA的合成 根據(jù)TransZol Up Plus Kit（Trans，廣州）試劑盒分別對 0 d、30 d、60 d、90 d和120 d的下丘腦、垂體、卵巢組織進(jìn)行總RNA提取。提取的總RNA通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，根據(jù)TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix（Trans，廣州）試劑盒說明書進(jìn)行cDNA合成，并將cDNA于-20℃冰箱保存。

1.2.2 引物設(shè)計與熒光定量 根據(jù)GenBank上的綠頭野鴨的基因序列，用Primer 3.0分別對FSHR（Gene ID：XM_005012095.2）、ESR1（Gene ID：101802318）和 β-actin（Gene ID ：NM_001310421.1）設(shè)計引物（表1）。按照ChamQTM SYBR qPCR Master Mix 7750（Trans，廣州）熒光定量試劑盒，在Applied Biosystems StepOnePlus（美國）熒光定量PCR上對0 d、30 d、60 d、90 d和120 d的下丘腦、垂體和卵巢組織進(jìn)行熒光定量。PCR反應(yīng)體系 ：10 μL ChamQTM SYBR qPCR Master Mix（1×），0.4 μL PCR Forward Primer（0.4 μmol/L），0.4 μL PCR Reverse Primer（0.4 μmol/L），0.4 μL ROX Reference Dye（1×），2.0 μL cDNA，6.8 μL ddH2O，總體積 20 μL。反應(yīng)程序：94℃，35 s；（94℃，20 s；57℃，35 s；采光；72℃，25 s）40個循環(huán)；95℃，15 s；60℃，1 min；95℃，15 s。

1.2.3 DNA提取和DNA池構(gòu)建 根據(jù)HiPure Blood DNA Mini Kit（Megen，廣州）試劑盒對117只雷州黑鴨血液DNA進(jìn)行提取，對提取的DNA通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，以117個雷州黑鴨的DNA作為構(gòu)建DNA池的樣品。隨機挑選30個樣品進(jìn)行用于篩選SNP。根據(jù)NCBI公布的綠頭野 鴨 FSHR（Gene ID：XM_101800482） 和 ESR1（ENSAPLG00000004585）的外顯子和內(nèi)含子序列設(shè)計PCR引物（表1）。用FSHR和ESR1作為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系：2 μL cDNA，1 μL正向引物，1 μL 反向引物，25 μL Premix Taq（TaKaRa，大連）和 21 μL dd H2O。反應(yīng)程序：（98℃，10 s；55℃，30 s；72℃，1 min）30個循環(huán)。最終的PCR產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳并測序。

1.2.4 SNP篩選和基因分型 利用DNAMAN對PCR產(chǎn)物測序的序列進(jìn)行分析比對并篩選SNP位點。根據(jù)篩選到的FSHR的兩個突變位點和ESR1的一個位點進(jìn)行引物設(shè)計（表1），然后用PCR-SSCP［10］方法對篩選到的3個SNP位點進(jìn)行基因分型。在聚丙烯酰胺凝膠上挑選不同類型的條帶進(jìn)行測序。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 根據(jù)2-ΔΔCT方法處理熒光定量數(shù)據(jù)。利用一般線性模型對FSHR和ESR1突變基因型進(jìn)行分析：Yij= μ+Gi+eij（Yij：不同性狀觀測值；μ：總?cè)后w平均值；Gi：每個基因型的影響；eij：隨機誤差）。

2 結(jié)果

2.1 FSHR和ESR1的表達(dá)規(guī)律

本研究對雷州黑鴨0 d、30 d、60 d、90 d和120 d的下丘腦、垂體、卵巢組織的FSHR和ESR1進(jìn)行熒光定量。如圖2所示，F(xiàn)SHR在下丘腦和垂體的表達(dá)量在0-90 d呈穩(wěn)定上升趨勢，在90-120 d下降，90 d表達(dá)量最高，且在下丘腦90 d表達(dá)量與0 d表達(dá)量差異顯著（P＜0.05）；在卵巢0-120 d的表達(dá)量總體呈上升趨勢，在120 d表達(dá)量達(dá)到最高，但與其他時期無顯著差異（P＞0.05）。如圖3所示，ESR1在0-120 d所測組織的表達(dá)量存在波動，除90-120 d垂體表達(dá)量下降，其總體表達(dá)呈上升趨勢。ESR1在下丘腦和卵巢120 d表達(dá)量最高，而在垂體90 d表達(dá)量最高，在3個組織的最高表達(dá)量都與0 d表達(dá)量差異顯著（P＜0.05）。

2.2 SNP篩選和基因分型

如圖4所示，F(xiàn)SHR的136 bp（intro1）和66 146 bp（exon6）分別有1個突變位點，分別命名為g.856937G＞A 和 g.922947A＞G；ESR1的 190 744 bp有1個突變位點，命名為g.190744A＞G。g.856937G＞A位點的突變導(dǎo)致原始編碼氨基酸纈氨酸突變?yōu)榧琢虬彼幔⑶襣.922947A＞G位點是沉默突變。此外，g.190744A＞G位點的突變導(dǎo)致原始編碼氨基酸脯氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?。PCR-SSCP和測序結(jié)果顯示，以上3個SNP位點都有3種基因型，分別是AA、AG和GG型，如圖4和圖5。

2.3 FSHR和ESR1多態(tài)性

如表2所示，F(xiàn)SHR和ESR的多態(tài)性分析顯示3個 SNP位點都呈中度多態(tài)性（0.25＜PIC＜0.5），g.856937G＞A 和 g.190744A＞G 處 于 Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＞0.05），而 g.922947A＞G 處于 Hardy-Weinberg非平衡狀態(tài)（P＜0.05）。此外，3個SNP都具有較高遺傳多態(tài)性。

2.4 FSHR和ESR1與繁殖性狀關(guān)聯(lián)分析

如表3所示，關(guān)聯(lián)分析顯示，F(xiàn)SHR的2個SNP位點都與雷州黑鴨FEA，F(xiàn)EW和300E顯著相關(guān)（P＜0.05），且 g.922947A＞G 位點還與 FIW 顯著相關(guān)（P＜0.05）。ESR1的g.190744A＞G位點與雷州黑鴨FEW、FIW和300E顯著相關(guān)（P＜0.05），而與FEA相關(guān)性不顯著（P＞0.05）。然而，F(xiàn)SHR和ESR1的3個SNP位點與蛋品質(zhì)相關(guān)性不顯著（P＞0.05）。

3 討論

3.1 FSHR和ESR1表達(dá)規(guī)律

FSH和ES在卵巢早期發(fā)育中起關(guān)鍵作用，其作用強度受其相應(yīng)受體FSHR和ESR1調(diào)節(jié)。近年來，研究者對FSHR和ESR1進(jìn)行了廣泛的研究，結(jié)果顯示兩種基因幾乎都表達(dá)在下丘腦-垂體-性腺軸上，它們早期的表達(dá)量對動物的性成熟起決定性作用［5，11］。FSHR 在卵巢通過介導(dǎo) FSH 加強 cAMPPAK信號通路，并激活ERK等相關(guān)通路調(diào)節(jié)卵巢雌激素、孕酮等激素共同作用卵泡，當(dāng)FSHR表達(dá)量較低時，顆粒細(xì)胞與膜細(xì)胞之間的營養(yǎng)物質(zhì)以及信號交換減弱，顆粒細(xì)胞自主激活Caspase信號通路，導(dǎo)致卵泡閉鎖［12-14］。本研究表明FSHR在下丘腦-垂體-卵巢軸的表達(dá)量隨著雷州黑鴨日齡的增長呈穩(wěn)定上升趨勢，與王亞男［11］和 Akazome等［12］在雞的研究基本一致，說明FSHR對雷州黑鴨早期發(fā)育有重要作用，同時表明雷州黑鴨早期發(fā)育較穩(wěn)定。研究發(fā)現(xiàn)FSHR在優(yōu)勢卵泡表達(dá)量顯著高于從屬卵

泡［15］。隨著雷州黑鴨發(fā)育成熟，其優(yōu)勢卵泡數(shù)量迅速增加，而FSHR在卵巢的表達(dá)量并未出現(xiàn)顯著增長，且在下丘腦和垂體的表達(dá)出現(xiàn)略微下降，說明雷州黑鴨發(fā)育成熟后卵泡細(xì)胞自分泌和旁分泌調(diào)節(jié)機制較完善，從側(cè)面反映出雷州黑鴨在產(chǎn)蛋性能抗逆性較強，具有良好的開發(fā)應(yīng)用價值。

表1 試驗引物序列

圖2 雷州黑鴨FSHR表達(dá)規(guī)律

圖3 雷州黑鴨ESR1表達(dá)規(guī)律

圖4 雷州黑鴨FSHR和ESR1突變位點測序圖

ESR1在雷州黑鴨下丘腦-垂體-卵巢軸的表達(dá)量也隨著日齡的增長呈上升趨勢，但可能由于作用時間階段不同，其波動趨勢較大，這與Porto［16］在仔鵝中的研究基本一致。據(jù)報道，原始卵泡的啟動主要受顆粒細(xì)胞分泌細(xì)胞因子與卵母細(xì)胞上的c-kit受體結(jié)合發(fā)揮作用，不依賴雌激素的調(diào)節(jié)［17］。因此，ESR1在0-30 d的表達(dá)量較低。30 d后，ESR1的表達(dá)量迅速上升。研究發(fā)現(xiàn)，30 d后卵泡顆粒細(xì)胞層由單層變厚，標(biāo)志著次級卵泡發(fā)育。ESR1可通過介導(dǎo)ES直接激活ERK/MAPK信號通路，也可活化cAMP-PKA途徑使顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞表面周期蛋白表達(dá)量上調(diào)，顆粒細(xì)胞快速增殖從而促進(jìn)卵泡的快速發(fā)育和成熟［18-19］。因此，雷州黑鴨ESR1表達(dá)量在30 d后迅速增長且在120 d卵巢表達(dá)量達(dá)到最高，說明ESR1對次級卵泡的發(fā)育和性成熟具有重要作用。

通過比較FSHR和ESR1的表達(dá)規(guī)律發(fā)現(xiàn)，兩者表達(dá)趨勢基本一致，說明2個基因?qū)字莺邙喸缙谛韵侔l(fā)育具有類似作用。在90 d時，F(xiàn)SHR和ESR1在卵巢的表達(dá)量出現(xiàn)下調(diào)，推測雷州黑鴨在90 d時可能存在一個等級卵泡選擇過程，但其具體機制仍有待進(jìn)一步研究。

圖6 雷州黑鴨FSHR和ESR1的PCR-SSCP產(chǎn)物測序圖

表2 雷州黑鴨FSHR和ESR1基因型頻率及遺傳多態(tài)性

3.2 FSHR和ESR1與繁殖性狀關(guān)聯(lián)分析

FSHR和ESR1基因是家禽繁殖性狀的關(guān)鍵候選基因，其SNP可能對繁殖性狀產(chǎn)生影響。據(jù)報道，番鴨FSHR的編碼區(qū)中鑒定出4個SNP，并且C320T 和 A227G 位點與產(chǎn)蛋量顯著相關(guān)（P＜0.05）［4］。本研究發(fā)現(xiàn)雷州黑鴨FSHR存在2個SNP位點，g.856937G＞A與FEA、FEW、300E顯著相關(guān)（P＜0.05），g.922947A＞ G與 FEA、FEW、FIW、300E顯 著 相關(guān)（P＜0.05）。g.856937G＞A位點導(dǎo)致原始編碼氨基酸纈氨酸突變?yōu)榧琢虬彼幔琯.922947A＞G位點是沉默突變。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SHR突變可能通過作用其順式元件影響cFSHR轉(zhuǎn)錄，其編碼氨基酸突變可影響FSH與FSHR的特異性結(jié)合率調(diào)節(jié)特異性信號通路，從而影響卵泡發(fā)育［20-21］。因此，F(xiàn)SHR的SNP對雷州黑鴨繁殖性狀的具有重要作用，且g.856937G＞A和g.922947A＞G位點作為雷州黑鴨產(chǎn)蛋標(biāo)記基因具有巨大的經(jīng)濟(jì)價值。此外，F(xiàn)SHR在顆粒細(xì)胞通常與IGFR結(jié)合形成復(fù)合受體，其突變可能通過控制胰島素樣生長因子的分泌影響機體生長發(fā)育［22-23］，g.922947A＞G與雷州黑鴨FIW顯著相關(guān)表明該位點突變可能作用IGF信號通路，但其具體機制有待進(jìn)一步實驗研究。

表3 FSHR和ESR1的SNP位點與繁殖性狀關(guān)聯(lián)分析

Niu等［24］發(fā)現(xiàn)雞ESR1的外顯子4內(nèi)的T1101C與30、43、57和66周的產(chǎn)蛋量顯著相關(guān)，而與30周的蛋重相關(guān)性不顯著（P ＜0.05）。Terman 等［7］發(fā)現(xiàn)，ESR的多態(tài)性與生產(chǎn)母豬的數(shù)量之間存在極大差異（P＜0.01）。本研究發(fā)現(xiàn) ESR1的 g.190744A＞G 位點與雷州黑鴨FEA、FEW、300E顯著相關(guān)（P＜0.05），且該位點的突變導(dǎo)致脯氨酸突變?yōu)楫惲涟彼帷Ｒ陨媳砻骼字莺邙咵SR1的g.190744A＞G位點可用于產(chǎn)蛋性狀分子標(biāo)記位點。研究發(fā)現(xiàn)，ESR1和ESRβ結(jié)構(gòu)具有高度相似性，二者與雌激素配體結(jié)合后發(fā)揮不同作用，ESR1在卵巢顆粒細(xì)胞膜上可發(fā)揮G蛋白偶聯(lián)ESR1作用，G蛋白偶聯(lián)ESR1可快速介導(dǎo)GDF9和CYP21等非固醇類物質(zhì)，促進(jìn)卵泡發(fā)育成熟［25］。當(dāng)ESR1氨基酸突變，可能使其作用途徑發(fā)生改變，但其具體結(jié)構(gòu)有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究首次對雷州黑鴨早期下丘腦-垂體-卵巢軸的FSHR和ESR1的表達(dá)規(guī)律進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SHR在雷州黑鴨整個早期性腺發(fā)育具有重要作用，ESR1主要作用于雷州黑鴨次級卵泡發(fā)育和性成熟，90d時雷州黑鴨可能存在一個等級卵泡選擇的過程。關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，本研究鑒定的FSHR和ESR1的3個SNP位點都可作為雷州黑鴨產(chǎn)蛋標(biāo)記基因，g.922947A＞G可能通過FSHR和IGFR復(fù)合受體調(diào)節(jié)IGF信號通路調(diào)節(jié)機體生長發(fā)育。