趙婉琪，吳正春，肖 姣，國(guó)春策，楊光耀，林樹(shù)燕，于 芬

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院江西南昌330045；2.江西省竹子種質(zhì)資源與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室江西南昌330045；3.南京林業(yè)大學(xué)竹類研究所江蘇南京210037）

花粉作為傳遞遺傳信息的重要載體，是植物在遺傳繁育、雜交育種和種質(zhì)保存方面必不可少的材料；柱頭作為可識(shí)別和接收花粉的組織，其可授期是植物有性生殖過(guò)程中非常關(guān)鍵的時(shí)期；花粉生活力和柱頭可授性的強(qiáng)弱是影響植物進(jìn)行傳粉繁育的重要因素。掌握花粉活力變化規(guī)律及其貯藏條件、開(kāi)花過(guò)程中柱頭可授性的動(dòng)態(tài)變化對(duì)于生殖生物學(xué)研究、雜交育種都具有重要意義。竹類植物由于開(kāi)花周期長(zhǎng)，開(kāi)花結(jié)實(shí)較為少見(jiàn)，使我們對(duì)其傳粉機(jī)制、有性繁殖規(guī)律認(rèn)識(shí)匱乏，而大部分竹種花后死亡會(huì)造成竹林衰退，使竹林產(chǎn)業(yè)、生態(tài)安全面臨嚴(yán)重威脅［1-5］。近年來(lái)，不少學(xué)者對(duì)竹類植物花粉活力及柱頭可授性進(jìn)行了大量研究，如毛竹（Phyllostachys edulis）［6］、麻竹（Dendrocalamus latiflorus）［7］、紫竹（Ph.nigra）［8］、翠竹（Sasa pygmaea）［9］、異葉苦竹（Arundinaria simonii）［10］等，但未見(jiàn)關(guān)于筆竹（Pseudosasa viridulaS.L.Chen et G.Y.Sheng）花粉活力及柱頭可授性的報(bào)道。

筆竹為禾本科竹亞科（Bambusoideae）矢竹屬（PseudosasaMakino ex Naka）竹種［11］。目前，有關(guān)筆竹的研究資料很少［12-13］，而對(duì)筆竹的花粉活力和柱頭可授性測(cè)定，則未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。對(duì)花粉生活力鑒定有多種測(cè)定方法，試驗(yàn)采用操作簡(jiǎn)便的I2-KI染色法快速測(cè)定筆竹花粉活力，采用普遍應(yīng)用的花粉離體培養(yǎng)基法比較分析不同采樣階段以及不同儲(chǔ)藏條件下筆竹的花粉活性，同時(shí)對(duì)柱頭可授性及可授期進(jìn)行測(cè)定，以期探索竹類植物花粉萌發(fā)率、花粉適宜的儲(chǔ)藏條件及柱頭可授性變化規(guī)律，旨在豐富竹類植物生殖生物學(xué)特性，并為筆竹遺傳改良、雜交育種研究提供基礎(chǔ)資料，同時(shí)也是為揭示竹子開(kāi)花的機(jī)制打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

材料采自江西農(nóng)業(yè)大學(xué)竹類植物種質(zhì)園內(nèi)處于盛花期、成熟但未散粉的筆竹花藥，用鑷子夾入至離心管中，并保存在放有冰袋的保溫箱內(nèi)迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，現(xiàn)采現(xiàn)用。用解剖針劃破花藥，將其與液體培養(yǎng)液均勻混合，放入25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)。定期用滴管吸取培養(yǎng)液于載玻片上，并在顯微鏡下觀察花粉萌發(fā)情況，每次觀察統(tǒng)計(jì)至少3個(gè)不重復(fù)視野，每個(gè)視野花粉粒不少于100粒。以花粉管長(zhǎng)度大于花粉直徑為標(biāo)準(zhǔn)，萌發(fā)率=萌發(fā)總數(shù)/總花粉數(shù)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 柱頭可授性測(cè)定 采用聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫法（1%聯(lián)苯胺∶3%過(guò)氧化氫∶水=4∶11∶22）測(cè)定柱頭可授性。若柱頭具有可授性，則柱頭周圍反應(yīng)液呈藍(lán)色并伴隨大量氣泡，反之無(wú)氣泡且不變藍(lán)，共統(tǒng)計(jì)處于不同開(kāi)花進(jìn)程內(nèi)的30枚柱頭。

1.2.2 花粉生活力測(cè)定 取1枚成熟且未散粉的新鮮筆竹花藥于載玻片上，用鑷子或解剖針將其劃破，均勻搗碎后，加入1-2滴I2-KI溶液，蓋上蓋玻片，移至顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍照記錄。

1.2.3 花粉最佳萌發(fā)時(shí)間 采集花粉置于基礎(chǔ)培養(yǎng)基（5%蔗糖+0.01%硼酸）中，每隔0.5 h統(tǒng)計(jì)1次花粉萌發(fā)率，每次設(shè)置3個(gè)重復(fù)，直至花粉停止萌發(fā)。

1.2.4 花粉最適培養(yǎng)基組合 設(shè)置以下16種不同組合液體培養(yǎng)基（表1），pH=5.8［9］；以前期測(cè)試的最佳萌發(fā)時(shí)間為標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)時(shí)間，分別觀察統(tǒng)計(jì)花粉在各個(gè)培養(yǎng)基上的萌發(fā)率，從而確定筆竹花粉的最適培養(yǎng)基組合。

1.2.5 花粉萌發(fā)的日變化率 選擇筆竹盛花期的某一晴天從7∶00-18∶00每間隔1 h采集一次成熟未散粉花藥，置于最佳培養(yǎng)基上，統(tǒng)計(jì)花粉萌發(fā)率，以確定1 d之內(nèi)花粉萌發(fā)的變化規(guī)律。

表1 筆竹花粉離體培養(yǎng)基組分Tab.1 Composition of the culture medium for pollen germination

1.2.6 室溫下花粉活力維持時(shí)間 采集成熟未散粉的花藥，帶回實(shí)驗(yàn)室，用解剖針剖開(kāi)花粉囊，使花粉完全散出并直接放置于室溫條件下，每隔5 min取適量花粉置于最佳培養(yǎng)基內(nèi)，觀測(cè)花粉萌發(fā)率。

1.2.7 不同儲(chǔ)藏條件下的花粉萌發(fā)率 采集盛花期內(nèi)成熟未散粉的花藥，分別設(shè)置4種不同的儲(chǔ)藏條件：①4℃不加干燥劑儲(chǔ)藏；②4℃加干燥劑儲(chǔ)藏；③室溫不加干燥劑儲(chǔ)藏；④室溫加干燥劑儲(chǔ)藏。每隔一定時(shí)間，置于最佳培養(yǎng)基中，統(tǒng)計(jì)不同儲(chǔ)藏條件下筆竹花粉萌發(fā)率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，SPSS17.0進(jìn)行分析，采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）進(jìn)行均值間的差異性比較，用Duncan多重比較方法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，利用Origin2018繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 柱頭可授性測(cè)定

由表2可知，柱頭在未伸出時(shí)可授性檢驗(yàn)顯示少量氣泡從柱頭底部邊緣冒出，即開(kāi)花初期柱頭已具有一定的可授性，可進(jìn)行授粉；隨著開(kāi)花進(jìn)程的推進(jìn)，柱頭可授性逐漸增強(qiáng)，當(dāng)雌蕊發(fā)育成熟，花藥開(kāi)始散粉，整個(gè)柱頭被大量氣泡包裹，可授性最強(qiáng)；隨著外稃閉合，柱頭彎曲萎縮，可授性逐漸減弱。

表2 聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫法檢測(cè)柱頭可授性Tab.2 The stigma receptivity estimated by benzidine-H2 O2

2.2 花粉活力測(cè)定

采用I2-KI染色法測(cè)定筆竹花粉活力，其中藍(lán)色或黑藍(lán)色的花粉為發(fā)育較好，黃褐色花粉為發(fā)育不良，無(wú)色花粉為死亡花粉粒。結(jié)果如下：共計(jì)鏡檢筆竹花粉粒11 141粒，其中發(fā)育良好的花粉粒6 275粒，約為56%，發(fā)育不良花粉粒4 034粒，約為36%，死亡花粉粒847粒，約為8%，筆竹花粉敗育率約為44%。

2.3 花粉萌發(fā)最佳培養(yǎng)時(shí)間

不同培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)對(duì)筆竹花粉萌發(fā)率的影響不同。由圖2可知，隨著時(shí)間的推移，筆竹花粉萌發(fā)率逐漸上升，到達(dá)3 h時(shí)花粉萌發(fā)率達(dá)到最高值30.73%±3.52%，后期萌發(fā)率趨于平穩(wěn)，直至花粉管生長(zhǎng)停滯，表明3 h為觀測(cè)筆竹花粉萌發(fā)率的最適時(shí)長(zhǎng)。

圖1 筆竹花粉染色后的不同狀態(tài)Fig.1 Different states of pollen after staining（1）發(fā)育良好花粉；（2）死亡花粉；（3）發(fā)育不良花粉（1）Well-developed pollen；（2）Dead pollen；（3）Stunted pollen

2.4 花粉萌發(fā)最適培養(yǎng)基組合

不同培養(yǎng)基組合對(duì)筆竹花粉萌發(fā)率的影響不同。由圖3得知，筆竹花粉在第5號(hào)（10%蔗糖+0.01%H3BO3）培養(yǎng)基組合上的萌發(fā)率最高，達(dá)到43.61%±2.58%，極顯著高于其他培養(yǎng)基組合，說(shuō)明10%蔗糖 +0.01%H3BO3培養(yǎng)基組合為最佳培養(yǎng)基組合；在第15號(hào)（20%蔗糖+0.1%H3BO3）培養(yǎng)基組合上花粉萌發(fā)率達(dá)到最低，僅為3.2%±0.74%，說(shuō)明高濃度的蔗糖會(huì)導(dǎo)致花粉內(nèi)、外滲透壓無(wú)法保持平衡，細(xì)胞脫水死亡，因而降低花粉的萌發(fā)率；Ducan多重比較分析結(jié)果顯示，在p=0.05檢驗(yàn)水平上，第1、5、9、13號(hào)培養(yǎng)基顯著高于其他培養(yǎng)基組合，即在相同蔗糖濃度的條件下，花粉在加入低濃度的硼酸（0.01%）后萌發(fā)率提高。

2.5 花粉萌發(fā)的日變化率

圖2 花粉的最佳萌發(fā)時(shí)間Fig.2 The optimal time for pollen to germinate

2019年3月25日從7∶00-18∶00每隔1 h持續(xù)采集成熟未散粉花藥，置于花粉萌發(fā)最佳培養(yǎng)基組合10%蔗糖+0.01%H3BO3上培養(yǎng)3 h。圖4結(jié)果表明，1 d之內(nèi)不同時(shí)間段花粉萌發(fā)率差異明顯，其中3∶00 pm時(shí)花粉萌發(fā)率顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)，達(dá)37.41%±7.25%；隨后迅速下降，在6∶00 pm時(shí)達(dá)到最低，僅為4.76%±2.07%?；ǚ勖劝l(fā)日變化率測(cè)定為日后筆竹授粉時(shí)間確定提供了參考依據(jù)。

2.6 室溫下花粉活力維持時(shí)間

測(cè)定花粉（無(wú)花粉囊）在室溫下的花粉萌發(fā)率：由圖5可知，新鮮筆竹花粉的萌發(fā)率最高，可達(dá)41.3% ±7.39%；而隨著在室溫內(nèi)放置時(shí)間的增加，花粉萌發(fā)率在10 min后迅速下降，20 min后花粉萌發(fā)率僅為6.93%±1.13%，30 min后萌發(fā)率只有2.24%±0.56%，35 min后花粉完全失去活力，花粉活力維持時(shí)間非常短，極易失活；在自然條件下，受光照、降水等環(huán)境因素的影響，花粉更易喪失萌發(fā)能力，因此做到現(xiàn)采現(xiàn)授，有助于提高竹花受精率。

圖3 不同液體培養(yǎng)基組合中花粉的萌發(fā)率Fig.3 The germination rate of pollen in different liquid culture media

圖4 花粉萌發(fā)的日變化率Fig.4 The diurnal variations of pollen germination

圖5 室溫條件下的花粉萌發(fā)率Fig.5 The germination rate of pollen under room temperature

2.7 不同儲(chǔ)藏條件下的花粉萌發(fā)率

測(cè)定花藥在4種不同儲(chǔ)藏下的花粉萌發(fā)率：采集新鮮花藥進(jìn)行4種不同處理，取一定的花粉置于最佳培養(yǎng)基組合上培養(yǎng)。由圖6可知，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，4種不同儲(chǔ)藏條件下的花粉萌發(fā)率均呈顯著下降趨勢(shì)；可以看出4℃條件下，未經(jīng)干燥處理的花粉萌發(fā)率顯著高于干燥處理過(guò)的花粉，其中前8 h內(nèi)，2種處理下的花粉活性下降趨勢(shì)不顯著，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，干燥處理后的花粉活力迅速下降，72 h內(nèi)花粉失活，而相同溫度下未經(jīng)干燥處理的花粉活力則延長(zhǎng)至120 h；常溫條件下，經(jīng)過(guò)干燥處理的花粉在24 h內(nèi)迅速失活，而未經(jīng)過(guò)干燥處理的花粉儲(chǔ)藏24 h后活力為10.6%±6.42%，直至3 d后才完全失去活性；綜上所述，是否經(jīng)過(guò)干燥處理對(duì)筆竹花粉活力具有顯著影響，4℃低溫對(duì)花粉活力具有一定的積極作用，因此低溫、濕藏短時(shí)間內(nèi)可有效延長(zhǎng)筆竹的花粉活力，但仍難以滿足遠(yuǎn)距離攜帶，因此，筆竹雜交育種工作盡可能做到現(xiàn)采現(xiàn)授。

圖6 不同儲(chǔ)藏條件下的花粉萌發(fā)率Fig.6 The germination rate of pollen under different treatments

3 討論

花粉活力和柱頭可授性是影響授粉質(zhì)量和結(jié)實(shí)率的關(guān)鍵因素，因此準(zhǔn)確測(cè)定花粉活力和柱頭可授性非常重要，是人工授粉實(shí)踐前必不可少的基礎(chǔ)研究。實(shí)驗(yàn)中，采用了染色法和萌發(fā)法2種不同的實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定花粉活力，通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，I2-KI染色法測(cè)得新鮮筆竹花粉活力為56%，在室溫下放置15 min后失去活力；采用花粉離體培養(yǎng)基法測(cè)得新鮮花粉萌發(fā)率為41.3%，放置在室溫條件下10 min后活性迅速下降，在35 min左右完全失活，兩者具有差異。在以往的研究中，對(duì)短穗竹（Brachystachyum densiflorum）［14］、早竹（Ph.praecox）［15-16］、孝順竹（B.multiplex）［17］等多種竹種花粉萌發(fā)率測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明兩種實(shí)驗(yàn)結(jié)果均存在差異，這是因?yàn)镮2-KI染色法雖然快速、簡(jiǎn)便，但未考慮外界環(huán)境（溫度、濕度、時(shí)間、pH值等）對(duì)萌發(fā)率產(chǎn)生的影響，誤差相對(duì)較大，而離體萌發(fā)為花粉提供的條件與花粉在柱頭內(nèi)自然萌發(fā)的條件更為相近，因此花粉離體培養(yǎng)基法測(cè)定結(jié)果相較于染色法更為準(zhǔn)確［18］。但同時(shí)2種實(shí)驗(yàn)均表明，筆竹花粉活力不高；新鮮的筆竹花粉萌發(fā)率最強(qiáng)，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，花粉活力均迅速下降直至失去活性。

離體培養(yǎng)基法常用的基本成分是蔗糖和硼酸，蔗糖對(duì)植物花粉離體萌發(fā)起到關(guān)鍵影響，主要起到提供營(yíng)養(yǎng)能量和調(diào)節(jié)滲透壓的作用［19-21］；硼酸在花粉萌發(fā)的作用中主要起到促進(jìn)糖的吸收、代謝，并參與花粉管壁的建造，從而促進(jìn)花粉萌發(fā)和花粉管伸長(zhǎng)［22-24］；硼酸與蔗糖的融合能夠更好地提高花粉的萌發(fā)率，因此添加適宜濃度的蔗糖和硼酸有利于促進(jìn)花粉萌發(fā)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過(guò)高或過(guò)低的蔗糖濃度都不利于筆竹花粉萌發(fā)，當(dāng)蔗糖濃度穩(wěn)定在10%時(shí)，筆竹花粉內(nèi)、外滲透壓平衡，花粉萌發(fā)效果最好，與五月季竹（Ph.bambusoides）［25］、木竹（B.rutila）［25］、雷竹（Ph.praecoxf.prevernalis）［26］、福建茶稈竹（P.amabilisvar.convexa）［14］等多種竹種所需蔗糖濃度一致；當(dāng)硼酸濃度為0.01%時(shí)更有利于促進(jìn)筆竹花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)，這與林樹(shù)燕等［10］、劉靜等［27］的研究結(jié)果一致。

花粉活力除了受自身遺傳因素的影響外，也與外界環(huán)境因素影響緊密相關(guān)，其中儲(chǔ)藏溫度和濕度是影響花粉活力最重要的外界環(huán)境因素。一般來(lái)說(shuō)，低溫和冷藏處理可以抑制花粉的呼吸作用和酶活性，適宜的花粉含水量有利于儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)［28-29］。本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)4℃低溫濕藏將筆竹花粉活力延長(zhǎng)至120 h；前人報(bào)道雷竹花粉在低溫濕藏可保存114 h［26］；毛竹花粉在4℃低溫保存5 d后仍可授粉利用［30］；陳良碧等［31］對(duì)禾本科3種不同植物花粉在不同儲(chǔ)藏條件下進(jìn)行保存，發(fā)現(xiàn)低溫濕藏處理下花粉蛋白質(zhì)降解更慢，進(jìn)一步證明低溫、濕藏是有利于延長(zhǎng)植物花粉活力的儲(chǔ)藏條件。

柱頭的可授期在一定程度上決定著授粉的成功與否。通過(guò)采用聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫測(cè)定筆竹柱頭可授性，研究結(jié)果表明，開(kāi)花初期筆竹柱頭即具有可授性，隨著開(kāi)花時(shí)長(zhǎng)的增加，可授性逐漸增強(qiáng)，直至雌蕊發(fā)育成熟、花藥開(kāi)始破裂散粉時(shí)可授性達(dá)到最強(qiáng)，但隨著散粉完成，內(nèi)、外稃的閉合，柱頭由透白、直立變成枯黃、萎縮，柱頭可授性也隨之減弱，柱頭可授期非常短，僅2～3 h，因此把握正確的可授期可有效增加授粉成功的幾率。

4 結(jié)論

綜上所述，花粉離體培養(yǎng)基法相對(duì)于I2-KI染色法測(cè)定花粉活性更具有準(zhǔn)確性；離體培養(yǎng)花粉的過(guò)程中，過(guò)高或過(guò)低濃度的蔗糖和硼酸都不利于促進(jìn)花粉萌發(fā)，因此筆竹花粉在濃度為10%蔗糖+0.01%硼酸的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)3 h萌發(fā)率最高；1 d內(nèi)不同時(shí)間段、開(kāi)花進(jìn)程內(nèi)的花粉活性、柱頭可授性不同，筆竹花粉在3∶00 pm左右花粉活性最強(qiáng)，而柱頭可授性在花藥散粉時(shí)期最強(qiáng)，可在此時(shí)間段收集新鮮筆竹花粉對(duì)散粉期的柱頭進(jìn)行授粉；新鮮花粉易失活，4℃低溫濕藏短時(shí)間內(nèi)有利于延長(zhǎng)花粉活性?；ǚ刍盍Φ膹?qiáng)弱和柱頭可授期的長(zhǎng)短是影響授粉成功的關(guān)鍵因素，研究為筆竹授粉繁育及雜交育種研究提供了參考依據(jù)。