高 競(jìng)，馮歌林，嚴(yán)淑嫻 ，秦 華，陳俊輝，梁辰飛，徐秋芳

（1.省部共建亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江農(nóng)林大學(xué)，浙江杭州311300；2.浙江農(nóng)林大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，浙江杭州311300）

植物內(nèi)生菌（Endophyte）普遍存在于木本、草本植物，單子葉植物和雙子葉植物中，一定階段或全部階段生活于健康植物的組織和器官內(nèi)部［1］。目前在植物中發(fā)現(xiàn)的內(nèi)生細(xì)菌已有54個(gè)屬、129種，其中常見(jiàn)的屬包括假單胞菌屬（Pseudomonas）、芽孢桿菌屬（BacillusCohn）、腸桿菌屬（Enterobacter）以及固氮螺菌屬（Azosprillum）［2］。植物內(nèi)生細(xì)菌對(duì)宿主植物的作用主要表現(xiàn)為以下幾個(gè)方面，促進(jìn)生長(zhǎng)、增加宿主植物抗蟲(chóng)害潛力、增加宿主植物對(duì)環(huán)境脅迫的抗性、增加他感作用、抗病原菌作用等有益效應(yīng)［3］。同時(shí)，植物內(nèi)生細(xì)菌還是重要的生物資源，柳鳳等［4］從紅樹(shù)中篩選出可分泌較穩(wěn)定的非蛋白類(lèi)抗菌活性物質(zhì)的細(xì)菌菌株，能對(duì)芒果炭疽病菌產(chǎn)生抑制作用。

影響植物內(nèi)生菌主要有植物本身和環(huán)境兩方面。如植株種類(lèi)、植株生活史、種植地區(qū)、植株不同組織對(duì)內(nèi)生細(xì)菌多樣性的影響。橡膠樹(shù)不同組織內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量和種類(lèi)由多到少依次為，樹(shù)根、花序、樹(shù)皮、葉柄、葉片和果實(shí)［5］。孫占斌等［6］研究黃瓜初花和結(jié)瓜2個(gè)生長(zhǎng)期葉片發(fā)現(xiàn)，可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌初花期內(nèi)生菌的豐度是結(jié)瓜期的5倍，并且2個(gè)時(shí)期內(nèi)生菌的種類(lèi)表現(xiàn)出很強(qiáng)的差異。孫巖［7］通過(guò)對(duì)3種受不同程度潰瘍病影響的楊屬植物的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行研究，健康植株樣品中的細(xì)菌生物量普遍少于非健康樣品，而細(xì)菌物種多樣性與植物的抗性成正比。然而，植物內(nèi)生菌也存在共性，車(chē)健美等［8］通過(guò)對(duì)不同禾本科牧草植株內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行可培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生細(xì)菌具有較豐富的遺傳多樣性以及功能多樣性，不同品種之間存在共有菌群。植物內(nèi)生菌對(duì)環(huán)境和季節(jié)的反應(yīng)存在差異，同一品種煙草種植在不同地區(qū)，其內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量不盡相同［9］，說(shuō)明環(huán)境對(duì)植物內(nèi)生菌有重要影響；蕙蘭根部?jī)?nèi)生細(xì)菌數(shù)量隨季節(jié)而變化，秋季分離出的內(nèi)生細(xì)菌種類(lèi)最多、夏季最少，兩者差異極顯著［10］。

竹子（Bambusoideae）屬于禾本科植物，物種多樣性豐富，全球有70屬1 200多種，是集經(jīng)濟(jì)、生態(tài)和社會(huì)效益于一體的森林資源，在現(xiàn)代林業(yè)和區(qū)域經(jīng)濟(jì)中具有重要地位［11］。揭示竹子內(nèi)生細(xì)菌的結(jié)構(gòu)特征和物種多樣性，對(duì)竹子的生產(chǎn)培育具有一定的實(shí)用意義。研究者對(duì)竹子內(nèi)生細(xì)菌的研究發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)的毛竹（Phyllostachys edulis）竹鞭內(nèi)生細(xì)菌組成存在較大差異［12］；而對(duì)毛竹根際細(xì)菌、根面細(xì)菌和根部?jī)?nèi)生細(xì)菌的研究發(fā)現(xiàn)，毛竹根際可培養(yǎng)細(xì)菌種群數(shù)量最高，其次為根面細(xì)菌和根部?jī)?nèi)生細(xì)菌，并且有較多共有菌種［13］；固氮細(xì)菌可以通過(guò)植物自然開(kāi)口與傷口進(jìn)入植物體內(nèi)［14］。侯偉［15］從廣東省刺竹（Bamboosa blumeana）中分離到40株高效固氮酶活性菌株，它們分別屬固氮螺菌屬（Azosprillum）、埃希氏桿菌屬（Escherichchias）、假單胞菌屬（Pseudomonas）和水螺菌屬（Aquaspirillum）；而這些菌種都能在土壤中找到相似菌株。以上研究初步揭示了竹子內(nèi)生細(xì)菌多樣性特征及其與環(huán)境的關(guān)系，但竹子種類(lèi)多、分布廣，僅僅以一種竹子為對(duì)象進(jìn)行研究，不能很好地認(rèn)識(shí)竹子內(nèi)生細(xì)菌的真實(shí)情況。

研究以生長(zhǎng)于同一區(qū)域的散生毛竹（Phyllostachysedulis）、叢生孝順竹（Bambusa multiplex）和混生窄葉苦竹（Pleioblastus amarus）等3種代表性竹子為研究對(duì)象，應(yīng)用分子生物技術(shù)，分析不同竹子、不同組織內(nèi)生細(xì)菌以及其定植的根際土壤細(xì)菌，揭示3種竹子內(nèi)生細(xì)菌的特征和多樣性及其與環(huán)境微生物的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

分別在浙江農(nóng)林大學(xué)竹種園的孝順竹、窄葉苦竹及毛竹林地采樣，每種竹子樣品選取3株不同植株（相當(dāng)于3個(gè)重復(fù)），各植株之間適當(dāng)間隔；選取生長(zhǎng)力旺盛的健康植株采取根與葉，采集每個(gè)竹子對(duì)應(yīng)的根區(qū)土壤（深度0～30 cm），帶回實(shí)驗(yàn)室冰箱中保存。一部分土壤樣品經(jīng)風(fēng)干、磨細(xì)、過(guò)篩后，用于土壤化學(xué)性質(zhì)的測(cè)定；另一部分樣品處理后保存于-80℃冰箱內(nèi)，用于DNA提取。

1.2 分析方法

1.2.1 土壤理化性質(zhì)測(cè)定 參照《土壤農(nóng)化分析方法》［16］，分析土壤pH、有機(jī)質(zhì)、堿解氮、有效磷、速效鉀等5個(gè)常規(guī)指標(biāo)，土壤pH利用pH計(jì)法測(cè)定，土壤有機(jī)質(zhì)采用重鉻酸鉀外加熱法測(cè)含量，土壤有效氮采用堿擴(kuò)散法，土壤速效磷含量采用鉬銻抗比色法測(cè)定，土壤速效鉀含量采用火焰光度計(jì)法測(cè)定。

1.2.2 土壤細(xì)菌DNA提取 采用美國(guó)Mobio公司的土壤微生物DNA試劑盒（PowerSoil Kit）提取土壤細(xì)菌DNA。嚴(yán)格根據(jù)說(shuō)明書(shū)上步驟進(jìn)行操作，提取的每份DNA分裝3管保存。取4μL DNA采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA是否提取成功。

1.2.3 植物組織細(xì)菌DNA提取 植物樣品滅菌預(yù)處理。在超凈臺(tái)內(nèi)對(duì)植物葉、根進(jìn)行表面滅菌預(yù)處理過(guò)程如下：用超純水洗凈葉、根表面的雜質(zhì)，依次用5%雙氧水和5%次氯酸鈉對(duì)葉與根表面分別進(jìn)行洗消毒10 min，每次消毒結(jié)束后用無(wú)菌水清洗2-3次。

植物組織細(xì)菌DNA提取。參考高志民等［17］改良后的CTAB法，用液氮充分研磨碎植物樣品后取等量加入到離心管中，加入約600μL CTAB溶液，65℃水浴1 h，期間每5 min上下晃動(dòng)離心管。取出冷卻至室溫后加入700～800μL的氯仿-異戊醇混合液（V/V=24/1），離心后將上清液移至1.5 mL新管中，加入等體積冰異丙醇充分搖晃，離心后倒掉異丙醇、留下底部DNA白色沉淀，然后用無(wú)水乙醇洗滌DNA，倒掉乙醇后自然晾干。最后加入40μL無(wú)菌水溶解DNA，于-40℃冰箱內(nèi)保存。

1.2.4 土壤細(xì)菌和植物內(nèi)生細(xì)菌的PCR擴(kuò)增 土壤細(xì)菌和植物內(nèi)生細(xì)菌均選用細(xì)菌通用引物968 f和1 401 r［18］，擴(kuò)增16SrDNA基因V6～V8高變區(qū)。引物968 f-帶GC夾序列為CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCC GGCCCGCCGCCCCCGCCCCAACGCGAAGAACCTTAC。引物1 401 r序列為CGGTGTGTACAAGACCC（由上海生工生物技術(shù)有限公司合成）。擴(kuò)增體系組成為：Premix 20μL，引物968 f（10 mM）1μL，引物1 401 r（10 mM）1μL，BSA 1μL，DNA 2μL，無(wú)菌水15μL。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸3 min，30個(gè)循環(huán)，結(jié)束后再72℃延伸8 min。取4μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%（m/v）瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，然后用Goldview染色，確認(rèn)其片段大小，保存在-20℃冰箱內(nèi)。

1.2.3 DGGE技術(shù) 參照Maria［19］方法，使用DcodeTM基因突變檢測(cè)系統(tǒng)（BIO-RAD，USA）進(jìn)行變形梯度凝膠，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離分析。聚丙烯酰胺凝膠濃度為8%，變性梯度為45%～60%［20］。在1×TAE緩沖液中溫度電壓60℃、80 V條件下13 h。電泳結(jié)束后用EB染液染色10 min，使用紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.2.4 QUANTITY ONE軟件分析 Quantity one軟件對(duì)土壤及根葉樣品DGGE電泳圖進(jìn)行指紋圖譜分析，對(duì)植物根、葉樣品進(jìn)行聚類(lèi)分析。

以DGGE條帶信息為依據(jù)，應(yīng)用SPSS軟件對(duì)土壤及根、葉樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行香農(nóng)多樣性指數(shù)多重比較分析。

2 結(jié)果

2.1 土壤理化性質(zhì)分析

3種竹子所定植土壤的pH、有機(jī)質(zhì)、堿解氮、有效磷、速效鉀等5個(gè)指標(biāo)如表1，各項(xiàng)指標(biāo)的平均值有高低之分，但所有指標(biāo)、所有土壤之間均沒(méi)有顯著性差異，3塊地區(qū)養(yǎng)分沒(méi)有顯著性差異，說(shuō)明可以忽略土壤性質(zhì)對(duì)竹子生長(zhǎng)的差異影響。

表1 3種竹種地土壤理化性質(zhì)Tab.1 Physical and chemical characteristics of soil collected from three types of bamboo stands

2.2 土壤細(xì)菌和竹子根葉內(nèi)生細(xì)菌PCR擴(kuò)增結(jié)果

對(duì)植物和土壤 DNA分別進(jìn)行 PCR擴(kuò)增（圖1），在500 bp左右出現(xiàn)了明亮的條帶，確定為細(xì)菌16SrDNAV6～V8片段。

圖1 竹子內(nèi)生細(xì)菌（A）和土壤細(xì)菌（B）和PCR擴(kuò)增效果圖Fig.1 The gel electrophoresis of PCR products for entophytic bacteria of bamboo（A）and for soil bacteria（B）注：文中 XT，XY，XG，MT，MY，MG和 ZT，ZY，ZG分別代表孝順竹、毛竹和窄葉苦竹土壤、葉、根，1、2和3分別代表重復(fù)Note：The XT，XY，XG，MT，MY，MG and ZT，ZY，ZG in the article present partly Bambusa multiplex，Pleioblastus amarus，and Phyllostachys pubescens′s soil，leaves，roots，and the number of 1，2，3 present three repeats.

2.3 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

DGGE圖譜中條帶的多少直接反映樣品中微生物的多樣性，條帶數(shù)量越多標(biāo)志樣品中所含細(xì)菌種類(lèi)越多，條帶越粗說(shuō)明該種菌的生物量越大［20］。比較孝順竹、毛竹、窄葉苦竹生長(zhǎng)對(duì)應(yīng)土壤細(xì)菌條帶發(fā)現(xiàn)，同一竹種定植3個(gè)土壤重復(fù)相似度最高（圖2A），而不同竹種土壤之間存在差異；然而，毛竹和窄葉苦竹之間有較高的相似度，且條帶數(shù)量與亮度明顯比孝順竹高。分析發(fā)現(xiàn)9個(gè)樣品共產(chǎn)生了28條不同的條帶，共性條帶占總條帶數(shù)量的78.6%，說(shuō)明3個(gè)竹種土壤中的細(xì)菌種類(lèi)數(shù)接近，但不同竹種土壤細(xì)菌的豐度差異較大。

為了更準(zhǔn)確地揭示不同土壤細(xì)菌群落的差異程度，以DGGE條帶位置和密度的定量信息為依據(jù)對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行聚類(lèi)分析。結(jié)果表明，所有土壤聚合的相似值為0.63（圖2B），一般認(rèn)為相似值高于0.60的2個(gè)群體具有較好的相似性，說(shuō)明總體上3類(lèi)竹子的根區(qū)土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)沒(méi)有顯著性差異。進(jìn)一步分析不同竹種之間以及重復(fù)樣品的相似性發(fā)現(xiàn)，孝順竹的3個(gè)重復(fù)聚集在1個(gè)組，其他2種竹子3個(gè)重復(fù)沒(méi)有完全聚在一組，相對(duì)而言，孝順竹土壤細(xì)菌的結(jié)構(gòu)與其他2種差異較大。

圖2 土壤細(xì)菌基因片段擴(kuò)增后DGGE指紋圖譜（A）和聚類(lèi)分析樹(shù)（B）Fig.2 The DGGE fingerprint（A）and clustering analysis tree（B）of soil bacteria

2.4 植物內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

3種竹子內(nèi)生細(xì)菌的DGGE結(jié)果表明，葉子內(nèi)生細(xì)菌的條帶數(shù)量比根部相對(duì)多一些，但沒(méi)有明顯差異（圖3）；孝順竹和窄葉苦竹的同一組織的3個(gè)重復(fù)性較好，大部分為共性條帶，而毛竹的重復(fù)之間相似性較差；18個(gè)植物樣品共產(chǎn)生了23條不同的條帶，其中孝順竹、毛竹和窄葉苦竹的葉組織平均條帶數(shù)分別為18、17和17，對(duì)應(yīng)的根組織內(nèi)生細(xì)菌的條帶數(shù)分別為18、19和17。孝順竹葉和根的條帶數(shù)量多于其他竹種，亮度也比其他2種竹種高，說(shuō)明孝順竹內(nèi)生菌豐度較其他2種更高。為了揭示植物內(nèi)生細(xì)菌與土壤細(xì)菌關(guān)聯(lián)程度，選擇條帶數(shù)最多的窄葉苦竹2號(hào)土壤樣品作為參照，與植物樣品同批進(jìn)行DGGE。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，土壤細(xì)菌的條帶數(shù)明顯比植物內(nèi)生細(xì)菌多，除少數(shù)植物內(nèi)生細(xì)菌條帶外，大部分與土壤細(xì)菌相同，說(shuō)明植物內(nèi)生菌主要從土壤進(jìn)入植物。

圖3 竹子葉與根內(nèi)生細(xì)菌DGGE指紋圖譜Fig.3 The DGGE fingerprint of the endophytic bacteria in bamboo leaves and roots

為了更準(zhǔn)確地揭示不同土壤細(xì)菌群落的差異程度，以DGGE（圖3）條帶位置和密度的定量信息為依據(jù)進(jìn)行聚類(lèi)分析發(fā)現(xiàn)，除了MG3和ZG3的其他根樣品聚集在樹(shù)狀圖最下方（圖4），在相似值為0.53水平與其他樣品分開(kāi)，說(shuō)明竹根的內(nèi)生細(xì)菌與竹葉子及土壤存在較大差異；土壤樣品沒(méi)有單獨(dú)與植物樣品分開(kāi)，反而與毛竹葉子相似值為0.57；條帶結(jié)構(gòu)差異最大的ZG3，在相似值為0.33水平與其他所有樣品分開(kāi)。綜觀(guān)不同樣品之間的相似值發(fā)現(xiàn)，植物葉和根組織中，不是所有竹種的3個(gè)重復(fù)樣品都完全聚在一組，雖然有些組織的2個(gè)重復(fù)（ZY3與ZY1）相似度比較高，但同一植物、同一組織的內(nèi)生菌仍有結(jié)構(gòu)差異。因此，聚類(lèi)分析能更加準(zhǔn)確反應(yīng)樣品之間的差異。

2.5 土壤樣品與植物細(xì)菌多樣性分析

以DGGE條帶數(shù)量和密度為依據(jù)計(jì)算香農(nóng)多樣性指數(shù)（表2），相同組織不同竹種的比較結(jié)果表明，孝順竹的葉和根內(nèi)生細(xì)菌多樣性均顯著高于（P＜0.05）其他2種竹子的對(duì)應(yīng)組織，而孝順竹土壤的細(xì)菌多樣性則明顯低于（P＜0.05）其他2種土壤，說(shuō)明植物內(nèi)生細(xì)菌多樣性受竹子種類(lèi)影響；同一竹種的葉和根之間內(nèi)生細(xì)菌多樣性沒(méi)有顯著性差異，而土壤的細(xì)菌多樣性顯著高于（P＜0.05）葉和根。

圖4 植物樣品聚類(lèi)分析樹(shù)Fig.4 The clustering analysis tree of plant endophytic bacteria

表2 3種竹子葉、根、土壤細(xì)菌的香農(nóng)多樣性指數(shù)（Shannon diversity index）比較Tab.2 The bacterial Shannon diversity index of tissue leaf，roots and soil samples

3 討論與結(jié)論

不同竹子根區(qū)土壤細(xì)菌的結(jié)構(gòu)和多樣性比較：從研究竹子定植土壤的理化性質(zhì)分析中發(fā)現(xiàn)，5項(xiàng)主要理化性沒(méi)有顯著差異，然而，不同竹子定植土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性則存在差異。其中孝順竹土壤的條數(shù)量和亮度均低于毛竹和窄葉苦竹（圖2A），多樣性指數(shù)顯著低于（P＜0.05）毛竹和窄葉苦竹（表2）。3種土壤的理化性質(zhì)基本一致，導(dǎo)致孝順竹土壤細(xì)菌多樣性明顯低于其他2種竹子，可能是植物遺傳差異所致。同一種植物在同一地點(diǎn)連續(xù)種植會(huì)產(chǎn)生“連作障礙”［21］，單一植物的根系分泌物是導(dǎo)致微生物多樣性下降的重要原因之一。雖然3種竹子均屬于連作范疇，但叢生的孝順竹生長(zhǎng)地點(diǎn)完全固定，而散生毛竹和混生窄葉苦竹單體的位置沿著竹鞭延展不斷變化，竹根以及根系分泌物沒(méi)有固定空間，它對(duì)根區(qū)土壤微生物的影響程度不如孝順竹強(qiáng)。聚類(lèi)分析顯示3種竹子根區(qū)土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)差異也證明了以上推測(cè)（圖3），表現(xiàn)為孝順竹3個(gè)樣品的重復(fù)性好且聚集在一組，而另一組的毛竹及窄葉苦竹重復(fù)性較差，2種竹子的樣品交叉排列，6個(gè)樣品在相似值0.65水平上相聚。

通過(guò)DGGE方法研究發(fā)現(xiàn)，土壤細(xì)菌多樣性顯著高于竹子組織內(nèi)生菌符合大部分研究結(jié)果。如夏冬亮［13］研究發(fā)現(xiàn)，天然毛竹林與人工毛竹林中根際土壤細(xì)菌、根面細(xì)菌與根內(nèi)細(xì)菌均具有共同菌種，而菌種多樣性根際最高，根部?jī)?nèi)生菌最低。植物內(nèi)生菌明顯低于土壤的原因：細(xì)菌從土壤到根表、根內(nèi)部的過(guò)程中要突破層層屏障，從根部再到地上的莖桿和葉子同樣要突破層層屏障。因此，不同植物組織內(nèi)生菌表現(xiàn)為根部數(shù)量最高、其次為莖和葉、種子最少［22-23］，這種梯度規(guī)律不受植物生長(zhǎng)階段以及植物生長(zhǎng)影響［22］。根際土壤細(xì)菌數(shù)量和種類(lèi)＞植物根部?jī)?nèi)生細(xì)菌＞葉子內(nèi)生細(xì)菌可視為一般規(guī)律［22-24］。然而，研究發(fā)現(xiàn)竹子根和葉內(nèi)生細(xì)菌種類(lèi)多樣性沒(méi)有顯著差異，有可能是竹子組織結(jié)構(gòu)之間的通道比一般農(nóng)作物大［25］，利于細(xì)菌的遷移。研究表明，細(xì)菌通過(guò)主動(dòng)（微生物分泌分解細(xì)胞壁酶穿過(guò)中柱鞘到達(dá)木質(zhì)部導(dǎo)管）和被動(dòng)（組織內(nèi)的自然通道被動(dòng)滲透）的2種侵入方式進(jìn)入植物根部以及在體內(nèi)傳輸；內(nèi)生菌通過(guò)主動(dòng)方式侵入植物體內(nèi)的能力和數(shù)量主要取決于細(xì)菌的特性，而被動(dòng)形式則更多的受到組織內(nèi)部通道大小的影響，竹子組織內(nèi)部通道能通過(guò)細(xì)菌進(jìn)行被動(dòng)傳輸。但也有一些作物如湖光尖椒，會(huì)出現(xiàn)其葉片內(nèi)生細(xì)菌多樣性高于根部的情況［26］。以上結(jié)果說(shuō)明內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量以及在植物不同器官的分布規(guī)律主要受植物遺傳特性影響，包括空間通道的物理特性以及對(duì)外界細(xì)菌侵染感應(yīng)等生物特性，但確切的機(jī)理有待深入研究。土壤細(xì)菌條帶數(shù)量顯著大于竹子內(nèi)生細(xì)菌，除少數(shù)幾個(gè)條帶外，竹根和葉大部分條帶與土壤一致，說(shuō)明植物內(nèi)生菌主要來(lái)自土壤，少部分來(lái)自空氣。其他研究也得到類(lèi)似結(jié)果［27-28］。同一竹種、同一組織的重復(fù)樣品之間具有較好的相似性，相似值最高達(dá)到0.87（ZY1和ZY3）；雖然竹子根和葉內(nèi)生細(xì)菌種類(lèi)多樣性沒(méi)有顯著差異，但根部?jī)?nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)與葉子有較大差異（圖4）。以上差異結(jié)果主要有兩方面原因：一是土壤細(xì)菌的空間異質(zhì)性，袁宗勝等［12］對(duì)毛竹竹鞭內(nèi)生細(xì)菌的特征和多樣性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，來(lái)源于不同地區(qū)的毛竹竹鞭內(nèi)生細(xì)菌組成存在較大差異。長(zhǎng)期叢生于同一地點(diǎn)的孝順竹，其根和葉內(nèi)生細(xì)菌的重復(fù)性明顯高于其他2種竹，這一結(jié)果證明土壤異質(zhì)性對(duì)竹子內(nèi)生細(xì)菌的不同影響；二是竹子遺傳特性、生長(zhǎng)時(shí)間以及長(zhǎng)勢(shì)差異。孝順竹（叢生竹）的遺傳特性與毛竹（散生竹）和窄葉苦竹（混生竹）差異較大。另外，雖然采樣時(shí)選擇比較一致的健康竹子，但竹子的生勢(shì)仍然可能存在差異，采集的竹子樣品還可能不是同一年生的（采樣時(shí)沒(méi)有專(zhuān)門(mén)區(qū)分竹齡）。植物遺傳特性對(duì)內(nèi)生細(xì)菌影響還表現(xiàn)在同一作物的不同品種。羅明等［29］研究發(fā)現(xiàn)抗病品種哈密瓜的內(nèi)生細(xì)菌物種多樣性高于感病品種，楊樹(shù)屬不同品種內(nèi)生細(xì)菌也發(fā)現(xiàn)類(lèi)似現(xiàn)象［12］。

土壤細(xì)菌是植物內(nèi)生細(xì)菌的主要來(lái)源，理論上推測(cè)土壤細(xì)菌和植物內(nèi)生細(xì)菌是正相關(guān)關(guān)系，土壤細(xì)菌越多則植物內(nèi)生細(xì)菌越多。而研究中的孝順竹卻出現(xiàn)反相關(guān)現(xiàn)象，其土壤細(xì)菌多樣性顯著低于其他2種竹子，而植物根和葉子的內(nèi)生細(xì)菌則正好相反?？赡苁切㈨樦竦纳硖匦院徒M織結(jié)構(gòu)與毛竹及苦竹不同所致。具體分析如下：一方面可能與其長(zhǎng)期叢生于同一地點(diǎn)有關(guān)，有利于內(nèi)生細(xì)菌的積累；另一方面可能是叢生竹的組織結(jié)構(gòu)與散生或混生的不同，更加有利于細(xì)菌侵入植物根部以及在體內(nèi)傳輸。當(dāng)然，這些主要是推測(cè)，需要進(jìn)一步的研究支撐。

結(jié)論，土壤細(xì)菌是竹子內(nèi)生細(xì)菌的主要來(lái)源，竹子種類(lèi)對(duì)土壤細(xì)菌結(jié)構(gòu)和多樣性有一定影響。孝順竹定植土壤細(xì)菌多樣性顯著低于毛竹和窄葉苦竹，其群落結(jié)構(gòu)與其他2種竹子差異相對(duì)較大。土壤細(xì)菌群落多樣性顯著高于竹子的內(nèi)生細(xì)菌，竹葉和根部組織之間沒(méi)有顯著差異。相同組織孝順竹內(nèi)生細(xì)菌多樣性明顯高于（P＜0.05）毛竹及窄葉苦竹。以上結(jié)論可能存在局限性，因?yàn)镈GGE技術(shù)只能檢測(cè)到樣品中數(shù)量大于1%的優(yōu)勢(shì)菌種［30］，以后將采集更多的來(lái)自不同土壤的竹子樣品，用高通量測(cè)序技術(shù)結(jié)合傳統(tǒng)培養(yǎng)方法進(jìn)行深入研究，以揭示竹子內(nèi)生細(xì)菌的特征和多樣性及其與環(huán)境微生物的關(guān)系。