陳榮華，李勤光，趙敏，康惠玲，陳惠聰

福建醫(yī)科大學(xué)孟超肝膽醫(yī)院肝病研究所 （福建福州 350025）

人類免疫缺陷病毒（humanimmunodef iciencyvir us，HIV）具有高度變異性和重組性，依據(jù)血清學(xué)反應(yīng)和病毒核酸序列測定將其分為HIV-1和HIV-2兩大類型［1］。按照HIV-1的gag基因與env基因變異程度又可以分為A～J和O亞型。各基因亞型間存在較大的基因序列差異，在不同區(qū)域和不同感染對(duì)象中各亞型的分布也有所不同。HIV-1感染以吸毒人群為主，為了進(jìn)一步了解吸毒人群HIV-1毒株血清亞型的分布情況，為制定防控方案、疫苗和診斷試劑研制提供更科學(xué)的依據(jù)，現(xiàn)以我市HIV-1感染吸毒人員20例為研究對(duì)象，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016-2018年我市HIV感染吸毒人員20例，經(jīng)免疫印跡（WB）試驗(yàn)確認(rèn)為HIV-1陽性，采用一對(duì)一問卷調(diào)查方式記錄并整理研究對(duì)象的一般情況與HIV感染行為情況。20例HIV-1感染吸毒人員一般資料見表1。

表1 20例HIV-1感染吸毒人員的一般資料

1.2 方法

1.2.1 血樣采集方式EDTA-K2抗凝采血管采集抗凝血4～5 ml，將采集血樣顛倒混勻后進(jìn)行分裝，并于-80℃冰箱中保存，所有血樣經(jīng)過HIV檢測并經(jīng)WB試驗(yàn)方法進(jìn)行確認(rèn)。

1.2.2 Nested-PCR檢測方法

應(yīng)用套式PCR對(duì)HIV前病毒gag基因進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增片段長度為1 081 bp，試劑為TaKaLa PrimeSciptTMOne Step RTPCR Ver．2和Prime Ex TaqTMHot Start Version擴(kuò)增引物：（MK603）CAG-AAA-AAT-TGT-GGG-TCA-CAGTCT-ATT-ATG-GGG-TAC-CT（在V3區(qū)的位置：5914-5931），（CO602）GCC-CAT-AGT-GCT-TCC-TGCTGC-TCC-CAA-GAA-CC（在V3區(qū)的位置：7410-7329），（EB2）GCC-GGA-TCC-TCA-ACT-CAA-CTG-CTG-TTA-AAT（在V3區(qū)的位置：6989-7009），（EC2）GCT-CTG-CAG-TCA-AAT-TTC-TGG-GTCCCC-TCC-TGA-GG（在V3區(qū)的位置：7314-7336）。

第1輪擴(kuò)增反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃1′，變性9 5℃1′，退火55℃1′，延伸72℃2′，循環(huán)數(shù)35，浸泡72℃7′。第2輪擴(kuò)增反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃1′，變性95℃1′，退火55℃1′，延伸72℃1．30′，循環(huán)數(shù)35，浸泡72℃7′。

擴(kuò)增產(chǎn)物置于2%瓊脂糖凝膠上電泳20 min，電壓100 V，采用溴化乙錠染色，于紫外光下觀察。

1.2.3 多肽免疫酶法（PEIA）檢測方法

包被抗原為HIV-1亞型合成多肽抗原，即E、B′、B（mn）、C、D，包被抗原100μl／孔，4℃下放置18 h，以200μl牛奶緩沖液于37℃下封閉90 min，經(jīng)3次洗滌。每孔加入血清標(biāo)本于37℃下放置1 h，經(jīng)3次洗滌后每孔加入酶結(jié)合物100μl于37℃下放置1 h，經(jīng)3次洗染后每孔加底物100μl避光顯色5 min。每孔加2M H2SO450μl終止。于492 nm波長下檢測OD值（陽性：OD值＞0．3；陰性：OD值≤0．3）。

1.2.4 sanger測序方法

不確定的亞型送檢上海博尚生物公司進(jìn)行測序分析。使用美國ABI公司熒光標(biāo)記末端終止循環(huán)測序試劑盒測定gag基因序列，用ABI公司的Sequencing nallysing 5．0軟件進(jìn)行分析和編輯序列數(shù)據(jù)，通過美國拉莫斯國家實(shí)驗(yàn)室HIV核酸序列庫的HIV-BLAST工具與國際參考毒株序列進(jìn)行比較，據(jù)同源性確定HIV-1亞型。

2 結(jié)果

2.1 Nested-PCR檢測情況

20例HIV-1感染吸毒人員共檢測20份HIV-1血清抗體陽性標(biāo)本，其中18份檢出V3區(qū)基因產(chǎn)物。

2.2 PEIA檢測情況

HIV-1血清亞型：20例HIV-1感染吸毒人員共檢測20份HIV-1血清抗體陽性標(biāo)本，其中17份血清亞型陽性，C亞型9份，E亞型1份，C和E亞型均反應(yīng)7份，未發(fā)現(xiàn)B＇、B（mn）、D亞型。

2.3 sanger測序方法檢測情況

HIV-1血清亞型：3份無法確認(rèn)分型的采用sanger測序方法可以準(zhǔn)確分型，C亞型2份，E亞型1份。

3 討論

3.1 HIV-1血清亞型測定的意義

我國首次HIV分子流行病學(xué)調(diào)查提示絕大部分血液傳播途徑的感染者屬于B亞型毒株，并且這一亞型在我國流行區(qū)域十分廣泛［2］。第2次全國HIV分子流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)CRF01-AE亞型仍然以性傳播人群為主，但吸毒人群感染CRF01-AE亞型的人數(shù)比例明顯增大。吸毒人群具有靜脈注射、共用針頭、高危性行為等特點(diǎn)。靜脈共用注射器吸毒、無保護(hù)性交是導(dǎo)致吸毒人群感染HIV-1的主要因素［3］。HIV-1病毒反轉(zhuǎn)錄酶缺乏校正功能易發(fā)生復(fù)制錯(cuò)誤，復(fù)制過程中易產(chǎn)生大量點(diǎn)突變或點(diǎn)插入、點(diǎn)缺失，進(jìn)而引發(fā)重組，形成大量亞型內(nèi)重組毒株或亞型間重組毒株。HIV-1型分為M、O、N 3組，M組分為A、B、C、D、F、G、H、J、K 9個(gè)基因亞型和16個(gè)流行重組形式［4］。現(xiàn)階段伴隨HIV-1持續(xù)快速變異與世界人流流動(dòng)的日趨頻繁，未來將會(huì)出現(xiàn)更多的組、亞型、混合感染、超感染等，這些都對(duì)HIV-1的監(jiān)測和防控帶來更大的困擾。因不同HIV基因亞型與流行重組形式和傳播能力存在顯著相關(guān)性，不僅會(huì)導(dǎo)致不同疾病進(jìn)程，而且對(duì)抗病毒方案的效果產(chǎn)生一定影響。

不同亞型HIV感染進(jìn)展為獲得性免疫缺陷綜合征（AIDS）的速率不同，調(diào)節(jié)HIV轉(zhuǎn)錄的反式激活蛋白的高水平表達(dá)可促使HIV快速繁殖［5］。O組病毒對(duì)非核酸逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑具有天然抗性，M組亞型對(duì)目前使用藥物具有相似敏感性，F(xiàn)亞型對(duì)非核酸逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑的敏感性較低，G亞型對(duì)蛋白酶抑制劑敏感性較低［6］。因病毒選擇性積累抗藥性變異會(huì)對(duì)藥物療效產(chǎn)生影響，故對(duì)HIV-1病毒亞型基因編碼區(qū)進(jìn)行定期抗性突變檢測，能夠?yàn)樗幬镞x擇提供一定參考。對(duì)于疫苗研發(fā)工作，基因變異是目前發(fā)展AIDS有效疫苗的主要制約因素，現(xiàn)階段絕大多數(shù)候選疫苗是基于B亞型的包膜蛋白設(shè)計(jì)的。HIV亞型之間存在交叉保護(hù)作用，其包膜蛋白的氨基酸序列存在一定的差異，現(xiàn)有候選疫苗能否誘發(fā)抗體產(chǎn)生交叉中和尚無法確認(rèn)［7］。了解流行HIV基因亞型，掌握流行重組形式的種類、分布與變化情況，對(duì)于研制具有地區(qū)特色的疫苗、減少疫苗株和流行株之間的差異有著重要意義。

3.2 HIV-1血清亞型的測定情況

我國是世界上HIV-1病毒亞型流行較多的國家，HIV-1篩查工作尤為艱巨。常見的HIV抗體測定方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法、化學(xué)發(fā)光法、快速檢測法，此外，抗體確證試驗(yàn)、免疫印跡試劑盒條帶免疫試驗(yàn)、核酸定性和核酸定量試驗(yàn)等也常作為補(bǔ)充試驗(yàn)用于HIV檢測。上述HIV抗體檢測可用于臨床診斷、血液篩查和監(jiān)測等，以診斷為目的的檢測是為了確定個(gè)體HIV感染狀況，以血液篩查為目的的檢測是為了防治輸血傳播HIV，以監(jiān)測為目的的檢測是為了了解不同人群HIV感染率與變化趨勢。盡管我市AIDS疫情總體上屬于低流行，但近年來AIDS發(fā)病率增長較快，有明顯上升趨勢。因吸毒人群是感染HIV-1的主要群體，故本研究選取近3年來20例確認(rèn)感染HIV-1的吸毒人員作為研究對(duì)象，分析HIV-1血清亞型。本研究中HIV-1毒株血清亞型為C、E和CE混合型，其中C亞型為優(yōu)勢亞型。除上述亞型外，可能還存在其他未能檢測出的亞型。同一研究對(duì)象可能同時(shí)感染不同亞型的病毒株或已出現(xiàn)重組毒株。故本研究20例吸毒人群HIV-1病毒血清亞型具有顯著的多樣性特點(diǎn)。本研究采用PEIA法測定HIV-1血清亞型，具有簡便、快捷、經(jīng)濟(jì)性、實(shí)用性等優(yōu)勢。

3.3 HIV防治思路分析

HIV重組體毒株是多種毒株混合感染、多種毒株在機(jī)體復(fù)雜免疫環(huán)境中優(yōu)勢選擇而產(chǎn)生的結(jié)果，往往較為單一基因亞型毒株卻有著更強(qiáng)的傳播能力［8］。本研究中，20例HIV-1感染吸毒人員中C亞型為優(yōu)勢亞型。由于本研究對(duì)象HIV-1病毒血清亞型具有多樣性特點(diǎn)，將來可能出現(xiàn)重組型毒株，導(dǎo)致我市HIV流行情況更加復(fù)雜，為HIV／AIDS的防治帶來更大的挑戰(zhàn)。故結(jié)合本研究情況，在疫苗研發(fā)、診斷試劑研制、抗病毒方案制定等方面應(yīng)考慮本地區(qū)的HIV-亞型種類、分布情況、變異趨勢與顯著特征，做好HIV-1毒株亞型與變異情況的監(jiān)測，確保能夠及時(shí)準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)HIV-1的流行趨勢和發(fā)展趨勢，有針對(duì)性地開展預(yù)防和控制。

本研究樣本量較少，HIV-1毒株血清亞型和HIV-1流行株耐藥情況分析，應(yīng)進(jìn)行連續(xù)性的動(dòng)態(tài)監(jiān)測，才能及時(shí)發(fā)現(xiàn)重組型毒株和耐藥情況。因此，在今后HIV／AIDS防治工作中，需加強(qiáng)對(duì)HIV-1血清亞型和耐藥的監(jiān)測，加強(qiáng)對(duì)吸毒人群的監(jiān)測和干預(yù)力度，從而遏制吸毒人群HIV傳播蔓延的趨勢。

綜上所述，本組HIV感染吸毒人員HIV-1毒株存在多種亞型，其中以C亞型為優(yōu)勢亞型，近年來，該亞型在我國HIV-1感染者中增長迅速，并從吸毒人群逐漸向普通人群擴(kuò)散。在我市HIV／AIDS防治中，應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)HIV-1毒株亞型及其變異的研究，充分掌握我市HIV-1亞型種類、特征、分布與變異趨勢，及時(shí)準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)HIV-1疫情，針對(duì)不同HIV-1毒株亞型采取不同措施進(jìn)行防治。同時(shí)，加強(qiáng)對(duì)戒毒所、娛樂場所的監(jiān)管，打擊吸毒販毒行為，對(duì)吸毒人員進(jìn)行HIV篩查，加強(qiáng)區(qū)域檢測實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)建設(shè)，擴(kuò)大檢測人數(shù)及范圍，有效控制吸毒人群AIDS的蔓延與流行。