薛巨坤，王 博，王蓮萍，楊春雨，國會艷，郝愛平

(牡丹江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 黑龍江 牡丹江 157011)

【研究意義】miRNA(microRNA)由美國科學(xué)家Lee在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)，隨著功能研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)miRNA幾乎參與了生物體中各種重要的生理、生化過程,在調(diào)控基因表達方面起著關(guān)鍵的作用，此后miRNA得到廣泛的關(guān)注[1]。miRNA是一類長度為19～24 nt的非編碼小分子RNA，其作為一種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子在真核生物的基因表達調(diào)控中有著非常重要的作用。miRNA在轉(zhuǎn)錄后水平通過與mRNAs的序列互補識別靶基因，并引起miRNA靶基因的降解或抑制其翻譯，最終達到抑制特定基因表達的目的[2]。植物生長發(fā)育由一系列蛋白和植物激素決定，而這些蛋白的表達水平直接或間接受miRNA調(diào)控，縱觀近幾年研究成果，植物miRNA越來越受到研究者的青睞，特別是發(fā)現(xiàn)植物 miRNA可以進入人體血液和組織器官以后，對植物 miRNA研究顯得尤為重要[3]。像其他信號分子一樣，植物miRNA也可以通過血管系統(tǒng)從一個組織移動到另一個組織，這些移動的miRNA可能在植物營養(yǎng)平衡和應(yīng)對環(huán)境的生物和非生物脅迫具有重要作用[4]。植物中miRNA還具有很多功能，包括對器官與組織的生長發(fā)育、細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)、在逆境的非生物脅迫中起關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用以及在干旱、寒冷、鹽漬化土壤、病蟲害等環(huán)境下進行自我調(diào)控，使植物對惡劣環(huán)境下做出應(yīng)答[5]。此外miRNA在植物中所介導(dǎo)的RNA干擾方法可能有助于開發(fā)轉(zhuǎn)基因作物，通過賦予生物(病原體)抗性以及非生物脅迫反應(yīng)更好地改善作物的品質(zhì)[6]?！厩叭搜芯窟M展】近年來研究人員發(fā)現(xiàn)，與植物發(fā)育及脅迫調(diào)控相關(guān)的miRNA包括miR156、miR164、miR169、miR396、miR398、miR319等，其中miR319是目前研究比較透徹的與植物發(fā)育相關(guān)miRNA代表之一。miR319與植物葉、花器官的生長發(fā)育密切相關(guān)，并且參與調(diào)控部分植物激素載體蛋白，從而調(diào)控部分植物激素合成以及重要信號傳導(dǎo)通路[7]。TCP轉(zhuǎn)錄因子是miR319的靶基因，其基因家族的命名是來自最初確定的不同植物的4個基因：金魚草中的CYC(CYCLO-IDEA)基因，玉米中的TB1(TEOSINTE BRANCHED 1)基因，水稻中的PCF1和PCF2基因[8]。有研究表明過表達miR319番茄植株生長緩慢，植株矮小，葉片的表皮毛密度顯著増大，花器官變小且花粉飽滿度下降[9]。在大白菜中，球形為柱形的大白菜與低水平表達BrpTCP4-1有關(guān)，球形為圓形的大白菜與高水平BrpTCP4-1有關(guān)，而miR319通過控制BrpTCP4-1基因表達水平來控制大頭菜頭部形狀[10]。在擬南芥中，TCP4可以通過控制miR396、ICK1來激活或抑制細胞增殖，當(dāng)TCP4水平增加時會使擬南芥葉片變小，而miR319會直接定量控制TCP4從而調(diào)節(jié)植物葉片的大小[11]。還有研究表明：miR319通過調(diào)控擬南芥光形態(tài)建成過程中的負調(diào)控因子TCP的表達影響其下胚軸的發(fā)育。TCP2、TCP3、TCP4、TCP10和TCP24是miR319的靶基因，異位表達的TCP2、TCP3、TCP4和過表達的miR319會導(dǎo)致擬南芥的表型變?yōu)檩p度光敏感型，因此miR319是擬南芥下胚軸生長的負調(diào)節(jié)劑[12]。此外，miR319對植物脅迫具有抗性。酸性土壤作物損失的主要原因是鋁(Al)的毒性，miR319可通過調(diào)節(jié)亞麻植物的生長和發(fā)育過程從而在Al脅迫反應(yīng)中起重要作用。有研究表明：亞麻幼苗在pH 4.5下浸泡在含AlCl3的溶液，經(jīng)過24 h后發(fā)現(xiàn)其miR319表達水平明顯下降，說明miR319參與植物脅迫調(diào)控過程，其潛在靶標是TCP基因[13]。水稻是重要的糧食和經(jīng)濟作物，其生產(chǎn)經(jīng)常受到冷脅迫的影響，冷脅迫嚴重抑制水稻幼苗的生長，最終導(dǎo)致不均勻成熟。水稻miR319基因家族由2個成員Osa-miR319ba和Osa-miR319bc組成。有研究表明：Osa-miR319bc的表達下降受冷應(yīng)激的控制，相反過表達的Osa-miR319bc導(dǎo)致水稻對冷應(yīng)激的耐受性增強，如水稻的葉片更寬，有較高的存活率和脯氨酸含量。OsPCF6和OsTCP21可能是Osa-miR319bc靶向基因，研究表明Osa-miR319bc可能是通過靶向OsPCF6和OsTCP21在植物對冷應(yīng)激反應(yīng)起的重要作用[14]。miR319還控制植物對干旱和鹽度脅迫的反應(yīng)。研究表明在鹽脅迫下(200 mM NaCl)正常水稻在處理16 d后觀察到嚴重的組織損傷，而Osa-miR319ba轉(zhuǎn)基因水稻的損傷不明顯；在去除脅迫后，Osa-miR319ba轉(zhuǎn)基因植株繼續(xù)生長，而對照植物中只有幾個分蘗存活，這說明miR319過表達可以提高水稻抗鹽性[15]。茉莉酸作為系統(tǒng)性信號分子對番茄根結(jié)線蟲病有效，可以減少線蟲入侵的根結(jié)數(shù)。此外，有研究人員發(fā)現(xiàn)番茄植株被根結(jié)線蟲侵染后，其葉和莖組織中的TCP和控制茉莉酸合成的掛件基因上調(diào)表達，而miR319下調(diào)表達，這說明miR319bc參與植物防御害蟲的調(diào)控過程[16]。以上研究表明miR319對植物的生長發(fā)育和植物抗病、抗寒等抗逆的機制起重要的調(diào)控作用?！颈狙芯壳腥朦c】本文釆用生物信息學(xué)法對miR319基因家族成員進行同源性分析和靶基因預(yù)測?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為研究miR319靶基因的功能和相關(guān)生理作用機制提供了重要的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 miR319基因家族成員序列檢索

從miRBase數(shù)據(jù)庫(http://www.miRbase.org/index.shtml)中下載miR319基因家族的全部成員的成熟序列并進行分析。

1.2 miR319基因家族成員的多序列比對

利用在線工具Clustalw(http://www.genome.jp/tools/clustalw/)對miR319基因家族的成熟序列進行多序列比對并分析。

1.3 miR319基因家族成員系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建

利用MEGA5.1軟件以鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)對miR319基因家族成員的成熟序列生成系統(tǒng)進化樹。

1.4 miR319的靶基因預(yù)測

利用psRNATarget(http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/)、BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)2種在線數(shù)據(jù)庫對miR319的靶基因進行預(yù)測。將玉米、水稻、大豆的miR319序列通過psRNATarget數(shù)據(jù)庫中預(yù)測出相應(yīng)的靶基因名稱及靶基因序列，獲得的靶基因序列通過NCBI的BLAST預(yù)測其靶基因的功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 miR319基因家族分析

釆用生物信息學(xué)的方法，從miRBase數(shù)據(jù)庫中檢索所有物種miR319的成熟序列，結(jié)果見表1。由表1可知：36種植物中存在miR319，miR319在不同植物中拷貝數(shù)差異較大，其中大豆的miR319序列最多，為17條；其次為毛果楊，其miR319有9條；木薯的miR319有8條；小立碗蘚、葡萄、無油樟的miR319為5條；蒺藜狀苜蓿、玉米、蓖麻、琴葉擬南芥、香瓜的miR319均為4條；番茄、擬南芥、蘋果、馬鈴薯的miR319均為3條；高粱、二穗短柄草、水稻、豇豆、亞麻、煙草、水蜜桃的miR319均為2條；其余物種的miR319均為1條。

基因定位表明，大部分miR319基因分散在不同的染色體上，也有少部分分散在同一條染色體上，如zma-miR319a-3p、zma-miR319b-3p和zma-miR319c-3p、zma-miR319d兩組基因分別定位在玉米的3號、8號染色體上；sbi-miR319a、sbi-miR319bc都定位在高粱的3號染色體上；mtr-miR319a-3p、mtr-miR319b-3p都定位在蒺藜狀苜蓿的5號染色體上；osa-miR319a-3p、osa-miR319bc都定位在水稻的1號染色體上；gma-miR319g、gma-miIR319h都定位在大豆的2號染色體上，gma-miR319o、gma-miR319p都定位在大豆的6號染色體上，gma-miR319j、gma-miR319k都定位在大豆的11號染色體上。其余miR319所有成員只在一種染色體上。此外其余22個物種的基因無法定位。

表1 36個模式物種中miR319的成熟序列

續(xù)表1 Continued table 1

物種SpeciesmiRNA名稱Name of miRNA成熟序列Maturesequence基因定位Genelocation+/-gma-miR319jUUGGACUGAAGGGAGCUCCCUchr11:1374020-1374198+gma-miR319kUUGGACUGAAGGGAGCUCCCUchr11:32902062-32902247+gma-miR319lUUGGACUGAAGGGAGCUCCUUCchr17:9436178-9436279-gma-miR319mUUGGACUGAAGGGAGCUCCCUchr18:4278883-4279072-gma-miR319nUUUGGACCGAAGGGAGCCCCUchr13:27068589-27068684-gma-miR319oUGGACUGAAGGGGAGCUCCUUCchr6:11433545-11433739-gma-miR319pUUUUGGACUGAAGGGAGCUCCchr6:22581697-22581775+gma-miR319qUGGACUGAAGGGAGCUCCUUC未知未知玉米zma-miR319a-3pUUGGACUGAAGGGUGCUCCCchr3:212116898-212117106+Zea mayszma-miR319b-3pUUGGACUGAAGGGUGCUCCCchr3:2801942-2802154+zma-miR319c-3pUUGGACUGAAGGGUGCUCCCchr8:148277363-148277578-zma-miR319dUUGGACUGAAGGGUGCUCCCchr8:26767956-26768167-毛果楊ptc-miR319baUUGGACUGAAGGGAGCUCCCscaffold_1:7887933-7888120-Populus trichocarpaptc-miR319bcUUGGACUGAAGGGAGCUCCCscaffold_3:13875330-13875514+ptc-miR319cUUGGACUGAAGGGAGCUCCCscaffold_13:15551280-15551475+ptc-miR319dUUGGACUGAAGGGAGCUCCCscaffold_19:15846565-15846757+ptc-miR319eUUGGACUGAAGGGAGCUCCUscaffold_12: 4980083-4980274-ptc-miR319fUUGGACUGAAGGGAGCUCCUscaffold_13: 8843265-8843466+ptc-miR319gUUGGACUGAAGGGAGCUCCUscaffold_19:10665338-10665541+ptc-miR319hUUGGACUGAAGGGAGCUCCUscaffold_15: 7395415-7395609+ptc-miR319iUUGGGCUGAAGGGAGCUCCCscaffold_6: 24889057-24889145+小立碗蘚ppt-miR319baCUUGGACUGAAGGGAGCUCCscaffold_19:89704-89872+Physcomitrella patensppt-miR319bcCUUGGACUGAAGGGAGCUCCscaffold_234: 55730-55889-ppt-miR319cCUUGGACUGAAGGGAGCUCCCscaffold_29: 1728494-1728682-ppt-miR319d-3pCUUGGACUGAAGGGAGCUCCCscaffold_266: 191734-191903+ppt-miR319eCUUGGACUGAAGGGAGCUCCCscaffold_99: 433971-434144+江南卷柏Selaginella moellendorffiismo-miR319UGCUGCCGACUCAUGCAUCC未知未知葡萄vvi-miR319bcUUGGACUGAAGGGAGCUCCCUchr1:4189562-4189755+Vitis viniferavvi-miR319cUUGGACUGAAGGGAGCUCCCUchr2:855561-855742-vvi-miR319eUUUGGACUGAAGGGAGCUCCUchr11:4317224-4317330+vvi-miR319fUUGGACUGAAGGGAGCUCCCUchr6:9137255-9137447+vvi-miR319gUUGGACUGAAGGGAGCUCCCAchr17:3675978-3676199-菜豆Phaseolus vulgarispvu-miR319cUUGGACUGAAGGGAGCUCCUU未知未知藍花耬斗菜Aquilegia caeruleaaqc-miR319UUGGACUGAAGGGAGCUCCCU未知未知枳Citrustrifoliatactr-miR319UUGGACUGAAGGGAGCUCCC未知未知蓖麻rco-miR319baUUGGACUGAAGGGAGCUCCCU30190:3280054-3280264-Ricinus communisrco-miR319bcUUGGACUGAAGGGAGCUCCCU29932:22062-22240+rco-miR319cUUGGACUGAAGGGAGCUCCCU28606:5923-6110-rco-miR319dUUGGACUGAAGGGAGCUCCUU28207:60971-61157+琴葉擬南芥aly-miR319a-5pAGAGCUUCCUUGAGUCCAUUCGL348719.1:7941288-7941508-Arabidopsis lyrataaly-miR319b-3pUUGGACUGAAGGGAGCUCCCUGL348719.1:21388787-21389032+aly-miR319c-3pUUGGACUGAAGGGAGCUCCUUGL348716.1: 19899133-19899403+

續(xù)表1 Continued table 1

物種SpeciesmiRNA名稱Name of miRNA成熟序列Maturesequence基因定位Genelocation+/-aly-miR319d-3pUUGGACUGAAGGGAGCUCCUUGL348716.1: 18166558-18166824+小麥Triticum aestivumtae-miR319UUGGACUGAAGGGAGCUCCCU未知未知甜橙Citrus sinensiscsi-miR319UUUGGACUGAAGGGAGCUCCU未知未知可可Theobroma cacaotcc-miR319UUUGGACUGAAGGGAGCUCCU未知未知大葉相思Acacia auriculiformisaau-miR319UUGGACUGAAGGGAGCUCCCU未知未知豇豆Vigna unguiculatavun-miR319baUUGGACUGAAGGGAGCUCCCU未知未知vun-miR319bcCUUGGACUGAAGGGAGCUCCU未知未知刺苞菜薊Cynar acardunculuscca-miR319UUGGACUGAAGGGAGCUCCCU未知未知亞麻lus-miR319baUUGGACUGAAGGGAGCUCCCU未知未知Linum usitatissimumlus-miR319bcUUGGACUGAAGGGAGCUCCC未知未知煙草nta-miR319baUUGGACUGAAGGGAGCUCCCU未知未知Nicotiana tabacumnta-miR319bcUUGGACUGAAGGGAGCUCCCU未知未知水蜜桃Prunus persicappe-miR319baUUGGACUGAAGGGAGCUCCCKB639086.1:17220683-17220922+ppe-miR319bcUAGCUGCCGAGUCAUUCAUCCAKB639086.1: 11602985-11603085-橡膠樹Hevea brasiliensishbr-miR319UUGGACUGAAGGGAGCUCCCUKB629150.1:30162-30382+蘋果mdm-miR319baUUGGACUGAAGGGAGCUCCCUchr14:17485432-17485626+Malus domesticamdm-miR319bcUUGGACUGAAGGGAGCUCCCU未知未知mdm-miR319cAUCCAACGAAGCAGGAGCUGA未知未知香瓜cme-miR319baUUGGACUGAAGGGAGCUCCC未知未知Cucumis melocme-miR319bcUUGGACUGAAGGGAGCUCCC未知未知cme-miR319cUUGGACUGAAGGGAGCUCCU未知未知cme-miR319dUUGGACUGAAGGGAGCUCCU未知未知木薯mes-miR319baUUGGACUGAAGGGAGCUCCCUscaffold10493:48255-48431-Manihot esculentames-miR319bcUUGGACUGAAGGGAGCUCCCUscaffold10122: 61588-61763+mes-miR319cUUGGACUGAAGGGAGCUCCCUscaffold06557:7971-8204+mes-miR319dUUGGACUGAAGGGAGCUCCCUscaffold03429: 24109-24350+mes-miR319eUUGGACUGAAGGGAGCUCCCUscaffold03264: 101781-101954-mes-miR319fUUGGACUGAAGGGAGCUCCUUscaffold06446: 168758-168933-mes-miR319gUUGGACUGAAGGGAGCUCCUUscaffold03454: 69872-70096-mes-miR319hCUUGGACUGAAGGGAGCUCCUscaffold02877: 33218-33397-馬鈴薯stu-miR319UUGGACUGAAGGGUUCCCUUCJH137816.1:1868464-1868640+Solanum tuberosumstu-miR319a-3pUUGGACUGAAGGGAGCUCCCUJH137840.1: 1381096-1381267+stu-miR319bcUUGGACUGAAGGGAGCUCCUJH137816.1: 2292041-2292213-番木瓜Carica papayacpa-miR319AUUGGACUGAAGGGAGCUCC未知未知無油樟atr-miR319baUUGGACUGAAGGGAGCUCCCscaffold00077:2616711-2616892+Amborella trichopodaatr-miR319bcUUUGGACUGAAGGGAGCUCCUscaffold00081: 2902538-2902653+atr-miR319cUUGGACUGAAGGGAGCUCCCscaffold00105: 1160459-1160636+atr-miR319dUUUGGACUGAAGGGAGCUCCUscaffold00188: 77604-77748-atr-miR319eUUUGGACUGAAGGGAGCUCCUscaffold00188: 92741-92885-蕪菁Brassica rapabra-miR319-3pUUGGACUGAAGGGAGCUCCCUchrA1:7428122-7428320+山羊草Aegilops tauschiiata-miR319-3pACUGGAUGACGCGGGAGCUAAKD515090.1:6407-6597+

2.2 miR319基因家族成員的多序列比對及保守位點分析

利用在線工具Clustal w對miR319家族進行成熟序列的比對，結(jié)果見圖1。由圖1可知：36個物種中miR319成熟序列的相似度較高，保守序列為“UUGGACUGAAGGG”。堿基方面，玉米的第183位堿基由A變成了U；高粱的第204位堿基由A變成了U；馬鈴薯的第165位堿基由A變成了U，第166位堿基由G變成了U，第168堿基由U變成了C，這可能由于進化過程中的基因突變問題導(dǎo)致。位置方面，可可、甜橙的miR319堿基位置均勻分布在90～120位；木薯、煙草、亞麻、擬南芥、葡萄、藍花耬斗菜、枳、香瓜、無油樟、毛果楊、大豆、馬鈴薯這12個物種中的miR319堿基位置均勻分布在150～180位；蘋果、刺苞菜薊、豇豆、大葉相思、玉米的miR319堿基位置均勻分布在180～200位；橡膠樹、蓖麻、小麥、水蜜桃、高粱、番木瓜、火炬松的miR319堿基位置均勻分布在200～230位；蕪菁、蒺藜狀苜蓿的miR319堿基位置均勻分布在20～50位；菜豆的位置分布差異與其他物種差異較大，其miR319堿基位置分布在410～430位。以上結(jié)果表明，miR319在不同物種間具有高度的保守性，保守區(qū)位置分布差異較大。

圖1 miR319基因家族成員成熟序列的比對結(jié)果Fig.1 Multiple alignment result of the mature sequence in miR319 gene family members

圖2 基于NJ法構(gòu)建的miR319基因家族系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of the miR319 gene family based on the NJ method

2.3 miR319基因家族成員系統(tǒng)進化樹分析

利用MEGA5.1軟件采用鄰接法對miR319基因家族成員構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，進行分子進化規(guī)律的研究，結(jié)果見圖2。由圖2可知：miR319基因家族的成員呈現(xiàn)為4個大的分支。琴葉擬南芥aly-miR319a-5p、蒺藜狀苜蓿mtr-miR319d-5p、二穗短柄草bdi-miR319ba分為一支；水蜜桃ppe-miR319bc和江南卷柏smo-miR319分為一支；山羊草ata-miR319-3p、水稻osa-miR319a-3p、蘋果mdm-miR319c分為一支；其余基因均在同一分支。其中，除水稻osa-miR319a-3p和蘋果mdm-miR319c分別與其他osa-miR319、mdm-miR319親緣關(guān)系較遠外，其余基因均聚集在一個分支上，因此推測這2個基因可能有特殊的進化機制，值得探討。

2.4 miR319的靶基因預(yù)測分析

本文以大豆、水稻、玉米3個物種的miR319為模板，利用psRNATarget(http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/)、BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)2個在線網(wǎng)站對miR319的靶基因進行預(yù)測。由表2可以看出，從psRNATarget數(shù)據(jù)庫共檢測出37個靶基因，通過BLAST比對發(fā)現(xiàn)miR319基因家族的靶基因功能主要有轉(zhuǎn)錄因子、翻譯活化劑、還原酶等。其中玉米miR319靶基因功能為PCF8、PCF6轉(zhuǎn)錄因子；水稻miR319靶基因功能為GCN1的翻譯活化劑、還原酶、PCF6轉(zhuǎn)錄因子、蛋白酶；大豆miR319靶基因功能為TCP2、TCP3、TCP4轉(zhuǎn)錄因子、還原酶、轉(zhuǎn)運蛋白、蛋白激酶。這說明miR319主要通過靶向轉(zhuǎn)錄因子影響及調(diào)控植物的生長發(fā)育、信號傳導(dǎo)、植物激素合成和抗逆作用。

表2 miR319的靶基因及其功能預(yù)測結(jié)果

續(xù)表2 Continued table 2

物種Species靶基因名稱Acc of target gene靶基因功能Function of target geneTC420951acyl-CoA-binding domain-containing protein 4含?；o酶A結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)4TC422594acyl-CoA-binding domain-containing protein 4含?；o酶A結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)4TC484251transcription factor GAMYB 轉(zhuǎn)錄因子GAMYBTC492929transcription factor TCP2 轉(zhuǎn)錄因子TCP2TC469605transcription factor TCP2轉(zhuǎn)錄因子TCP2TC431263boron transporter 2 硼轉(zhuǎn)運蛋白2TC425794fructose 1,6-bisphosphate aldolase 果糖1,6-二磷酸醛縮酶HO018779DUF506 family protein DUF506家族蛋白TC443617DUF506 family protein DUF506家族蛋白TC433197polyadenylate-binding protein RBP45 聚腺苷酸結(jié)合蛋白RBP45TC465063Putative LRR receptor-like serine/threonine-protein kinaseLRR受體樣絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶GD676785transcription factor TCP4 轉(zhuǎn)錄因子TCP4TC469484heavy metal transport/detoxification superfamily protein重金屬運輸/解毒超家族蛋白TC430271nicotinamide adenine dinucleotide transporter 1煙酰胺腺嘌呤二核苷酸轉(zhuǎn)運蛋白1

3 討 論

miR319靶基因的功能主要是TCP轉(zhuǎn)錄因子。TCP家族成員都含有TCP保守結(jié)構(gòu)域并編碼結(jié)構(gòu)相似的蛋白，其中由59個氨基酸組成的bHLH結(jié)構(gòu)是結(jié)合DNA和蛋白互作所必需的[17]。TCP 轉(zhuǎn)錄因子通過其功能域和 DNA 及其它蛋白間的相互作用，激活或抑制基因的表達，在植物的生長發(fā)育、形態(tài)建成以及對外界環(huán)境的反應(yīng)中起著重要的調(diào)控作用[18]。TCP家族轉(zhuǎn)錄因子與植物細胞的分化和發(fā)育有密切關(guān)系。通過系統(tǒng)進化分析52個蘋果TCP家族成員發(fā)現(xiàn)，MdTCP22、MdTCP35、MdTCP47、AtTCP20等基因可能在蘋果生長發(fā)育及代謝過程中起作用；MdTCP8、MdTCP9、MdTCP10、MdTCP11等基因可能作為 miRNA的靶基因參與蘋果葉片的發(fā)育[19]。還有研究發(fā)現(xiàn)ClTCP14a和ClTCP15基因在西瓜植增高過程中發(fā)揮重要調(diào)控功能，ClTCP1a，ClTCP2a，ClTCP16，ClTCP20a，ClTCP21基因可能在西瓜葉片衰老的調(diào)控中起著重要作用[20]。以上研究都表明TCP在植物發(fā)育中起重要作用。

而miR319通過其靶基因TCP來控制植物的生長發(fā)育。有研究發(fā)現(xiàn)TCP24在擬南芥花器官和根部的次生壁增厚起負調(diào)控作用。擬南芥中miR319ba的靶基因是TCP24，過表達的TCP24破壞了擬南芥花藥內(nèi)皮中次生細胞壁的增厚過程，導(dǎo)致雄性不育，花藥開裂和花粉釋放。這表明TCP24是作為次生壁增厚的重要調(diào)節(jié)因子，調(diào)節(jié)花藥內(nèi)皮發(fā)育過程[21]。YUC5是涉及生長素生物合成的基因，有研究表明TCP4可直接激活YUC5轉(zhuǎn)錄，并將生長素生物合成的信號通路整合到促進擬南芥下胚軸中細胞伸長的油菜素固醇分子信號通路中。此外，TCP4還調(diào)節(jié)生物素-油菜素類固醇信號傳導(dǎo)下游通路，以促進細胞增殖，而miR319通過靶向TCP來調(diào)控擬南芥下胚軸生長，從而控制植物的生長發(fā)育[22]。RBE基因是控制擬南芥花瓣生長的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，最新研究還發(fā)現(xiàn)RBE基因和miR319共同作為TCP的上游調(diào)控基因來控制擬南芥花瓣的早期發(fā)育過程，這說明植物的生長發(fā)育過程是一個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[23]。此外TCP還調(diào)控茉莉酸信號通路，植物中脫落酸、吲哚乙酸、細胞分裂素、乙烯經(jīng)過一系列信號通路傳遞到miR319，miR319控制轉(zhuǎn)錄因子TCPs，TCPs控制脂肪氧合酶2的表達，從而調(diào)節(jié)衰老葉中的茉莉酸濃度，表明植物激素通過控制TCP來控制葉片衰老過程[24]。

此外，MYB類轉(zhuǎn)錄因子也是miR319的靶基因。有研究表明木薯中的miR319與4個靶基因之間的相關(guān)系數(shù)從大到小的順序為：MYB33>Unknown> TCP4>GSTU8，這說明MYB33和Unknown 2個靶基因是木薯miR319a更為優(yōu)先的調(diào)控目標。關(guān)于miR319對MYB33 和Unknown 兩個靶基因的調(diào)控作用使木薯適應(yīng)低溫逆境的機制值得深入研究[25]。此外miR319靶基因其他的功能如還原酶、蛋白激酶、翻譯活化劑等還需要相關(guān)實驗驗證，有待于進一步研究。

4 結(jié) 論

本文通過生物信息方法對miR319基因家族成員序列分析表明大部分miR319基因分散在不同的染色體上，也有少部分分散在同一條染色體上，miR319序列在不同物種間具有高度的保守性，保守區(qū)位置分布差異較大；進化分析表明miR319基因家族的成員呈現(xiàn)為4大分支，水稻osa-miR319a-3p和蘋果mdm-miR319c有特殊的進化機制；靶基因預(yù)測表明miR319靶基因功能包括轉(zhuǎn)錄因子、翻譯活化劑、還原酶、蛋白酶等，在植物體內(nèi)可能形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對植物生長發(fā)育起著重要的調(diào)控作用。以上結(jié)果為今后進一步研究miR319靶基因調(diào)控植物生長發(fā)育的機制提供了理論依據(jù)。