肖 丹，胡 昕，楊萬(wàn)林，李晚誼，李智敏，吳麗華，張 庭，楊德志，楊亞玲，王家金*

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所，云南 昆明 650205；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，云南 昆明 650223；3.昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500)

【研究意義】燈盞花主要產(chǎn)于云南、廣西、貴州等地，又稱燈盞細(xì)心，為菊科植物短葶飛蓬的干燥全草，其主要成分為黃酮類化合物，有效成分為燈盞花乙素[1]。具有清除活性氧自由基、溶解血栓、增強(qiáng)腦部血液流動(dòng)和降低血管阻力等作用[2]，臨床上多用于治療心腦血管等疾病[3～6]。作為國(guó)家重點(diǎn)開(kāi)發(fā)的中藥材，燈盞花在云南麗江、紅河等地實(shí)現(xiàn)大規(guī)模種植?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，燈盞花中有效成分——燈盞花乙素的提取主要為水浸提法、超聲波提取法、溶劑回流法等[7]。《中華人民共和國(guó)藥典》2015版藥典中即采用溶劑回流的方法提取燈盞花乙素，而后再利用HPLC法測(cè)定燈盞花中燈盞花乙素含量。但使用雙水相萃取技術(shù)提取燈盞花中燈盞花乙素的報(bào)道很少?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】雙水相萃取是一種基于液-液萃取的技術(shù)，其以操作簡(jiǎn)單、萃取條件溫和易于放大等一系列優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物分離、生物提取等領(lǐng)域[8-9]。近年來(lái)，有報(bào)道使用一種水溶性低級(jí)醇-鹽雙水相體系分離技術(shù)提取分離藥用植物中的有效成分，克服傳統(tǒng)雙水相萃取中因聚合物粘度大造成的不易收集，不易回收等缺點(diǎn)[10-13]?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)以無(wú)毒無(wú)害的低級(jí)醇(乙醇)與鹽形成雙水相體系，將其應(yīng)用于燈盞花中燈盞花乙素的提取分離。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和試劑

燈盞花藥材由云南易思高生物科技有限公司提供；燈盞花乙素對(duì)照品購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；乙醇、(NH4)2SO4、H3PO4、NaCl、Na2CO3、Na2SO4Na3PO4和NaOH均為分析純，甲醇為色譜純、水為超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與色譜條件

KQ100DB型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；pH計(jì)(雷磁PHS-3C)；FA1004型萬(wàn)分之一分析天平(上海恒平科學(xué)儀器有限公司)；HC-3018R高速冷凍離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)；德國(guó)IKA Lab Dancer小舞靈漩渦混勻器。

Agilent 1260高效液相色譜儀(配備四元泵、VWD檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱)，色譜條件：Agilent TC-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-0.1 %磷酸溶液(40∶60)，檢測(cè)波長(zhǎng)為335 nm，流速為1 mL/min，柱溫箱為25 ℃。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 燈盞花粗提液的制備 將干燥后的燈盞花全草打粉至80目，取細(xì)粉0.1 g(精密稱定)，將其置于25 mL具塞離心管中，加入10 mL甲醇，密塞，稱重，超聲1 h，放冷稱重，甲醇補(bǔ)足重量。然后于4000 r/min離心10 min，取上清液，加水稀釋至50 mL，作為燈盞花乙素粗提液。

1.3.2 雙水相萃取分離燈盞花乙素 考慮雙水相體系的性質(zhì)，選擇乙醇作為提取溶劑。取10 mL燈盞花乙素粗提液至15 mL 離心管中，加入一定量的(NH4)2SO4和無(wú)水乙醇，調(diào)pH值至6，渦旋1 min，使其充分混合。然后以4000 r/min離心5 min，促使其分相。下層即為鹽相，上層為乙醇萃取相。讀取上下層體積之后(相比=萃取相體積/水相體積)，用注射器移除下層水相。為防止萃取相中存在的鹽對(duì)高效液相色譜儀造成腐蝕，萃取相中加甲醇0.5 mL進(jìn)行脫鹽處理，最后甲醇定容至2 mL，過(guò)0.45 μm有機(jī)相濾膜之后，取10 μl進(jìn)HPLC進(jìn)行分析。

1.3.3 燈盞花乙素含量測(cè)定 采用HPLC法測(cè)定燈盞花粗提液中燈盞花乙素含量。根據(jù)燈盞花乙素標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其濃度，然后再按下式計(jì)算燈盞花乙素含量(%)：

式中，R為萃取效率(%)；Cu為燈盞花乙素在萃取相中的濃度(mg/mL)；Vu為萃取相的體積(mL)；m為稱取的燈盞花粉末的質(zhì)量(mg)。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙水相體系的形成與燈盞花乙素的萃取過(guò)程

所使用的乙醇能與水完全互溶，通過(guò)乙醇-水體系統(tǒng)加入(NH4)2SO4，利用鹽析作用，促進(jìn)乙醇與水相的分離。雙水相體系的形成是(NH4)2SO4與乙醇爭(zhēng)奪水分子的過(guò)程，隨著鹽濃度的增大，鹽會(huì)奪取水分子，促使乙醇從鹽相析出，使水分子離開(kāi)乙醇相，最終出現(xiàn)分相，上層為乙醇相，下層為鹽水相。為研究不同條件下，雙水相體系中乙醇相的變化，通過(guò)以下公式計(jì)算相比Rv∶Rv=Vend∶Vin，式中,Vend為乙醇相的體積，Vin為加入的乙醇的初始體積。當(dāng)Rv趨近于1時(shí)表示乙醇與水完全分離。

當(dāng)初始乙醇的量較小時(shí)，促使溶液分相所需要加入的(NH4)2SO4量比較大；當(dāng)初始乙醇的量較大時(shí)，促使溶液分相所需要加入的(NH4)2SO4量會(huì)相對(duì)減少，同時(shí)，相比Rv>1，說(shuō)明雙水相形成過(guò)程中有部分水進(jìn)入乙醇相，導(dǎo)致溶液的分相能力變差。這主要是乙醇的水化能力較大，初始的量較大時(shí)，會(huì)影響其分相能力，不利于燈盞花乙素的富集。此外，無(wú)機(jī)鹽的鹽析能力越大，分相能力也越強(qiáng)。故選擇合適的鹽和加入合適量的乙醇，有助于雙水相體系的形成。

燈盞花乙素屬于黃酮類化合物，分子中含有多個(gè)酚羥基和羰基，在pH較高和較低情況下，會(huì)發(fā)生酚羥基氫離子的電離和羰基的質(zhì)子化，最終變成大極性離子。由于酚羥基的存在，燈盞花乙素相當(dāng)于多元弱酸，一般會(huì)以質(zhì)子化陽(yáng)離子形態(tài)、分子形態(tài)和失質(zhì)子化陰離子形態(tài)存在。根據(jù)相似相溶的原理，弱極性的分子形態(tài)燈盞花乙素易富集于乙醇相中，而大極性離子形態(tài)的燈盞花乙素則易于分配在水相中。因此，溶液酸堿度對(duì)燈盞花乙素的分配起很重要作用。分子形態(tài)的燈盞花乙素結(jié)構(gòu)上的酚羥基和羰基與乙醇羥基之間的氫鍵也非常有利于提高燈盞花乙素的分配比，使其易富集于乙醇中。

2.2 雙水相體系的優(yōu)化

2.2.1 不同鹽對(duì)燈盞花乙素萃取率和相比的影響 乙醇能與水無(wú)限互溶，為使其分相，分別加入NaCl、(NH4)2SO4、Na2CO3、Na3PO4和Na2SO4幾種鹽與乙醇形成雙水相體系。結(jié)果表明，只有(NH4)2SO4、Na2CO3和Na2SO4可以與乙醇形成雙水相體系，但其對(duì)燈盞花乙素萃取率存在明顯差異。加入相同的鹽量，相比也存在差異。如圖1所示，從中可以看出(NH4)2SO4對(duì)燈盞花乙素的萃取效果最好，并且使用(NH4)2SO4時(shí)乙醇相比更接近1。因此，研究中選擇(NH4)2SO4作為分相鹽。

圖1 鹽種類對(duì)萃取率的影響Fig.1 Effect of the types of salt on extraction efficiency of scutellarin

2.2.2 (NH4)2SO4含量對(duì)燈盞花乙素萃取率的影響 乙醇加入量為1.5 mL，保持其他實(shí)驗(yàn)條件不變，分別考察鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5 %、8 %、10 %、15 %、20 %、25 %和30 %時(shí)對(duì)萃取率的影響。如圖2所示，在鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于8 %時(shí)，溶液無(wú)法形成雙水相，當(dāng)鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于8 %時(shí)，隨著鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，萃取率逐漸增加，當(dāng)(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25 %時(shí)萃取率最高為93.4 %。故研究中，確定(NH4)2SO4最優(yōu)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25 %。

2.2.3 乙醇用量對(duì)燈盞花乙素萃取率的影響 分別考察了不同量的乙醇(0.5，1，1.5，2，2.5和3 mL)對(duì)燈盞花乙素萃取率的影響。由圖3可見(jiàn)，當(dāng)乙醇的用量為0.5、1 和1.5 mL時(shí)，萃取率即能達(dá)到90 %以上，此時(shí)相比Rv均較接近于1。當(dāng)乙醇用量逐漸增加時(shí)，萃取率反而有所下降，究其原因是，在鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)一定時(shí)，部分乙醇溶解于鹽相之中，導(dǎo)致未達(dá)最優(yōu)相比，萃取率降低?？紤]到乙醇量較小時(shí)所使用鹽的量較大，故選擇1.5 mL即為最優(yōu)的乙醇用量。

圖2 (NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)萃取率的影響Fig.2 Effect of (NH4)2SO4 mass fraction on extraction efficiency of scutellarin

圖3 乙醇用量對(duì)萃取率的影響Fig.3 Effect of the volume of ethanol on extraction efficiency of scutellarin

2.2.4 pH對(duì)燈盞花乙素萃取率的影響 在保持乙醇的用量為1.5 mL和鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25 %的條件下，調(diào)節(jié)體系的pH值在3～9，如圖4所示。pH值為3～6時(shí)，燈盞花乙素的萃取率逐漸升高，pH值為6時(shí)，萃取率最高為94.3 %。當(dāng)pH值大于7時(shí)，燈盞花乙素的萃取率較低。究其原因燈盞花乙素在弱酸性條件下呈分子狀態(tài)，極性較小，在乙醇中的分配比更大。當(dāng)溶液pH值較低時(shí)燈盞花乙素上的羰基會(huì)被質(zhì)子化，pH值較高時(shí)氫離子又會(huì)被電離，都會(huì)形成極性較大的分子，分配比較低[14-15]。故選擇pH=6.0為最優(yōu)條件。

2.3 樣品分析

2.3.1 線性范圍 取適量燈盞花乙素對(duì)照品，加入甲醇溶解，使?jié)舛葹?.2 mg/mL，即得對(duì)照品儲(chǔ)備液。取對(duì)照品溶液，分別稀釋至0.1，0.075，0.050，0.020，0.010 和0.005 mg/mL，按照上述相同的色譜條件進(jìn)樣，以峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，即得回歸方程：Y=27.15X-194.36，r=0.9989，線性范圍：0.005～0.1 mg/mL。

2.3.2 樣品測(cè)定 在已優(yōu)化的雙水相萃取條件下，采用本方法萃取燈盞花粗提液中的燈盞花乙素，然后進(jìn)HPLC 檢測(cè)燈盞花乙素含量，色譜圖如圖5所示，結(jié)果見(jiàn)表1。試驗(yàn)中對(duì)燈盞花粗提液進(jìn)行2個(gè)水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)(n=6)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。

由色譜圖可見(jiàn)，經(jīng)雙水相萃取之后，可以進(jìn)一步降低燈盞花中其它雜質(zhì)的干擾，燈盞花乙素的色譜峰峰型也變的更好，與相近峰的干擾也較小。究其原因是乙醇-鹽雙水相體系能顯著去除粗提液中極性物質(zhì)分子和大分子雜質(zhì)的干擾，在一定程度上純化燈盞花乙素。由表1和圖6可知，經(jīng)過(guò)雙水相萃取之后，燈盞花中燈盞花乙素已經(jīng)被富集到乙醇相中，該方法萃取率達(dá)到94.2 %，并且雙水相體系萃取后的檢測(cè)結(jié)果為2.46 %，與2015版藥典檢測(cè)結(jié)果燈盞花乙素含量2.43 %更為接近。從表2可知，該方法準(zhǔn)確性較好，能有效分離富集燈盞花粗提液中的燈盞花乙素，完全滿足對(duì)燈盞花樣品中燈盞花乙素含量的測(cè)定。

圖4 pH對(duì)萃取率的影響Fig.4 Effect of pH on extraction efficiency of scutellarin

表1 粗提液樣品檢測(cè)結(jié)果

表2 粗提液中燈盞花乙素的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

3 討 論

在前人研究中，多使用95 %乙醇或三氯甲烷作為提取液[7]，回流提取燈盞花乙素，然后提取液經(jīng)過(guò)旋蒸等方法濃縮，甲醇定容后進(jìn)行分析。也有通過(guò)大量甲醇超聲提取燈盞花乙素，進(jìn)行檢測(cè)[16]。該方法使用甲醇提取之后，通過(guò)雙水相方法富集提取液，簡(jiǎn)單快速、準(zhǔn)確性高，并且所使用的雙水相體系綠色環(huán)保、易于放大研究。本研究以乙醇與(NH4)2SO4制備雙水相體系，利用雙水相萃取提取燈盞花乙素粗提液中的燈盞花乙素，并最終對(duì)燈盞花乙素含量進(jìn)行測(cè)定，研究表明雙水相體系具有良好的凈化性能，能有效降低燈盞花提取液中的大分子物質(zhì)和極性分子的干擾。研究結(jié)果為燈盞花中燈盞花乙素的提取、含量測(cè)定提供了一種綠色環(huán)保、簡(jiǎn)單有效的方法。

A：雙水相萃取樣品；B：燈盞花粗提液 A: The sample after ATPS; B: Breviscapus crude extract圖5 燈盞花粗提液與雙水相萃取液的HPLC圖譜Fig.5 HPLC analysis of breviscapus crude extract and the sample after ATPS

圖6 雙水相萃取燈盞花粗提液效果Fig.6 Effect of extracting the scutellarin from crude extract by ATPS

4 結(jié) 論

對(duì)燈盞花樣品進(jìn)行的檢測(cè)和加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)表明，采用乙醇與(NH4)2SO4雙水相體系，且(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25 %，乙醇用量為1.5 mL，pH 6.0時(shí)，萃取燈盞花乙素粗提液中燈盞花乙素，方法準(zhǔn)確性較高，結(jié)果可靠，且操作簡(jiǎn)單，綠色無(wú)污染；同時(shí)該雙水相體系具有很好的凈化性能，能顯著降低燈盞花中其它物質(zhì)的干擾。