吳 璟，鄭 婕，金學(xué)琴，黎偉華*

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，銀川 750004； 2.寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，銀川 750004)

葫蘆巴堿(trigonelline)是從豆科蝶形花亞科葫蘆巴中分離純化的一種生物堿，主治溫腎，祛寒，止痛[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明其具有提高男性生育能力、抗氧化、保護(hù)心腎等作用[2-4]。本研究擬以單次熱應(yīng)激構(gòu)建小鼠生殖損傷模型，給予不同劑量的葫蘆巴堿進(jìn)行干預(yù)，觀察葫蘆巴堿對熱應(yīng)激致小鼠睪丸損傷的保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性ICR小鼠120只，8～10周齡，體重25～30 g，由寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供[SCXK(寧)2015-0001]。飼養(yǎng)于寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心屏障動物實驗設(shè)施內(nèi)[SYXK(寧)2015-0001]，溫度范圍20～26℃，晝夜明暗交替(12/12 h)，自由進(jìn)水?dāng)z食。動物使用的倫理審批號為：IACUC-NYDWZX2018071。

1.2 主要試劑與儀器

葫蘆巴堿鹽酸鹽(ST8270，≥ 98%，北京索萊寶科學(xué)技術(shù)有限公司)，蘇木素染液(716113，珠海貝索生物技術(shù)有限公司)，伊紅染液(716122，珠海貝索生物技術(shù)有限公司)，水浴鍋(DK600S，上海精宏實驗設(shè)備有限公司)，電子天平(PTY-C2200，福州華志科學(xué)儀器有限公司)，全自動組織脫水機(jī)(ASP200S，德國Leica公司)，包埋機(jī)(Leica HistoCore Arcadia，德國Leica公司)，石蠟切片機(jī)(RM2245，德國Leica公司)，正置熒光顯微鏡(NI-U，日本尼康)，無水乙醇(20181110，北京市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司)，二甲苯(20171220，北京市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組及藥物干預(yù)

SPF級雄性ICR小鼠120只，隨機(jī)分為正常對照組、模型組和葫蘆巴堿藥物干預(yù)組(分別給予25 mg/kg，50 mg/kg，100 mg/kg，分為低、中、高劑量組)，每組24只。正常對照組及模型組給予生理鹽水0.5 mL/20 g灌胃，葫蘆巴堿藥物干預(yù)組給予相應(yīng)劑量葫蘆巴堿預(yù)防灌胃給藥一周后，單次熱應(yīng)激處理，繼續(xù)給藥14 d。

1.3.2 小鼠睪丸的局部熱應(yīng)激處理及標(biāo)本采集

藥物干預(yù)一周后，各組小鼠麻醉處理，正常對照組不予處理，其余各組小鼠用固定架固定，待小鼠睪丸下降至陰囊后將其下腹部浸入43℃恒溫水浴15 min。隨后取出小鼠，打開固定架，室溫放置，待麻醉消除后放回鼠盒。各組繼續(xù)給予相應(yīng)藥物灌胃14 d。并分別于1，7，10，14 d稱重并處死動物。留取睪丸、附睪及精囊腺，吸干表面，稱取重量，計算臟器系數(shù)。右側(cè)睪丸用bouin液固定，左側(cè)睪丸置于-80℃保存，備用。

睪丸系數(shù)(testicular coefficient)=
(雙側(cè)睪丸平均重量/體重) ×100%；
附睪系數(shù)(epididymis coefficient)=
(雙側(cè)附睪平均重量/體重) ×100%；
精囊腺系數(shù)(seminal vesicle coefficient)=
(精囊腺重量/體重) ×100%。

1.3.3 附睪精子數(shù)的檢測[5]

將盛有5 mL生理鹽水的培養(yǎng)皿置于恒溫水浴箱內(nèi)預(yù)熱至37℃，將小鼠右側(cè)附睪尾剪下稱重并在培養(yǎng)皿中剪碎，搖勻，水浴5 min，待精子充分游離出來，用200目細(xì)胞篩過濾，然后取20 μL濾液滴于計數(shù)板上，在400倍光鏡下計數(shù)血細(xì)胞計數(shù)板上4大格精子的數(shù)量，計算單位重量附睪尾精子數(shù)量，根據(jù)附睪重量，進(jìn)一步計算出整個附睪平均精子數(shù)量。

每克附睪尾組織所含精子數(shù)量=四大格精子數(shù)量之和/4×原液體積(2 mL) ×10 000/組織塊重量；

整個附睪平均精子數(shù)量=每克附睪尾組織所含精子數(shù)量×附睪重量。

1.3.4 小鼠睪丸組織切片的制備與觀察

用Bouin液固定睪丸組織4～8 h后，用注射器扎破睪丸兩端的鞘膜，確保固定液充分浸潤組織達(dá)到固定效果。固定48 h后取材脫水，將睪丸組織從 Bouin固定液中取出，放入脫水盒內(nèi)，脫水盒依次放入Leica ASP200S脫水機(jī)中以不同的梯度酒精脫水7.5 h，透明1.5 h，浸蠟2 h。石蠟包埋，置于4℃冷藏箱保存。用半自動石蠟切片機(jī)切片(片厚約5 μm)，蘇木素伊紅染色，封片，晾干。用正置熒光顯微鏡觀察睪丸組織切片中生精小管、生殖細(xì)胞的形態(tài)變化情況，并記錄拍照。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 葫蘆巴堿對熱應(yīng)激致睪丸組織損傷的影響

熱應(yīng)激后第1天，與正常對照組比較，模型組附睪精子數(shù)量顯著減少(P< 0.01)、附睪系數(shù)(P< 0.01)、精囊腺系數(shù)(P< 0.01)、睪丸系數(shù)(P< 0.05)明顯降低；與模型組比較，中劑量葫蘆巴堿藥物干預(yù)組精子數(shù)量顯著升高 (P< 0.05)。高劑量葫蘆巴堿藥物干預(yù)組精子數(shù)量顯著升高(P< 0.05)、精囊腺系數(shù)(P< 0.01)顯著升高。

熱應(yīng)激后第7天，與正常對照組比較，模型組附睪精子數(shù)量、睪丸系數(shù)、附睪系數(shù)、精囊腺系數(shù)均顯著性降低 (P< 0.01)；與模型組比較，葫蘆巴堿各劑量組均能顯著提高小鼠睪丸系數(shù)、附睪系數(shù)(P< 0.01)、精囊腺系數(shù)(P< 0.05)并增加精子數(shù)量，且呈劑量依賴性。

熱應(yīng)激后第10天，與正常對照組比較，模型組各臟器系數(shù)與附睪精子數(shù)量仍顯著降低(P< 0.01)；與模型組比較，低劑量給藥組附睪精子數(shù)量(P< 0.05)、睪丸系數(shù)(P< 0.01)、附睪系數(shù)(P< 0.05)、精囊腺系數(shù)(P< 0.01)均明顯增加。中、高劑量藥物干預(yù)組各臟器系數(shù)與精子數(shù)均顯著增加(P< 0.01)，呈明顯時間依賴性。

熱應(yīng)激后第14天，模型組部分自修復(fù)，但與正常對照組比較，各臟器系數(shù)與精子數(shù)仍有明顯降低(P< 0.05)；與模型組比較，中、低劑量給藥組睪丸系數(shù)有明顯升高(P<0.05)，高劑量給藥組睪丸系數(shù)(P< 0.01)、精子數(shù)(P< 0.05)均顯著增加。結(jié)果見表1。

表1 葫蘆巴堿對熱應(yīng)激致小鼠睪丸系數(shù)，附睪系數(shù)、精囊腺系數(shù)及附睪精子數(shù)的影響

注：模型組與正常對照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01；藥物干預(yù)組與模型組比較，#P< 0.05，##P< 0.01。

Note. Comparison between the model group and the normal control group,*P< 0.05,**P< 0.01. Comparison between the drug intervention group and the model group,#P< 0.05,##P< 0.01.

2.2 單次熱應(yīng)激對小鼠睪丸組織形態(tài)的影響

2.2.1 大體觀察

正常對照組小鼠睪丸結(jié)構(gòu)完整，睪丸組織緊實圓潤，體積大，血管網(wǎng)清晰充盈可見。熱應(yīng)激第7天后，與正常對照組比較，模型組小鼠睪丸結(jié)構(gòu)較完整，睪丸組織松馳，體積較小，血管網(wǎng)顏色變淺。與模型組比較，各劑量藥物干預(yù)組睪丸組織緊實，體積較大，血管網(wǎng)清晰可見。

2.2.2 葫蘆巴堿對熱應(yīng)激誘導(dǎo)的小鼠睪丸損傷模型中睪組織病理的影響

HE染色后鏡下可見：正常對照組(圖1：E1，E2，E3，E4)小鼠睪丸組織的生精小管排列緊密有序，細(xì)胞層數(shù)清晰完整，管周聯(lián)系緊密，生精上皮可見精原細(xì)胞及各個發(fā)育階段的精母細(xì)胞、精細(xì)胞、精子細(xì)胞，管腔中成形精子密集可見，睪丸的Leydig間質(zhì)細(xì)胞規(guī)則有序。與正常對照組比較，模型組熱應(yīng)激后第1天(圖2A)生精上皮層數(shù)減少，細(xì)胞排列松散，精細(xì)胞明顯減少，管腔中成形精子顯著減少，生精上皮變薄，管周聯(lián)系不緊密。第7天(圖3A)，小鼠睪丸組織生精上皮明顯空泡變性及萎縮，排列紊亂，生精細(xì)胞層數(shù)和數(shù)量明顯減少，生殖細(xì)胞剝離，精子未可見，且間質(zhì)空泡增多，間質(zhì)細(xì)胞顯著減少，膠原纖維增生，界膜增厚。第10天(圖4A)，除睪丸間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量稍有增加，其它損傷均未改善。第14天(圖5A)，小鼠睪丸組織生精上皮仍存在明顯空泡變性及萎縮，排列較為整齊，生精細(xì)胞層數(shù)依然混亂，數(shù)量明顯少，精子未可見。與模型組比較，葫蘆巴堿各劑量藥物干預(yù)組對熱刺激致小鼠睪丸生精小管的損傷在不同時間段均有一定的恢復(fù)作用，其中以高劑量組在熱應(yīng)激后14 d效果最佳(圖5D)。鏡下可見生精小管各級層數(shù)清楚增多，空泡變性現(xiàn)象改善，生精細(xì)胞分布較為致密，排列整齊，精細(xì)胞和精子均可見，且管間聯(lián)系緊密，間質(zhì)細(xì)胞顯著增多(圖2～5：B，C，D)。

注：E1：第1天正常對照組；E2：第7天正常對照組；E3：第10天正常對照組；E4：第14天正常對照組。圖1 正常對照組睪丸組織病理觀察(HE染色，×400)Note. E1, Normal control group on the 1st day. E2, Normal control group on the 7th day. E3, Normal control group at the 10th day. E4, Normal control group on the 14th day.Figure 1 Pathological observation of the testis in the control group. HE staining

注：A：模型組；B：葫蘆巴堿低劑量組；C：葫蘆巴堿中劑量組；D：葫蘆巴堿高劑量組。下圖同。圖2 熱應(yīng)激后第1天，模型組和葫蘆巴堿干預(yù)組睪丸組織病理觀察(HE染色，×400)Note. A, Model group. B, Low dose group of trigonelline. C, Medium dose group of trigonelline. D, High dose group of trigonelline. The same in the following figures.Figure 2 Pathological observation of the testis tissue in the model group and trigonelline group on the 1st day after heat stress. HE staining

圖3 熱應(yīng)激后第7天，模型組和葫蘆巴堿干預(yù)組睪丸組織病理觀察(HE染色，×400)Figure 3 Pathological observation of the testis tissue in the model group and trigonelline group on the 7th day after heat stress. HE staining

圖4 熱應(yīng)激后第10天，模型組和葫蘆巴堿干預(yù)組睪丸組織病理觀察(HE染色，×400)Figure 4 Pathological observation of the testis tissue in the model group and trigonelline group on the 10th day after heat stress. HE staining

圖5 熱應(yīng)激后第14天，模型組和葫蘆巴堿干預(yù)組睪丸組織病理觀察(HE染色，×400)Figure 5 Pathological observation of the testis tissue in the model group and trigonelline group on the 14th day after heat stress. HE staining

3 討論

雄性小鼠生殖系統(tǒng)由睪丸(testis)、生殖管道、附屬腺及外生殖器組成。睪丸能產(chǎn)生精子，分泌雄激素。附睪可暫存精子和促進(jìn)精子成熟，也是運(yùn)輸精子的生殖管道[6-7]。睪丸包含生精小管，直精小管、睪丸網(wǎng)和Leydig間質(zhì)細(xì)胞，其中生精細(xì)胞占多數(shù)，而生精小管由生精細(xì)胞(雄性的生殖細(xì)胞)和Sertoli支持細(xì)胞組成。精子是減數(shù)分裂后期形成的，其發(fā)生時生精細(xì)胞(包括A、B型精原細(xì)胞，初、次級精母細(xì)胞及早、晚期精子細(xì)胞和精子)從生精上皮的基底側(cè)遷移到管腔側(cè)，其間經(jīng)過復(fù)雜的分裂再生過程[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，睪丸組織損傷明顯造成精子數(shù)的顯著減少，且各生殖器官臟器系數(shù)顯著降低。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為腎藏精，為先天生殖之本，腎能匯聚五臟六腑之精而藏之，腎氣充盈，才能保障生殖功能及性功能正常。而精子發(fā)生、成熟與腎精充盈與否關(guān)系密切[9]。葫蘆巴適生于寧夏、甘肅、青海、新疆、內(nèi)蒙古等地，在寧夏境內(nèi)分布尤為廣泛，其干燥成熟種子作為常用中藥收入中國藥典[10]。用于治療“腎臟虛冷”等多種虛損性疾病[11]。葫蘆巴其它化學(xué)成分的研究已多有報道，但其葫蘆巴堿在保護(hù)生殖器官損傷方面鮮有報道。

馬文智等[12]報道熱應(yīng)激抑制了精原細(xì)胞的增值。叢霞等[13]研究熱應(yīng)激對雄鼠生殖器官及精子發(fā)生的影響。熱應(yīng)激溫度的閾值決定了對生殖細(xì)胞造成的損害程度，43℃單次熱應(yīng)激處理15 min時可以明顯誘導(dǎo)生殖損傷[14-18]。本研究以43℃熱處理15 min成功誘導(dǎo)小鼠睪丸組織損傷，并進(jìn)一步監(jiān)測熱應(yīng)激后不同時間小鼠睪丸組織損傷情況以及自恢復(fù)情況。結(jié)果表明：與正常對照組比較，熱應(yīng)激后小鼠生殖器官臟器系數(shù)顯著降低，精子數(shù)量明顯減少，睪丸組織病理形態(tài)變化顯著，并在觀察期間沒有完全的可逆性恢復(fù)。葫蘆巴堿藥物干預(yù)后，小鼠生殖器官臟器系數(shù)顯著提高，精子數(shù)量明顯增加，睪丸組織病理形態(tài)部分恢復(fù)，鏡下可見生精小管界膜完整，各級生精細(xì)胞排列致密清楚，數(shù)量明顯增多，空泡變性現(xiàn)象顯著改善，大部分管腔內(nèi)精細(xì)胞和精子均可見，結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)趨于正常，且呈劑量依賴性和時間依賴性。說明葫蘆巴堿對熱應(yīng)激致小鼠睪丸組織損傷由明顯的保護(hù)作用，其作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。