高婭北，王廷賢，鄭小雨，白金瑩，周中宇，趙東方，趙貴斌，邱 坤,*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院,河南 鄭州 450002；2.福建省煙草公司南平市公司,福建 南平 353000；3.河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，河南 鄭州 450016；4.貴州省黔東南州煙草公司，貴州 凱里 556000)

【研究意義】煙葉保水力是活體煙葉對水分保持能力的固有屬性，其主要通過含氮類化合物與水分的結(jié)合緊密程度來實(shí)現(xiàn)的[1]，對烘烤過程中煙葉干燥具有重要作用。但烘烤過程中煙葉水分干燥主要包括水分遷移和葉表擴(kuò)散[2]，其中木質(zhì)素是煙葉水分輸導(dǎo)組織的主要組成部分，對提高煙葉葉內(nèi)水分遷移有效運(yùn)輸效率，協(xié)調(diào)煙葉水分散失等具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】木質(zhì)素可使木質(zhì)部細(xì)胞壁產(chǎn)生疏水性，從而提高植物葉片維管束的水分有效運(yùn)輸，使細(xì)胞不易脫水從而提高植物葉片的水分保持能力[3-4]，因此，植物葉片木質(zhì)素含量對植物葉片保水性有重要意義。目前，關(guān)于煙草木質(zhì)素的研究多集中在測定方法研究以及卷煙原料的含量調(diào)控等方面[5-6]，而葉片木質(zhì)素對植物葉片保水能力的影響在多種作物上已經(jīng)得到了廣泛研究：木質(zhì)素含量增加，玉米葉片的保水能力增強(qiáng)[7]；隨著蒙古扁桃葉片中合成木質(zhì)素的關(guān)鍵酶活性的增強(qiáng)，其葉片相對含水量也增大，保水能力提高[8]；將調(diào)控木質(zhì)素合成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子在擬南芥中過表達(dá)后，可明顯提高其葉片的保水能力[9]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】烤煙幼苗在干旱脅迫下，木質(zhì)素含量以及PAL、C4H、4CL、CAD酶活性會有明顯的上升趨勢從而調(diào)節(jié)其生命活動[10]，但目前關(guān)于成熟過程中的烤煙木質(zhì)素代謝以及保水性的研究尚缺乏系統(tǒng)的研究，且對于造成不同烤煙品種間煙葉木質(zhì)素含量差異的生理基礎(chǔ)尚不明確?！緮M解決的關(guān)鍵問題】因此，本研究以保水力不同的3個烤煙品種為試驗(yàn)材料，研究其中部葉木質(zhì)素含量及木質(zhì)素代謝關(guān)鍵酶活性、煙葉保水力和相對含水量的變化規(guī)律，探討木質(zhì)素含量變化與烤煙葉片保水性的關(guān)系，從而為烤煙品種選育以及優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計

于2017年在河南省洛陽市洛寧縣煙草科技示范基地進(jìn)行。采用漂浮育苗的方式進(jìn)行育苗，挑選生長整齊一致的壯苗移栽至盆中種植，行距120 cm，株距50 cm，每盆植煙1株。每盆裝土10 kg，供試土壤有機(jī)質(zhì)8.30 g/kg、全氮0.90 g/kg、速效氮65.12 mg/kg、速效磷24.22 mg/kg、速效鉀107.21 mg/kg，pH=7.81) 。每盆煙株N、P2O5、K2O的施入量分別為 0.12、0.12、0.36 g/kg，肥料分別在移栽當(dāng)天(移栽日期：2017年5月11日)、移栽后第1和2周分3次施入，肥量比例為2∶1∶1?，F(xiàn)蕾期打頂(日期：2017年7月16日)，每株留葉數(shù)均為18片葉，其他管理措施均按照優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程進(jìn)行，每個品種每次重復(fù)種植50盆。

供試烤煙品種參照林杰[11]、汪志威[12]和馬新蕾等[13]的研究進(jìn)行篩選，分別為K326(保水性強(qiáng))、秦?zé)?6(保水性中等)和中煙100(保水性較弱)。在打頂后0、10、20、30、40和50 d進(jìn)行取樣，每小區(qū)采集生長情況正常且一致的烤煙中部葉(10～12葉位)10片，一部分在采后立即放入液氮中速凍，于-70 ℃冰箱中進(jìn)行保存?zhèn)溆茫渌糜跓熑~保水力、相對含水量指標(biāo)的測定，測定重復(fù)3次。

1.2 木質(zhì)素含量測定方法

現(xiàn)將新鮮煙葉樣品采用采用真空冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥，將干燥后的樣品磨碎過60目篩，而后采用孔浩輝等[14]的NaOH/尿素低溫溶解法進(jìn)行煙葉木質(zhì)素含量的測定。

1.3 木質(zhì)素代謝相關(guān)酶活性測定方法

苯丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(PAL)活性采用張志良等[15]的方法進(jìn)行測定；肉桂酸4-羥化酶(C4H)活性采用Lamb等[16]的方法進(jìn)行測定；4-香豆酰CoA連接酶(4CL)活性采用陳曉光等[17]的方法進(jìn)行測定；香豆酸3-羥化酶(C3H)活性采用上海邦奕生物科技有限公司生產(chǎn)的酶聯(lián)免疫分析試劑盒進(jìn)行測定；肉桂醇脫氫酶(CAD)活性采用Morrison等[18]的方法進(jìn)行測定。

1.4 煙葉保水力和相對含水量的測定方法

煙葉保水力(WRC)采用符新妍等[19]的方法進(jìn)行測定；相對含水量(RWC)的測定先將煙葉表面水分用吸水紙吸干，而后稱取其鮮重D1，而后將煙葉浸泡至雙蒸水中直至其水分飽和，稱取其飽和鮮重D2，然后利用烘箱法將煙葉烘干至恒重，稱取其干重D3，根據(jù)公式RWC%=(D1-D3)/(D2-D3) ×100 %進(jìn)行計算[20]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用Microsoft Excel 2010進(jìn)行試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計，運(yùn)用Origin 2017進(jìn)行繪圖，運(yùn)用SPSS 22進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種烤煙生長過程中木質(zhì)素含量的變化

由圖1可見，各品種煙葉在煙株打頂后的生長發(fā)育過程中木質(zhì)素含量變化規(guī)律基本一致，都表現(xiàn)出先緩慢增加直至打頂后40 d煙葉木質(zhì)素含量達(dá)到其最大值，而后迅速降低至一較低水平的變化趨勢。其中，中煙100煙葉木質(zhì)素含量在打頂后各時期均小于其他兩品種，K326在打頂時煙葉木質(zhì)素含量低于秦?zé)?6，而后含量快速增加高于秦?zé)?6，在打頂30 d后，其煙葉木質(zhì)素含量降低幅度較大，在打頂后50 d時含量低于秦?zé)?6。

圖1 不同烤煙品種木質(zhì)素含量的變化Fig.1 Changes of lignin content in different flue-cured tobacco varieties

2.2 不同烤煙品種生長過程中保水力及相對含水量比較

由表1可見，各品種烤煙煙葉保水力隨生長發(fā)育時間的增加，呈現(xiàn)先增加后降低的變化規(guī)律，說明隨著煙葉成熟，其保水力也逐漸提高，而隨煙葉成熟期的延長其保水力又逐漸下降。各品種間煙葉保水力相比，表現(xiàn)為K326>秦?zé)?6>中煙100。其中，在打頂當(dāng)天和打頂后10 d K326保水力顯著高于中煙100，在打頂后30和50 d中煙100保水力顯著低于其他2品種，說明K326和秦?zé)?6相比中煙100煙葉保水力較強(qiáng)，葉片不易失水。

由表2可見，各品種烤煙煙葉相對含水量隨生長發(fā)育時間的增加，呈現(xiàn)先增加后降低的變化規(guī)律，說明煙葉相對含水量隨煙株逐漸成熟也逐漸提高，而煙葉過熟會使煙葉相對含水量降低。各品種間煙葉相對含水量相比，表現(xiàn)為K326>秦?zé)?6>中煙100。其中，在打頂當(dāng)天、打頂后10 d和打頂后40 d K326保水力顯著高于中煙100，在打頂后50 d中煙100保水力顯著低于其他兩品種，說明K326和秦?zé)?6相比中煙100煙葉相對含水量較高，其煙葉在生長發(fā)育期間的水分虧缺程度較低，在土壤水分供應(yīng)與其自身蒸騰作用平衡性較好，保水能力較高。

因此，在打頂后各品種煙葉保水力及相對含水量與木質(zhì)素含量的變化規(guī)律相一致，表明烤煙葉片木質(zhì)素含量高，其保水能力強(qiáng)。

2.3 不同品種烤煙生長過程中木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶活性的變化

由圖2A可見，隨烤煙生長發(fā)育進(jìn)程，各品種烤煙煙葉的PAL活性呈先增加后降低的變化趨勢，在打頂后40 d各品種煙葉PAL活性達(dá)到最高值。其中，中煙100和秦?zé)?6在達(dá)到活性最高值之前都呈現(xiàn)出緩慢上升的變化規(guī)律，而K326在此期間變化幅度較大，在打頂10 d后PAL活性迅速升高，明顯高于其他兩品種；在打頂40 d后，秦?zé)?6和K326煙葉PAL活性迅速降低，而中煙100活性變化不明顯?？梢娫诖蝽敽鬅熑~生長發(fā)育過程中除個別時期，各品種間PAL活性基本表現(xiàn)為K326>秦?zé)?6>中煙100，表明保水能力強(qiáng)的烤煙品種其煙葉PAL活性強(qiáng)且活性反應(yīng)迅速，有利于木質(zhì)素的合成并為其合成提供保障。

表1 不同烤煙品種生長過程中保水力的變化

注：同一行檢測指標(biāo)不同字母表示在0.05水平上存在顯著差異，下同。

Note: Different letters of the same line indicate significant differences at the 0.05 level. The same as below.

表2 不同烤煙品種生長過程中相對含水量的變化

圖2 不同烤煙品種木質(zhì)素合成相關(guān)酶活性變化Fig.2 Changes of lignin synthesis-related enzyme activities in different flue-cured tobacco varieties

由圖2B可見，各品種煙葉C4H活性在生長發(fā)育過程中變化趨勢保持一致，都呈現(xiàn)出在打頂后活性先降低，在打頂后10 d開始增加直至打頂后30 d活性達(dá)到最大值，而后活性迅速下降的變化規(guī)律，其中在生長發(fā)育過程中的各個時期各品種間C4H活性均表現(xiàn)為K326>秦?zé)?6>中煙100，說明保水能力強(qiáng)的烤煙品種C4H活性較高，對木質(zhì)素的合成有利。

由圖2C可見，各品種煙葉4CL活性在生長發(fā)育過程中總體呈現(xiàn)出先降低后升高再降低的變化規(guī)律。其中中煙100在各時期活性均低于其他兩品種；而秦?zé)?6和K326在打頂后20 d之前活性差別不大，隨后K326活性在打頂后30 d達(dá)到最大值且高于秦?zé)?6，然后活性降低；秦?zé)?6在打頂10 d后4CL活性一直緩慢升高直至打頂后40 d達(dá)到最大值，此時活性高于其他兩品種，隨后降低。因此在煙葉成熟(打頂后30 d)前，各品種煙葉4CL活性表現(xiàn)為K326>秦?zé)?6>中煙100，成熟后表現(xiàn)為秦?zé)?6>K326>中煙100這可能與4CL的催化產(chǎn)物進(jìn)入其他次生物質(zhì)代謝途徑有關(guān)。

由圖2D可見，各品種煙葉C3H活性在生長發(fā)育過程中總體呈現(xiàn)先逐漸降低直至打頂后30 d達(dá)到最低值而后升高的變化規(guī)律，在煙葉成熟期后各品種活性趨于一致，這可能與其在煙葉的生長發(fā)育過程中參與到多種次生物質(zhì)的代謝有關(guān)。其中，中煙100和秦?zé)?6煙葉C3H活性變化趨勢較為一致，而K326在打頂后20 d內(nèi)C3H活性下降較慢之后活性迅速降低，因此在打頂后10～20 d各品種煙葉C3H活性表現(xiàn)為K326>秦?zé)?6>中煙100，除此之外基本表現(xiàn)為秦?zé)?6> K326 >中煙100，說明煙葉在成熟以前，保水能力強(qiáng)的品種C3H活性也較高，且變化波動較不明顯，有利于木質(zhì)素合成。

由圖2E可見，各品種煙葉CAD活性在生長發(fā)育過程中總體呈現(xiàn)先升高至打頂后30 d達(dá)到最大值而后降低的變化規(guī)律，其中在打頂后各品種煙葉CAD活性略有降低可能是由于打頂對煙葉內(nèi)生理生化變化造成一定影響引起的。各品種間相比，中煙100在發(fā)育過程中各時期活性均低于其他兩品種，且變化幅度較??；K326在打頂后20 d內(nèi)活性均略低于秦?zé)?6，但在成熟期活性迅速增強(qiáng)高于秦?zé)?6，說明保水能力強(qiáng)的烤煙品種CAD對環(huán)境條件較為敏感且酶活性強(qiáng)應(yīng)答速度較快，有利于木質(zhì)素的合成以應(yīng)對環(huán)境條件變化。

表3 烤煙葉片木質(zhì)素含量及相關(guān)酶活性與耐旱能力相關(guān)分析

注：*表示5 %水平差異顯著，**表示1 %水平差異顯著。

2.4 烤煙木質(zhì)素含量及相關(guān)酶活性與保水能力相關(guān)分析

由表3分析表明，烤煙中部葉木質(zhì)素含量與煙葉保水力和相對含水率呈顯著正相關(guān)。表明煙葉木質(zhì)素含量與煙葉保水能力密切相關(guān)，木質(zhì)素含量高，煙葉保水能力強(qiáng)。木質(zhì)素含量分別與PAL、C4H和CAD活性呈顯著正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)分別為0.78、0.81和0.77)；與4CL、C3H活性相關(guān)不顯著。表明煙葉PAL、C4H和CAD活性的提高是木質(zhì)素含量增加的酶學(xué)基礎(chǔ)。

2.5 PAL、C4H、4CL、C3H、CAD活性與木質(zhì)素含量的回歸分析

為明確影響烤煙中部葉木質(zhì)素含量的關(guān)鍵酶及其差別，綜合烤煙中部葉的PAL(x1)、C4H(x2)、4CL(x3)、C3H(x4)和CAD(x5)活性對木質(zhì)素含量建立回歸方程y=0.614x1+0.374x2-0.6x3+0.457x4+0.658x5(R2=0.666)。表明5種木質(zhì)素合成相關(guān)酶類與烤煙中部葉木質(zhì)素含量之間存在線性關(guān)系，各酶類對木質(zhì)素含量的影響為CAD>PAL>4CL> C3H>C4H。表明烤煙中部葉的木質(zhì)素合成受CAD和PAL活性的影響最大。

3 討 論

3.1 煙葉木質(zhì)素含量與其保水能力的關(guān)系

木質(zhì)素與纖維素和其他糖類結(jié)合在一起，作為細(xì)胞壁的填充物質(zhì)，可強(qiáng)化植物葉片細(xì)胞壁，其含量與植物在不同環(huán)境條件下的水分散失情況密切相關(guān)[21]。在水分供應(yīng)不足時，植物木質(zhì)素含量迅速升高以應(yīng)對不利的環(huán)境條件，隨著植物木質(zhì)化程度加深，細(xì)胞壁增厚，其內(nèi)部組織水分散失受到限制，保水能力提高以保證植物的正常生長[22]。徐宇強(qiáng)等[23]認(rèn)為葉片木質(zhì)素含量高的玉米品種，其保水能力較強(qiáng)，在土壤缺水情況下可維持其正常的生理活動。本研究結(jié)果表明，與中煙100相比，秦?zé)?6和K326的煙葉保水力強(qiáng)、相對含水量高，保持葉片水分平衡的能力強(qiáng)，其中部葉木質(zhì)素含量在煙株生長發(fā)育過程中始終保持較高的水平，尤其在打頂后的煙葉質(zhì)量形成的重要階段木質(zhì)素含量迅速積累。相關(guān)分析表明，煙葉木質(zhì)素含量與煙葉保水力和相對含水量呈顯著正相關(guān)(R=0.76、0.86，P<0.05)。說明保水能力強(qiáng)的品種在打頂后煙葉成熟期木質(zhì)素含量提高快，木質(zhì)素含量高。由此推斷，煙葉木質(zhì)素含量可作為衡量烤煙保水能力高低的一個評價指標(biāo)。

3.2 木質(zhì)素合成相關(guān)酶活性與烤煙保水能力的關(guān)系

PAL是木質(zhì)素合成時苯丙氨酸合成途徑中的第一個酶[24]，下一步C4H控制肉桂酸向香豆酸的轉(zhuǎn)化[25]，隨后4CL催化羥基肉桂酰輔酶A脂的合成[26]，最后CAD催化肉桂醇的衍生物向其對應(yīng)的醇轉(zhuǎn)化[27]，這些酶都是煙草及多種植物木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶，在植物的抗性形成中發(fā)揮重要作用[28]。研究表明，PAL活性降低時，植物葉片木質(zhì)素含量也降低，而當(dāng)其活性增強(qiáng)時，植物葉片木質(zhì)素含量明顯增加[29]。本研究結(jié)果表明，烤煙葉片木質(zhì)素含量及相對含水量與PAL活性呈顯著正相關(guān)，PAL活性增強(qiáng)，烤煙葉片木質(zhì)素含量增加；與中煙100相比，秦?zé)?6和K326中部葉PAL酶活性較高?？梢?，PAL活性與烤煙保水能力密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，保水力強(qiáng)的品種其C4H活性高，說明C4H活性在一定程度上也可以反映烤煙的保水能力。CAD是合成木質(zhì)素的最后一步反應(yīng)的關(guān)鍵限速酶[30]。本研究表明，煙葉CAD活性與葉片木質(zhì)素含量呈顯著正相關(guān)與相對含水量呈極顯著正相關(guān)，說明CAD活性也能在一定程度上反映出烤煙的保水能力高低。

5種酶活性與木質(zhì)素含量的回歸分析表明，烤煙中部葉的PAL和CAD活性是影響煙葉木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶。煙葉具有較強(qiáng)的PAL和CAD活性是烤煙保水能力強(qiáng)的原因之一。

4 結(jié) 論

K326和秦?zé)?6煙葉葉片保水力和相對含水量較高，其煙葉內(nèi)木質(zhì)素含量也相對較高，保持葉片中的水分動態(tài)平衡能力較強(qiáng)。煙葉木質(zhì)素含量高低可以作為評判烤煙品種保水能力強(qiáng)弱的一個指標(biāo)。較強(qiáng)的PAL和CAD活性是煙株保水能力增強(qiáng)的重要原因之一。