馮高 張昱晨 茍敏 陳婭婷

（四川大學(xué)建筑與環(huán)境學(xué)院 環(huán)境生物技術(shù)研究中心，成都 610065）

厭氧消化技術(shù)因其高效的生物降解性和高能量回收率，現(xiàn)已成為治理有機(jī)固體廢棄物和廢水的核心生物技術(shù)。大分子有機(jī)物（纖維素、淀粉和蛋白質(zhì)等）在水解菌和發(fā)酵菌的作用下分解為小分子有機(jī)物（丁酸、丙酸和乙醇等）及H2和CO2，而后在互營有機(jī)酸氧化菌的作用下分解為乙酸、H2和CO2，最后嚴(yán)格厭氧的產(chǎn)甲烷古菌利用H2和乙酸，通過多種途徑產(chǎn)生甲烷［1-2］。揮發(fā)性脂肪酸（Volatile fatty acid，VFA）作為厭氧消化過程中重要的中間產(chǎn)物，其氧化降解是厭氧消化限速步驟。目前關(guān)于乙酸和丙酸互營氧化的研究較多，而丁酸作為其中一類VFA，在厭氧消化研究中也具有重要意義。有研究表明，在奶制品及肉制品加工廠廢水的厭氧處理過程中，丁酸約占31%［3］。此外，丙酸氧化菌Smithella通過歧化途徑將丙酸轉(zhuǎn)化為丁酸后再進(jìn)行氧化分解［4-5］，丁酸作為中間產(chǎn)物可影響丙酸降解過程。丁酸氧化過程中（C4H8O2+ 2H2O →2CH3COOH + 2H2）ΔG大于0，所以丁酸氧化菌需與產(chǎn)甲烷古菌形成互營，降低反應(yīng)產(chǎn)物H2的分壓，才能完成代謝［6］。

實(shí)際環(huán)境中，厭氧消化過程極易受各類抑制劑的影響［7-9］。當(dāng)抑制物濃度達(dá)到臨界水平時(shí)，會(huì)影響甲烷產(chǎn)生，造成甲烷產(chǎn)量下降［10-12］，其根本原因是對(duì)功能微生物類群的抑制，從而破壞有機(jī)物轉(zhuǎn)化為甲烷過程中多種營養(yǎng)微生物間的互作關(guān)系［13］。豬糞、牛糞和雞糞等動(dòng)物糞便中通常含有高濃度的獸藥抗生素作為飼料添加劑，用于提高產(chǎn)量或控制疾病［14］，高濃度抗生素可能導(dǎo)致厭氧消化過程的抑制或失敗。目前我國最常用的人畜用抗生素是氟喹諾酮類、磺胺類和四環(huán)素類抗生素［15］。其中，氯四環(huán)素（Chlortetracycline，CTC）在實(shí)際畜禽糞便中濃度高達(dá)100 mg/L［16］，可抑制部分革蘭氏陰性菌（如產(chǎn)甲烷古菌）的活性，從而抑制整個(gè)厭氧消化過程［17］。因此，研究抗生素對(duì)互營丁酸氧化群落的結(jié)構(gòu)和活性的影響，對(duì)于制定削減抑制和保持反應(yīng)器穩(wěn)定運(yùn)行的對(duì)策至關(guān)重要。然而目前對(duì)相關(guān)微生物群落的結(jié)構(gòu)及其對(duì)抑制物的響應(yīng)仍缺乏系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)。

互營氧化產(chǎn)甲烷過程中，有機(jī)酸氧化菌與產(chǎn)甲烷古菌間的電子傳遞方式有氫氣轉(zhuǎn)移、甲酸轉(zhuǎn)移和直接電子轉(zhuǎn)移［18］。種間直接電子傳遞（Direct interspecies electron transfer，DIET） 是 最 新 的 一種互營方式，其電子傳遞不需要?dú)錃饣蚣姿彷d體，節(jié)省了能量的同時(shí)，傳遞也不受擴(kuò)散速度的影響，因此具有極高的電子傳遞效率。目前報(bào)道的產(chǎn)甲烷體系中，能進(jìn)行DIET的微生物主要包括Geobacter sulfurreducens、Geobacter metallireducens、Methanosaeta harundinacea和Methanosarcina barkeri［19-20］，其直接電子傳遞過程主要是通過Geobacter細(xì)菌的導(dǎo)電性菌毛實(shí)現(xiàn)［21］。Zhao 等［22］通過在沼氣池中添加Fe3O4富集得到Syntrophomonas和Methanosaeta證實(shí)Syntrophomonas和Methanosaeta也可能存在DIET過程。近年來，研究發(fā)現(xiàn)導(dǎo)電顆粒物質(zhì)（如活性炭、生物炭和鐵氧化物等）也可作為電子傳遞體參與直接電子傳遞過程［23-26］。其中，顆粒活性炭比表面積大，具備良好的導(dǎo)電性和抗腐蝕性［27］，在研究導(dǎo)電物質(zhì)介導(dǎo)DIET過程中廣泛應(yīng)用［28-29］。

本研究構(gòu)建了以丁酸為唯一碳源的厭氧消化反應(yīng)器，在穩(wěn)定運(yùn)行條件下，通過16S rRNA的高通量測(cè)序研究互營丁酸氧化群落對(duì)抑制物的響應(yīng)。此外，在抑制物存在條件下，添加顆粒活性炭（Granular active carbon，GAC），研究互營有機(jī)酸氧化菌和產(chǎn)甲烷古菌間是否可通過GAC進(jìn)行直接電子傳遞，以及在CTC和GAC協(xié)同作用下，微生物群落結(jié)構(gòu)和關(guān)鍵微生物活性的動(dòng)態(tài)變化。

1 材料與方法

1.1 以丁酸為唯一碳源的反應(yīng)器構(gòu)建及運(yùn)行

本研究采用工作體積為1.8 L的全混流連續(xù)厭氧消化反應(yīng)器（Continuous stirred tank reactors，CSTR）。反應(yīng)器原始接種污泥為四川省某豬場(chǎng)常溫厭氧消化污泥。反應(yīng)器在37℃，0.05 d-1稀釋率條件下運(yùn)行，供給以丁酸為唯一碳源的合成廢水（TOC濃度為8 000 mg/L）。反應(yīng)器構(gòu)建及合成廢水成分同此前研究［30］。反應(yīng)器穩(wěn)定運(yùn)行500 d后，收集其微生物群落進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 批次抑制及添加活性炭實(shí)驗(yàn)

從反應(yīng)器中取出18 mL混合液，倒入充滿氮?dú)獾?0 mL培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)瓶頂空用純氮?dú)庵脫Q3 min后，用丁基橡膠塞和鋁密封。為消除混合液中殘余的有機(jī)酸，將培養(yǎng)瓶置于37℃的搖床中預(yù)培養(yǎng)1 h。預(yù)培養(yǎng)后，在培養(yǎng)瓶中加入不同濃度的CTC作為抑制劑，并加入終濃度為2 000 mg/L丁酸鈉作為碳源。CTC濃度范圍為20-60 mg/L。

根據(jù)對(duì)不同濃度CTC的耐受情況，分別選擇低濃度和高濃度的CTC，并根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果添加終濃度為3 mg/L的GAC，以考察抑制劑及GAC對(duì)互營丁酸降解微生物群落的影響。GAC來源于石家莊宏森活性炭有限公司，電子交換能力（Electron exchange capacity，EEC） 為 0.78 mmol e-/g， 過40-60目篩后備用。實(shí)驗(yàn)設(shè)置如表1所示。培養(yǎng)瓶中分別添加40 mg/L和50 mg/L的CTC且無GAC的處理命名為C1和C2，培養(yǎng)瓶中分別添加上述兩種濃度的CTC且添加GAC的處理命名為GC1和GC2。數(shù)字“1”表示“低抑制”，數(shù)字“2”表示“高抑制”。此外，培養(yǎng)瓶中加入丁酸鹽作為微生物生長的碳源，初始濃度均為2000 mg/L。所有實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)平行樣品。將培養(yǎng)瓶置于37℃搖床中培養(yǎng)，培養(yǎng)18 h后，檢測(cè)產(chǎn)氣量及培養(yǎng)液中VFAs的濃度，每個(gè)處理選取2個(gè)平行樣品進(jìn)行微生物群落分析。

表1 批次抑制及添加活性炭實(shí)驗(yàn)設(shè)置

1.3 RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和高通量測(cè)序

培養(yǎng)18 h后，收集全部污泥培養(yǎng)液提取微生 物 群 落 總 RNA［31］。 采 用 PrimeScript RT reagent Kit試劑盒及隨機(jī)引物對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和 806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'） 擴(kuò) 增 細(xì) 菌16S rRNA基因V3-V4高變區(qū)。采用古菌通用引物524F10extF（5'-TGYCAGCCGCCGCGGTAA-3'） 和Arch958RmodR（5'-YCCGGCGTTGAVTCCAATT-3'）擴(kuò)增古菌16S rRNA基因V4-V6高變區(qū)。雙向引物加入樣品特異的12 bp 條形碼序列（barcode）。PCR反應(yīng)體系如下：總體積 25 μL，包括0.4 μL Fast Pfu聚合酶，4 μL 5×Fast Pfu聚合酶緩沖液，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，正反向引物各1.6 μL和10 ng cDNA模板。PCR 反應(yīng)條件如下：95℃ 3 min，95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s（27個(gè)循環(huán)），72℃最終延伸10 min。所有樣品 PCR 產(chǎn)物等摩爾混合并用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit試劑盒及QuantiFluorTM-ST進(jìn)行純化和定量，合格后用于 Illumina HiSeq2000系統(tǒng)完成測(cè)序。

1.4 生物信息學(xué)及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用最小顯著差數(shù)（The least significant difference，LSD）對(duì)各處理組進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，差異顯著水平設(shè)為P＜ 0.05。通過 Illumina 測(cè)序獲得原始配對(duì)數(shù)據(jù)后，首先利用Trimmomatic軟件（版本 0.36）［32］去除質(zhì)量評(píng)分低于30的序列并利用FLASH 軟件（版本 1.2.11）進(jìn)行序列拼接［33］，以獲得16S rRNA基因中整個(gè)V4-V6高變區(qū)的序列。對(duì)序列進(jìn)行降噪、降低測(cè)序錯(cuò)誤和去除嵌合體處理后，根據(jù)上述特有的12 bp的barcode，將上述高質(zhì)量序列分配到各個(gè)樣品中，再按照97%的相似性劃 分 OTU（Operational taxonomic unit，OTU）。 最后，將OTU代表序列與Silva（SSU123）16S rRNA基因數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對(duì)，按照0.7的置信度對(duì)OTU進(jìn)行物種分類。利用Spearman等級(jí)相關(guān)系數(shù)分析環(huán)境因素對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的影響。利用R軟件（https：//www.r-project.org/）計(jì)算Spearman等級(jí)相關(guān)系數(shù)及相應(yīng)P值（P＜0.05則為統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著性相關(guān)）。利用HemI（Heatmap Illustrator，版本1.0，http：//hemi.biocuckoo.org/）創(chuàng)建熱圖。利用開源平臺(tái)Cytoscape_v.3.6.1生成共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)，用以可視化微生物類群間相互作用。選擇相對(duì)豐度排名前30的微生物屬來構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)。兩個(gè)節(jié)點(diǎn)之間的連接表示強(qiáng)（| r |＞ 0.5）和顯著（P＜0.05）Spearman相關(guān)性。每個(gè)節(jié)點(diǎn)的大小與顯著的正/負(fù)相關(guān)（即度）的數(shù)量成比例；兩個(gè)節(jié)點(diǎn)之間的每個(gè)連接的厚度與Spearman的相關(guān)系數(shù)（r）成比例，范圍從| 0.5 |到| 1 |。

1.5 反應(yīng)器理化參數(shù)測(cè)試

反應(yīng)器中懸浮固體（Suspended solids，SS）、揮發(fā)性懸浮固體（Volatile suspended solids，VSS）、總有機(jī)碳（Total organic carbon，TOC）和VFAs等參數(shù)的測(cè)試方法同此前研究［34］。

1.6 核苷酸序列登記號(hào)

原始測(cè)序數(shù)據(jù)已上傳至NCBI（Accession number：PRJNA544829）。

2 結(jié)果

2.1 反應(yīng)器運(yùn)行情況

實(shí)驗(yàn)期間，以丁酸為唯一碳源的反應(yīng)器已在0.05 d-1稀釋率下穩(wěn)定運(yùn)行500余天（圖1）。反應(yīng)器pH保持在7.5，產(chǎn)氣量穩(wěn)定在400 mL/d（圖1）。丁酸及乙酸濃度均低于100 mg/L，表明反應(yīng)器中的丁酸被微生物群落完全礦化。VSS平均濃度為1.86 g/L。在運(yùn)行550 d和610 d間采集反應(yīng)器中混合液樣品進(jìn)行微生物群落分析和批量抑制及添加GAC實(shí)驗(yàn)。

2.2 原始反應(yīng)器中的微生物群落

圖1 以丁酸為唯一碳源的反應(yīng)器運(yùn)行情況（37℃，0.05 d-1）

為研究反應(yīng)器中的活性微生物群落，從反應(yīng)器污泥中提取兩個(gè)平行RNA樣品并進(jìn)行16S rRNA高通量測(cè)序。基于16S rRNA序列中97%的相似性，共獲得247個(gè)OTU。在門水平，細(xì)菌主要類群（相對(duì)豐度 ＞ 3%）為Firmicutes（16.0%），Proteobacteria（13.2%），Bacteroidetes（9.6%） 和Synergistetes（3.3%）（圖2）。在屬水平，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬（相對(duì)豐度 ＞ 2%）分別是Syntrophomonas（11.6%），unclassifiedSphingobacteriales（8.9%），unclassifiedHydrogenophilaceae（7.0%），Tepidanaerobacter（2.74%）和 unclassifiedSynergistaceae（2.08%）（ 圖 2）。 古菌群落中，主要古菌屬為Methanosaeta（48.5%），Methanoculleus（3.4%） 和Methanobacterium（2.7%）（圖 2）。

圖2 不同處理下微生物優(yōu)勢(shì)屬的相對(duì)豐度

2.3 抗生素及添加活性炭對(duì)產(chǎn)甲烷的影響

為研究不同濃度CTC對(duì)產(chǎn)甲烷的影響，選擇20-60 mg/L濃度的CTC進(jìn)行產(chǎn)甲烷抑制測(cè)試。結(jié)果顯示，20 mg/L濃度的CTC對(duì)產(chǎn)甲烷無明顯抑制，30-50 mg/L條件下產(chǎn)氣量分別降低17.3%，36.5%和80.8%，60 mg/L時(shí)幾乎無產(chǎn)氣。根據(jù)對(duì)CTC的耐受情況，最終選擇低濃度（40 mg/L）和高濃度（50 mg/L）的CTC進(jìn)行抑制實(shí)驗(yàn)，并添加GAC研究其對(duì)產(chǎn)甲烷過程的影響。

批次抑制及添加GAC實(shí)驗(yàn)中，丁酸初始濃度為2000 mg/L。培養(yǎng)18 h后，產(chǎn)氣量、丁酸和乙酸濃度結(jié)果如圖3所示。培養(yǎng)18 h后，在低（C1，40 mg/L）和高（C2，50 mg/L）濃度CTC條件下，產(chǎn)氣量分別降低40.4%和49.3%（圖3-a），丁酸降解速率分別降低44.2%和51.3%（圖3-b），乙酸濃度分別降低31.2%和45.4%（圖3-c），表明CTC對(duì)丁酸降解有明顯抑制作用。

在添加GAC的處理中（圖3），無CTC條件下，加入GAC導(dǎo)致產(chǎn)氣量降低2.9%，丁酸降解速率無明顯變化，乙酸濃度增加7.0%。當(dāng)GAC和CTC同時(shí)存在時(shí)（GC1和GC2），產(chǎn)氣量分別降低48.5%和64.7%（圖3-a），丁酸降解率降低48.8%和72.6%（圖3-b），乙酸濃度降低34.7%和58.3%（圖3-c）。

圖3 不同處理下產(chǎn)氣量（a）、丁酸濃度（b）和乙酸濃度（c）

2.4 抗生素及添加活性炭對(duì)丁酸氧化群落活性的影響

為研究CTC及添加GAC對(duì)微生物類群活性的影響，通過計(jì)算Spearman相關(guān)系數(shù)以表明微生物群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子之間的相關(guān)性（圖4）。在CTC抑制條件下，有7種OTU（Syntrophomonas、Citrobacter、Methylobacter、Mesotoga、Mycobacterium、Desulfomonile和Syntrophobacter）的相對(duì)活性與CTC濃度呈正相關(guān)，表現(xiàn)出對(duì)CTC 的耐受性；其中Mycobacterium和Syntrophobacter呈顯著正相關(guān)（P＜ 0.05），表明相對(duì)其他細(xì)菌，該微生物對(duì)CTC有較強(qiáng)的耐受性和適應(yīng)能力。相反地，有8種OTU（Tepidanaerobacter、unclassifiedSpirochaetaceae、unclassifiedSynergistaceae、unclassifiedSyntrophaceae、unclassifiedSphingobacteriales、unclassifiedHydrogenophilaceae、Azonexus和Geobacter） 與CTC濃度呈負(fù)相關(guān)，表明其可能不耐受CTC；其 中 unclassifiedSphingobacteriales、unclassifiedHydrogenophilaceae和Geobacter受到顯著抑制（P＜ 0.05）（圖4-a）。此外，不同濃度抑制劑影響不同微生物類群（圖4-b）。低濃度CTC處理時(shí)，僅有 3種 OTU的 活 性（Methanoculleus、unclassifiedHydrogenophilaceae和 unclassifiedSpirochaetaceae）受到較明顯的抑制，大部分OTU表現(xiàn)出耐受性，其中Methylobacter和unclassifiedMethylophilaceae的相對(duì)活性與CTC濃度呈顯著正相關(guān)；高濃度CTC抑制了大部分細(xì)菌的活性并顯著抑制了unclassifiedSphingobacteriales、Soehngenia和 unclassifiedMethylophilaceae的活性，只有3種OTU（Citrobacter、Syntrophobacter和Mycobacterium）表現(xiàn)出耐受性，其中Mycobacterium的相對(duì)活性與CTC濃度呈顯著正相關(guān)（P＜ 0.05）（圖 4-b）。

添加GAC條件下，有6種OTU（unclassifiedFirmicutes、unclassifiedSynergistaceae、unclassifiedSphingobacteriales、unclassifiedHydrogenophilaceae、Azonexus和Geobacter）相對(duì)活性與GAC呈明顯正相 關(guān)； 有 5種 OTU（Citrobacter、Methylobacter、Mesotoga、Mycobacterium和Syntrophobacter） 相對(duì)活性與GAC呈負(fù)相關(guān)，其中Citrobacter的活性呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜ 0.05）（圖 4-a）。低濃度 CTC添加GAC處理?xiàng)l件下有五種OTU（Geobacter、Syntrophomonas、Methylomonas、unclassifiedAnaerolineaceae和 unclassifiedComamonadaceae） 的相對(duì)活性與GAC呈明顯正相關(guān)，其中Geobacter在低濃度CTC處理時(shí)被抑制，添加GAC后表現(xiàn)出耐受性；而Mycobacterium對(duì)單獨(dú)存在的CTC表現(xiàn)出耐受性，添加GAC其相對(duì)活性明顯降低；高濃度CTC添加GAC處理時(shí)，大部分OTU的相對(duì)活性呈負(fù)相關(guān)，只有3個(gè)OTU（Methanosaeta、unclassifiedComamonadaceae和Citrobacter）呈正相關(guān)趨勢(shì)。相比于高濃度CTC處理，添加GAC后Methanosaeta和unclassifiedComamonadaceae的活性明顯增強(qiáng)（圖4-b）；而Mycobacterium的活性明顯降低，與低濃度CTC條件下對(duì)GAC的響應(yīng)相同。

2.5 基于群落和抗生素及添加活性炭的網(wǎng)絡(luò)分析

共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析用于研究群落中優(yōu)勢(shì)屬之間的直接或間接相互作用（圖5）。為了從整體水平探討綜合條件對(duì)微生物群落的影響，選取所有處理組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。在所有處理?xiàng)l件下相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖中（圖 5-a），與Methanosaeta、Methanoculleus相聯(lián)系的OTU均呈負(fù)相關(guān)性，如Thermoclostridium、unclassifiedFirmicutes、Azonexus等。Syntrophomonas和Mesotoga呈正相關(guān)聯(lián)系，因?yàn)镸esotoga可以利用Syntrophomonas的代謝產(chǎn)物乙酸。與Geobacter相關(guān)的OTU較少，其中僅有Azonexus、unclassifiedSphingobacteriales和unclassifiedSynergistaceae與其呈正相關(guān)，且這3種OTU的生物活性都與GAC呈正相關(guān)。

在僅有CTC處理的相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖中，群落中的“中樞”是unclassifiedFirmicutes、unclassifiedComamonadaceae、Tepidanaerobacter和Methanoculleus（圖5-b）。其中，unclassifiedFirmicutes和unclassifiedComamonadaceae兩個(gè)簇內(nèi)大部分OTU（如Mesotoga、Syntrophomonas和Azonexus等）間呈正相關(guān)聯(lián)系，僅有Methanosaeta與這兩個(gè)“中樞”呈負(fù)相關(guān)聯(lián)系。此外，unclassifiedFirmicutes、unclassifiedComamonadaceae和Methanobacterium與Mesotoga呈正相關(guān)性。Tepidanaerobacter為“中樞”的簇中，unclassifiedHydrogenophilaceae和 unclassifiedSphingobacteriales與“中樞”有很強(qiáng)的相關(guān)性?！爸袠小睘镸ethanoculleus的簇中大部分OTU聚集為負(fù)相關(guān)趨 勢(shì)， 如Soehngenia、unclassifiedMethylophilaceae和Brachymonas。

圖4 不同添加物（a）和不同處理下（b）環(huán)境因子和主要菌屬間Spearman相關(guān)性熱圖

3 討論

原始反應(yīng)器細(xì)菌類群中，F(xiàn)irmicutes，Proteobacteria，和Bacteroidetes常見于厭氧消化系統(tǒng)［35-36］。屬于Clostridia的Syntrophomonas（OTU133）是已知的丁酸氧化菌，該菌株可通過β-氧化途徑將丁酸降解為乙酸和H2［37］。屬于Sphingobacteriia的 unclassifiedSphingobacteriales（OTU233） 與Sphingobacteriales（HQ692029） 具 有 97% 的 序 列相似性，該菌在甜菜硅藻的中溫厭氧消化反應(yīng)器中被檢測(cè)出，可降解包括蛋白質(zhì)和碳水化合物在內(nèi)的復(fù)雜大分子有機(jī)物［38］。屬于Betaproteobacteria的 unclassifiedHydrogenophilaceae（OTU234） 與Planifilum（NR_040940）具有88.5%的序列相似性，Planifilum是堆肥產(chǎn)生的生物氣溶膠中的優(yōu)勢(shì)嗜熱細(xì) 菌［39］。 屬 于Firmicutes的Tepidanaerobacter（OTU210） 與TepidanaerobacteracetatoxydansRe1（EU386163）具有99%的序列相似性，該菌分離自含有高濃度銨的中溫污泥反應(yīng)器，為一類互營乙酸氧化細(xì)菌［40］。屬于Thermotogae的Mesotoga（OTU59）是已知的乙酸氧化細(xì)菌，在對(duì)苯二甲酸甲酯（Terephthalate，TA）產(chǎn)甲烷反應(yīng)器中被發(fā)現(xiàn)，可降解TA分解代謝副產(chǎn)物乙酸［41］。屬于Synergistia的 unclassifiedSynergistaceae（OTU217）與SaccharofermentansM3/6T（NR_115340）具有94.7%的序列相似性，該菌株是從沼氣反應(yīng)器中分離出的新菌種，可利用蛋白底物和糖類產(chǎn)乙酸、丙酸和異戊酸，有助于厭氧消化的水解產(chǎn)酸過程［42］。這些OTU與已知微生物序列的低相似性表明厭氧消化體系中也存在較多未知微生物物種。古菌群落中，優(yōu)勢(shì)古菌屬M(fèi)ethanosaeta是已知的乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌，能利用乙酸產(chǎn)生CH4和CO2［43］。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)Methanosaeta可通過直接種間電子轉(zhuǎn)移（DIET）接受電子以消耗乙酸，表明厭氧消化中有機(jī)物轉(zhuǎn)化為CH4不僅僅是通過電子載體（如H2和甲酸）的擴(kuò)散進(jìn)行的［44］。目前已知Geobacter可通過導(dǎo)電菌毛參與DIET向產(chǎn)甲烷菌提供電子［45］。Zhao等［46］發(fā)現(xiàn)互營丁酸氧化菌Syntrophomonas也可能通過DIET與Methanosaeta互營生長［22］。另外兩個(gè)古菌屬M(fèi)ethanoculleus和Methanobacterium為氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌，常見于反應(yīng)器、填埋場(chǎng)、廢水和熱泉中。相較于高溫，中溫條件下氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌的生物活性相對(duì)偏弱［47］，因此本研究反應(yīng)器中Methanoculleus和Methanobacterium的相對(duì)豐度較低。

圖5 基于Spearman相關(guān)性分析的共現(xiàn)微生物屬網(wǎng)絡(luò)

CTC對(duì)丁酸降解有明顯抑制作用，在厭氧消化過程中，由于底物、接種物、環(huán)境條件（溫度、pH）和馴化期的不同，抑制劑的抑制濃度范圍較大，CTC的抑制濃度通常在2-100 mg/L范圍內(nèi)波動(dòng)［10-12，48］。與抑制物單獨(dú)作用相比，添加GAC增強(qiáng)了抑制性，這可能是GAC吸附使抑制物和有機(jī)酸積累導(dǎo)致的結(jié)果。有研究表明GAC的導(dǎo)電性能加強(qiáng)微生物群落種間直接電子傳遞，有效促進(jìn)互營產(chǎn)甲烷過程［49］，與本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果有所差異，可能是由與反應(yīng)器和實(shí)際物料體系不同造成的。

環(huán)境因子和主要菌屬間Spearman相關(guān)性熱圖表明，相對(duì)其他細(xì)菌，丁酸氧化菌Syntrophomonas對(duì)CTC有一定的耐受性，其氧化丁酸產(chǎn)乙酸過程可能不會(huì)受到明顯抑制。作為丁酸氧化的產(chǎn)物，乙酸不僅可被Methanosaeta利用產(chǎn)甲烷，還可被乙酸氧化菌Tepidanaerobacter和Mesotoga氧化為CO2和H2，產(chǎn)生的CO2和H2將參與氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷過程［40］。本研究中Tepidanaerobacter的相對(duì)活性受到CTC的抑制，可能導(dǎo)致乙酸積累，從而抑制整個(gè)丁酸氧化過程。有研究表明，揮發(fā)性有機(jī)酸積累對(duì)厭氧消化過程中微生物有著致命的毒害作用［50］。Geobacter已被證實(shí)可以直接向產(chǎn)甲烷古菌傳遞電子并促進(jìn)甲烷的生產(chǎn)［45］，本研究中，CTC顯著抑制了Geobacter的相對(duì)活性，可能阻斷其與古菌的電子傳遞過程。此外，群落中一些未知細(xì)菌（ 如unclassifiedSphingobacteriales和unclassifiedHydrogenophilaceae）受到CTC的明顯抑制，這些細(xì)菌可能為參與丁酸氧化的微生物提供必需的營養(yǎng)物質(zhì)，從而影響關(guān)鍵菌的生長，因此有必要進(jìn)一步研究這些未知細(xì)菌。Geobacter是目前唯一已知通過DIET傳遞電子的細(xì)菌，該細(xì)菌活性與GAC呈明顯正相關(guān)，表明添加GAC可能促進(jìn)其參與直接電子傳遞過程，與此前研究結(jié)果一致［51］。在本研究中，添加GAC，最終甲烷產(chǎn)量降低2.9%-30.4%，可能是其他未知細(xì)菌（如unclassifiedFirmicutes和unclassifiedSphingobacteriales）與產(chǎn)甲烷古菌形成互營，導(dǎo)致Geobacter無法與古菌形成種間直接電子傳遞。此外，添加GAC處理中，Methanosaeta、Syntrophomonas和Mesotoga的相對(duì)活性降低，Mesotoga可將乙酸氧化為CO2和H2以供給氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌［52］，H2和CO2來源減少也可能導(dǎo)致甲烷產(chǎn)量的降低。低濃度CTC和GAC的共同處理增強(qiáng)了Syntrophomonas的相對(duì)活性，而乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌Methanosaeta的相對(duì)活性降低，可能由于丁酸氧化產(chǎn)生的乙酸未被及時(shí)消耗，導(dǎo)致乙酸積累并影響甲烷產(chǎn)生。高濃度CTC和GAC處理時(shí)，包括Geobacter在內(nèi)的大部分微生物活性被抑制，直接電子傳遞過程的阻斷導(dǎo)致GAC的添加無明顯作用效果。

共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析提供了生態(tài)信息的可視化，可以闡明生物間相互作用，共享生理學(xué)或棲息地親緣關(guān)系［53］。密集連接的節(jié)點(diǎn)由較大的圓圈表示，表明該菌屬與其他類群具有更顯著的正相關(guān)或負(fù)相關(guān)，因此可能是群落中的重要微生物。最密集連接的節(jié)點(diǎn)被定義為“中樞”，是群落中其他成員的潛在代謝指標(biāo)［54］。所有處理網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果表明，Geobacter可 能 與Azonexus、unclassifiedSphingobacteriales和unclassifiedSynergistaceae協(xié)同生長，GAC促進(jìn)了Geobacter生長代謝，同時(shí)增強(qiáng)了它們的相對(duì)活性。屬于Betaproteobacteria的主要屬Azonexus與Azonexuscaeni菌株Slu-05（NR_041017）具有99%的序列相似性，該菌是從廢水處理廠的污泥中分離出的反硝化細(xì)菌［55］。Azonexus能夠在微氧條件下生長，但通常在產(chǎn)甲烷體系中檢測(cè)到［56-57］。屬于Synergistia的unclassifiedSynergistaceae可能通過氧化乙酸產(chǎn)生電子，并被產(chǎn)甲烷菌用于產(chǎn)生甲烷［45］。

在僅有CTC處理的相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖中，Methanosaeta與兩個(gè)“中樞”（unclassifiedFirmicutes和unclassifiedComamonadaceae）呈負(fù)相關(guān)聯(lián)系，表明它們與乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌存在一定的競(jìng)爭關(guān)系。此外，unclassifiedFirmicutes和unclassifiedComamonadaceae可能是Mesotoga生長代謝的伴生菌，增強(qiáng)了Mesotoga與Methanosaeta競(jìng)爭乙酸時(shí)的優(yōu)勢(shì)。乙酸氧化細(xì)菌Mesotoga和丁酸氧化細(xì)菌Syntrophomonas與這兩個(gè)“中樞”都呈正相關(guān)趨勢(shì)，表明它們與有機(jī)酸氧化細(xì)菌具有密切的關(guān)系。Mesotoga和Methanobacterium呈正相關(guān)聯(lián)系，Mesotoga氧化乙酸產(chǎn)生的CO2可被氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌Methanobacterium利用，與此前研究結(jié)果相同［52］。Tepidanaerobacter為“中樞”的簇中，一些易受CTC影響的OTU（如unclassifiedHydrogenophilaceae和 unclassifiedSphingobacteriales）與“中樞”都有很強(qiáng)的相關(guān)性，它們被抑制的同時(shí)會(huì)影響Tepidanaerobacter的生物活性。

綜上所述，丁酸氧化菌（Syntrophomonas）和乙酸氧化菌（Mesotoga和Tepidanaerobacter）與群落中大部分細(xì)菌（如unclassifiedComamonadaceae、unclassifiedFirmicutes、unclassifiedSphingobacteriales等）呈正相關(guān)，它們的活性易受到CTC的抑制，從而影響乙酸和H2的產(chǎn)出，導(dǎo)致甲烷產(chǎn)量降低。產(chǎn)甲烷古菌（Methanosaeta和Methanoculleus）與其相 聯(lián) 系 的 細(xì) 菌（Azonexus、Thermoclostridium和unclassifiedChloroflexi等）均呈負(fù)相關(guān)性，而添加GAC增強(qiáng)了Geobacter以及與其呈正相關(guān)的細(xì)菌（Azonexus、unclassifiedSynergistaceae和 unclassifiedSphingobacteriales等）的活性，間接影響了產(chǎn)甲烷古菌生長代謝，致使產(chǎn)甲烷量降低。雖然添加GAC可以增強(qiáng)Geobacter等菌的活性，但是CTC對(duì)它們的抑制作用占主導(dǎo)地位。

4 結(jié)論

本研究利用以丁酸為唯一碳源的厭氧反應(yīng)器，揭示了互營丁酸氧化群落結(jié)構(gòu)和相互作用，研究互營丁酸氧化群落對(duì)CTC的響應(yīng)，以及在CTC和GAC協(xié)同作用下，微生物群落結(jié)構(gòu)和關(guān)鍵微生物活性的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果表明，反應(yīng)器群落中優(yōu)勢(shì)菌屬互營丁酸氧化菌Syntrophomonas和乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌Methanosaeta存在互營生長關(guān)系。CTC明顯抑制產(chǎn)甲烷量，盡管Syntrophomonas相對(duì)耐受CTC，但與其呈正相關(guān)的微生物（如unclassifiedFirmicutes和unclassifiedComamonadaceae）活性受CTC抑制。乙酸氧化菌Tepidanaerobacter受CTC抑制，可能導(dǎo)致代謝產(chǎn)物乙酸的積累從而降低丁酸氧化率。此外，添加GAC增強(qiáng)了Geobacter和Azonexus等細(xì)菌的活性，而產(chǎn)甲烷古菌（Methanosaeta和Methanoculleus）與其相聯(lián)系的細(xì)菌（Azonexus、Thermoclostridium和unclassifiedChloroflexi等）均呈負(fù)相關(guān)性，間接影響了產(chǎn)甲烷古菌生長代謝，從而導(dǎo)致產(chǎn)甲烷量降低。與處理實(shí)際物料的厭氧消化反應(yīng)器相比，以丁酸為唯一碳源的厭氧反應(yīng)器中，微生物群落結(jié)構(gòu)較簡單，長期供給含丁酸的合成廢水可馴化出穩(wěn)定的微生物群落且各微生物類群間相互作用較緊密。因此，添加GAC雖可能促進(jìn)Geobacter潛在的直接電子傳遞能力，但對(duì)關(guān)鍵有機(jī)酸氧化菌及產(chǎn)甲烷古菌并無明顯促進(jìn)作用。后續(xù)可就實(shí)際物料厭氧消化體系中，微生物群落對(duì)抑制物的響應(yīng)及導(dǎo)電介質(zhì)介導(dǎo)直接電子傳遞過程進(jìn)行深入研究。