李曉娟，李興杰，侯 俊，孫慧偉，馮 帆，王志杰，李 潤，李瑞生*

(1.中國人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心臨床研究管理中心，北京 100039； 2.解放軍醫(yī)學院，北京 100853； 3.中國人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心臨床檢驗診療中心，北京 100039)

皮膚是哺乳動物最大的器官，具有屏障、吸收、代謝免疫調(diào)節(jié)等多種生理功能，其完整性及穩(wěn)態(tài)直接關系到機體的健康狀態(tài)[1]。皮膚創(chuàng)傷愈合一直是研究的熱點和難點，由于皮膚的創(chuàng)傷愈合是一個復雜的病理過程，包括炎癥反應、細胞增殖、血管生成、基質(zhì)沉積和皮膚重塑等方面[2-3]。而我們在前期的研究中發(fā)現(xiàn)突變卷毛對小鼠的皮膚外觀和毛囊結構有一定的影響，與正常小鼠存在著一定差異[4]，因而推測突變卷毛基因可能對皮膚創(chuàng)傷愈合也可能有所影響。本實驗對BALB/c突變卷毛小鼠與對照BALB/c小鼠的皮膚創(chuàng)傷愈合能力進行了比較分析，以了解突變小鼠的皮膚與對照小鼠皮膚應對創(chuàng)傷的修復能力是否存在差異，探討這種差異對皮膚修復起到促進或抑制的作用，為今后研究卷毛小鼠突變基因的作用以及為本突變小鼠成為皮膚創(chuàng)傷修復研究模型的可能提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選擇SPF級6周齡BALB/c突變卷毛小鼠10只，雌性，18～20 g，來源于本實驗室近交培育(全同胞兄妹交配)；選擇SPF級6周齡BALB/c小鼠10只，雌性，18～20 g，購自斯貝福(北京)生物技術有限公司[SCXK(京)2016-0002]。飼養(yǎng)室[SYXK(軍)2017-0016]溫度22℃～ 25℃，環(huán)境濕度40%，自由進食和飲水，并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。本實驗通過了解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心動物倫理委員會審查，項目倫理審查批準號：IACUC-2017-006。

1.2 主要試劑與儀器

甲醛(批號：1210122，西隴化工股份有限公司)；生理鹽水(批號：130520405，石家莊四藥有限公司)；異氟烷(批號：217172201，深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒購自北京博奧森生物技術有限公司；天狼猩紅染料自行配置；石蠟切片機(美國AO)，正置顯微鏡(日本NIKON)。

1.3 實驗方法

1.3.1 小鼠皮膚創(chuàng)面模型制備

本實驗分為2組：突變小鼠組(10只)和對照(正常)小鼠組(10只)。將兩組小鼠分別經(jīng)異氟烷麻醉，剃去背部毛，碘伏局部消毒，以脊柱為中線，用無菌眼科剪在小鼠背部切除全層皮膚，形成兩個直徑約0.5 cm皮膚全層損傷創(chuàng)面，深及筋膜，無菌紗布止血。造模成功后拍照記錄，放回鼠籠單籠飼養(yǎng)，自由飲食。

1.3.2 小鼠創(chuàng)口愈合的觀察指標

皮膚創(chuàng)傷模型建立后，觀察創(chuàng)口外觀的變化情況，創(chuàng)緣上皮化和局部肉芽組織的顏色及形態(tài)。同時根據(jù)張凱等方法[5]，分別在創(chuàng)傷后第3、7、10、14天透明硫酸紙覆蓋于創(chuàng)口表面，沿創(chuàng)口外緣畫線，用正交坐標紙測量創(chuàng)口面積，計算愈合率，愈合率=(1-切口面積/原切口面積)×100%。

1.3.3 小鼠皮膚組織病理學檢測

在術后第3、7、10、14天測量完愈合創(chuàng)口面積后，從兩組中隨機分別取2只小鼠，麻醉后取創(chuàng)面新生皮膚組織及周圍少許正常皮膚，用4%多聚甲醛固定，將固定好的組織脫水、包埋、切片，進行HE染色和天狼猩紅染色，顯微鏡下觀察不同階段新生皮膚病理學改變，拍照分析。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 兩組小鼠創(chuàng)面愈合皮膚外觀對比分析

肉眼觀察顯示，兩組小鼠的兩個創(chuàng)面恢復都存在先后現(xiàn)象。而卷毛小鼠創(chuàng)后3 d可觀察到由少量的稠液滲出量，創(chuàng)面呈向心性生長，有明顯的結痂覆蓋(見圖1B)，創(chuàng)后7 d皮膚創(chuàng)緣出現(xiàn)了上皮化現(xiàn)象(見圖1C)，創(chuàng)后10 d創(chuàng)面持續(xù)減少，可見清晰的較小的愈合面(見圖1D)，創(chuàng)后14 d可見創(chuàng)面已愈合，完全上皮化，愈合面幾乎肉眼看不清(見圖1E)；而對照組小鼠在創(chuàng)后3 d稠液滲出量較多，創(chuàng)面僅出現(xiàn)較小的縮小，有炎癥反應發(fā)生(見圖1G)，創(chuàng)后7 d皮膚創(chuàng)面滲出液減少，傷口周圍干燥出現(xiàn)結痂(見圖1H)，創(chuàng)后10 d創(chuàng)面出現(xiàn)大面積的愈合(見圖1I)，創(chuàng)后14 d創(chuàng)面愈合，出現(xiàn)上皮化，愈合后的疤痕清晰可見(見圖1J)。對照小鼠愈合速度慢于卷毛小鼠。

2.2 兩組小鼠創(chuàng)傷愈合率及創(chuàng)面愈合時間對比分析

根據(jù)前述公式計算皮膚愈合率結果顯示：卷毛小鼠的皮膚在創(chuàng)后3 d、7d的愈合率顯著高于對照小鼠的愈合率，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而在創(chuàng)后10 d和14 d兩組小鼠的愈合率不具有顯著差異。(見表1)

2.3 兩組小鼠創(chuàng)傷愈合過程中皮膚形態(tài)學改變對比分析

HE染色結果顯示：皮膚創(chuàng)后3 d：卷毛小鼠的創(chuàng)面膠原纖維明顯增多，可見少量炎癥細胞浸潤，毛細血管擴張充血，而對照小鼠創(chuàng)后3 d的創(chuàng)面炎癥細胞浸潤多于卷毛小鼠，膠原纖維增多的程度少于卷毛小鼠(見圖2A和2E)；創(chuàng)后7 d：卷毛小鼠的膠原增長迅速，炎癥細胞浸潤繼續(xù)增多，肉芽組織顯著增多，可見部分表皮再生生長，對照小鼠的損傷部位仍只能看到膠原增厚，修復痕跡還不明顯(見圖2B和2F)；創(chuàng)后10 d：卷毛小鼠的膠原修復基本完成，肉芽組織幾乎將破損處填平，創(chuàng)面上皮基本上皮化，而且能看到新生的毛囊，而對照小鼠的破損修復也基本完成，但是還沒有毛囊的新生(見圖2C和2G)。創(chuàng)后14 d：卷毛小鼠新生皮膚中毛囊已經(jīng)有毛發(fā)生長，對照小鼠的皮膚中還未看到毛發(fā)生長(見圖2D和2H)。

注：A～E：依次為卷毛小鼠0, 3, 7, 10 d和14 d；F～J：依次為對照小鼠0, 3, 7, 10 d和14 d。圖1 兩組小鼠外觀特征的對比Note. A-E, Curly mice at 0, 3, 7, 10 d and 14 d, respectively. F-J, Control mice at 0, 3, 7, 10 d and 14 d, respectively.Figure 1 Comparison between the appearance of the mice in the two groups

Table1Comparison of wound healing rates at different time points in the two groups

組別Groups愈合率(%)Heating rate(%)3 d7 d10 d14 d卷毛小鼠Curly mice65.23±2.45?82.14±3.10?90.25±2.9898.32±1.10對照小鼠Control mice36.02±1.6762.37±1.2482.74±1.5493.78±0.98

注：與對照小鼠比較，*P<0.05。

Note. Compared with the control mice,*P<0.05.

天狼猩紅染色結果顯示：根據(jù)文獻[6]，I型膠原染成粉紅色，可觀察到膠原和肉芽組織染為淡粉紅色。表皮、毛囊和毛發(fā)染為黃色。卷毛小鼠在創(chuàng)后3 ～ 14 d可以清晰的看到膠原纖維和肉芽組織從底層逐漸頂替修復破損部位，直至表皮和毛囊生長出來。而對照小鼠的修復過程與卷毛小鼠相似，但恢復時間較慢(見圖3)。

3 討論

皮膚作為與外界接觸的屏障，在創(chuàng)傷愈合中起非常重要的作用[7]。皮膚創(chuàng)傷愈合不僅是一個復雜的病理過程，更是一個高度復雜的生物過程，由炎癥、增殖和重塑三個重疊的階段組成[8]。任何一個或多個階段的損傷以及年齡等因素都會導致皮膚的修復過程的障礙和改變[9-10]，因此皮膚創(chuàng)傷愈合一直是醫(yī)學界的一個難題。王海濤[11]等探討了皮膚創(chuàng)傷修復過程中皮膚干細胞的分布以及增殖分化遷移特征。伍小敏[12]等研究發(fā)現(xiàn)羅哌卡因?qū)梢源龠M小鼠全層皮膚損傷愈合以及能夠促進GM-CSF表達在皮膚愈合中發(fā)揮的作用。Ding等[13]研究發(fā)現(xiàn)富含血小板的纖維蛋白可以通過增加血管的形成來加速糖尿病小鼠模型的皮膚傷口愈合。國內(nèi)外許多研究者對皮膚創(chuàng)傷愈合均進行了探討和研究，但對皮膚愈合機制尚未有定論，同時對于基因突變小鼠的皮膚創(chuàng)傷愈合尚未見報道。

注：A～D：依次為卷毛小鼠3, 7, 10 d和14 d；E～H：依次為對照小鼠3, 7, 10 d和14 d。藍色箭頭可見炎癥細胞。圖2 兩組小鼠皮膚組織病理學觀察(HE染色，× 200)Note. A-D, Curly mice at 3, 7, 10 d and 14 d, respectively. E-H, Control mice at 3, 7, 10 d and 14 d, respectively. The blue arrow shows inflammatory cells.Figure 2 The skin histopathology of mice in the two groups. HE staing

注：A～D：依次為卷毛小鼠3, 7, 10 d和14 d；E～H：依次為對照小鼠3, 7, 10 d和14 d。藍色箭頭可見膠原修復處。圖3 兩組小鼠皮膚組織病理學觀察(天狼猩紅染色，× 200)Note. A-D, Curly mice at 3, 7, 10 d and 14 d, respectively. E-H, Control mice at 3, 7, 10 d and 14 d, respectively. The blue arrow is visible at the collagen repair.Figure 3 The skin histopathology of mice in the two groups. Sirius red staining

本實驗對BALB/c突變卷毛小鼠與對照BALB/c小鼠的皮膚創(chuàng)傷愈合能力進行了比較分析：從創(chuàng)口愈合的外觀結果顯示卷毛小鼠在創(chuàng)傷后的3～7 d為愈合急速期，愈合能力顯著強于對照小鼠，而在愈合后期10～14 d，兩組的愈合速度及愈合率相差不多。同時我們從兩組小鼠測量創(chuàng)口計算的愈合率結果也能看出：卷毛小鼠的皮膚在創(chuàng)后3 d和7 d的愈合率顯著高于對照小鼠的愈合率，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而在創(chuàng)后10 d和14 d兩組小鼠的愈合率不具有顯著性差異。病理分析結果顯示：皮膚創(chuàng)后3 d時卷毛小鼠的創(chuàng)面膠原纖維明顯增多，炎癥細胞浸潤較少，毛細血管擴張充血，對照小鼠的創(chuàng)面炎癥細胞浸潤多于卷毛小鼠，膠原纖維增多的程度少于卷毛小鼠，與外觀結果相符合。創(chuàng)傷愈合的起始階段為炎癥反應，主要包括中性粒細胞和巨噬細胞的浸潤以及炎性因子的分泌[14]。隨后進入增殖階段，首先是肉芽組織的增生，肉芽組織在組織損傷后 2～3 d內(nèi)即可出現(xiàn)[15]。病理結果也顯示卷毛小鼠3 d和7 d的肉芽組織生長極其旺盛，因此對皮膚愈合起到關鍵的推動作用。天狼猩紅染色結果能夠更好的顯示膠原修復的過程，其結果與HE染色結果相同，進一步印證了卷毛小鼠在創(chuàng)傷修復前期的修復能力強于對照小鼠。卷毛小鼠前期皮膚修復機制有待進一步深入研究。

綜上所述，BALB/c突變卷毛小鼠在皮膚創(chuàng)傷前期的愈合修復能力顯著強于對照BALB/c小鼠，因此我們可以推斷該突變基因不僅對該突變小鼠的皮膚組織和毛囊的發(fā)育周期產(chǎn)生了影響[16]，而且對皮膚創(chuàng)傷愈合能力也產(chǎn)生了促進作用，此結果為我們進一步研究突變基因?qū)ζつw的影響提供了理論基礎，同時也為BALB/c突變卷毛小鼠模型應用于皮膚創(chuàng)傷修復模型以及研究皮膚創(chuàng)傷愈合機制奠定了理論平臺。