任建勛，史雅紅，楊 斌，郭 浩，李 磊，孟紅旭，劉建勛

(中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100091)

急性心肌缺血是冠心病和心力衰竭的主要病理環(huán)節(jié)。心肌缺血后由于心臟神經(jīng)內(nèi)分泌功能的改變，可以出現(xiàn)心肌缺血后心室重構(gòu)、心肌肥厚以及心功能下降，甚至心力衰竭等病理改變。目前在非臨床研究中對(duì)心肌缺血后動(dòng)物心臟結(jié)構(gòu)和功能的評(píng)價(jià)手段和方法多采用有創(chuàng)的方式進(jìn)行，缺乏快捷、直觀、無創(chuàng)的方式而無法貼近臨床，且耗費(fèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量較多。本研究通過運(yùn)用心臟超聲不同指標(biāo)分析大鼠急性心肌缺血后心臟結(jié)構(gòu)和功能的變化特點(diǎn)，進(jìn)一步證實(shí)超聲影像學(xué)檢查在小動(dòng)物心臟和結(jié)構(gòu)功能評(píng)價(jià)中的準(zhǔn)確性和可靠性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6周齡SD大鼠，36只，雄性，SPF級(jí)，體重180 ～ 200 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供[SCXK(京)2016-0006]。無菌手術(shù)在中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施進(jìn)行[SYXK(京)2015-0011]。本研究在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)過程中完全做到按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用“減少、替代和優(yōu)化”3R原則給予人道的關(guān)懷，并經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(No. 2018XLC003-2)。

1.2 主要試劑與儀器

ALC-V8型小動(dòng)物呼吸機(jī)，上海奧爾科特生物技術(shù)有限公司；Vevo 2100小動(dòng)物超聲影像系統(tǒng)，日本富士膠片有限公司；IDA-2000數(shù)字醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，北京正恒博誠科技發(fā)展有限公司；氨基末端腦鈉肽前體(NT-proBNP)ELISA檢測試劑盒，英國Abbexa有限公司，批號(hào)256287；地爾硫卓(合心爽)，天津田邊制藥有限公司，批號(hào)1107050；0.5%伊文氏藍(lán)溶液，美國Amresco公司，北京索萊寶公司進(jìn)口分裝，批號(hào)：20180410；2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)，美國Amresco公司，北京索萊寶公司進(jìn)口分裝，批號(hào)：1101K031。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大鼠心肌缺血模型的建立[1]

大鼠麻醉后仰位固定，插入氣管插管，連接呼吸機(jī)行人工呼吸。隨后對(duì)大鼠行開胸手術(shù)，切斷第3、4肋，打開心包膜，暴露心臟并按壓胸腹擠出心臟，在肺動(dòng)脈圓錐和左心耳之間，于冠狀動(dòng)脈左前降支根部穿線(0號(hào)縫合線)以備結(jié)扎，待大鼠穩(wěn)定5 min后行冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎。心臟直視下觀察到心臟表面由紅潤變?yōu)樯n白，為心肌缺血模型成功。假手術(shù)組只在冠狀動(dòng)脈左前降支根部穿線并不結(jié)扎，隨后縫合關(guān)閉胸腔。正常飲食飲水喂養(yǎng)。

1.3.2 分組與給藥

SD大鼠按照體重隨機(jī)分為3組，12只/組，分別為假手術(shù)組(給予等體積生理鹽水灌胃，10 mL/kg)；模型組(給予等體積生理鹽水灌胃，10 mL/kg)；陽性對(duì)照藥地爾硫卓(10 mg/kg)。以上各組動(dòng)物冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法誘導(dǎo)心肌缺血模型成功后第2天，所采用的干預(yù)藥物均以生理鹽水配至所需濃度，給藥體積為10 mL/kg，連續(xù)灌胃給藥15 d，進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的測定。

1.3.3 心臟超聲

各組大鼠連續(xù)灌胃15 d后進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢查[2]。大鼠麻醉后仰臥位固定于恒溫加熱板上，四肢與心電圖電極相連用于監(jiān)測心率并記錄心電圖。采用Vevo 2100小動(dòng)物超聲儀進(jìn)行心臟超聲檢查。大鼠胸前脫毛后軀體左傾30°并涂抹超聲耦合劑，超聲探頭置于胸骨左側(cè)，與胸骨中線成10°～30°，顯示胸骨左室長軸切面。在左心室長軸切面上應(yīng)用M型超聲，使取樣線在二尖瓣腱索水平穿過左前側(cè)壁和后側(cè)壁，記錄左心室運(yùn)動(dòng)曲線并進(jìn)行測量；隨后探頭順時(shí)針旋轉(zhuǎn)90°，并做適度調(diào)整以顯示左室短軸切面，于左心室乳頭肌短軸切面使用解剖M型超聲，使取樣線穿過前間隔和后側(cè)壁。由二維圖像引導(dǎo)，取M型曲線記錄左心室運(yùn)動(dòng)曲線并進(jìn)行測量，測量左心室射血分?jǐn)?shù)(EF)，左心室短軸縮短率(FS%)，每搏輸出量(SV)，心輸出量(CO)，左心室舒張末期和收縮末期內(nèi)徑(LVIDd和LVIDs)，舒張末期和收縮末期左心室后壁厚度(LVPWd和LVPWs)，舒張末期和收縮末期左室前壁厚度(LVAWd和LVAWs)。

1.3.4 血清氨基末端腦鈉肽前體(NT-proBNP)測定

各組大鼠連續(xù)灌胃15 d后，通過麻醉后經(jīng)大鼠腹主動(dòng)脈抽取全血3 mL，常溫3000 r/min離心15 min，取上清，采用ELISA法測定血清NT-proBNP水平，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.5 改良TTC染色

參考文獻(xiàn)方法[3]，各組大鼠在腹主動(dòng)脈取血快速處死后開胸直視下向左心室和右心室分別注射1% TTC磷酸鹽緩沖溶液共計(jì)1 mL；隨后從大鼠下腔靜脈注射0.5%伊文思藍(lán)溶液2 mL，當(dāng)大鼠口唇變藍(lán)時(shí)取出心臟，用生理鹽水沖洗多余染料，用吸水濾紙吸干多余水分，置于-70℃冰箱速凍15 min，在心臟結(jié)扎線以下垂直心臟長軸切取5片厚度約2 mm心肌組織片，采用數(shù)字醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，以固定象距測量心肌總面積及左心室腔面積，計(jì)算左心室腔面積占心肌總面積的百分比(%)。

1.3.6 病理學(xué)觀察

各組大鼠在腹主動(dòng)脈取血后快速處死，將大鼠左肋剪開，暴露心臟，用眼科剪子將心臟取出，于心臟結(jié)扎線下遠(yuǎn)心端1/3處取少量心肌組織放入4%多聚甲醛溶液固定，乙醇脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片，經(jīng)過脫蠟、二甲苯透明等過程，進(jìn)行HE常規(guī)染色，于光鏡下觀察病理變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 超聲心動(dòng)圖各項(xiàng)參數(shù)的變化

大鼠術(shù)后，假手術(shù)組大鼠10只無死亡發(fā)生，模型組大鼠死亡5只，地爾硫卓組大鼠死亡4只。手術(shù)死亡率為34.6%。術(shù)后15 d左心室心臟超聲顯示，在左心室長軸切面上，假手術(shù)組大鼠心尖部呈圓錐狀，心肌收縮有力，心室前壁和后壁心肌厚度接近，左心室腔內(nèi)結(jié)構(gòu)正常。左心室短軸切面上心腔內(nèi)乳頭肌清晰可見，M型超聲左心室運(yùn)動(dòng)曲線顯示前壁和后壁運(yùn)動(dòng)幅度較大，呈現(xiàn)對(duì)稱性。見圖1A和1B。模型組大鼠心尖部呈鈍圓，心室腔擴(kuò)大，心室前壁相比假手術(shù)組變薄，無收縮與舒張，周圍心肌組織收縮帶動(dòng)其運(yùn)動(dòng)。左心室短軸切面上心室腔明顯擴(kuò)大，心室前壁組織變薄，無收縮與舒張。M型超聲左心室運(yùn)動(dòng)曲線顯示前壁運(yùn)動(dòng)幅度明顯降低，后壁運(yùn)動(dòng)幅度正常或稍下降。地爾硫卓組大鼠心尖部呈鈍圓，心室前壁相比模型組厚度增加，后壁心肌厚度相比假手術(shù)組明顯改變，心室腔擴(kuò)大。左心室短軸切面上心室腔有一定程度的擴(kuò)大，心室前壁組織變薄，心肌收縮幅度不大。M型超聲左心室運(yùn)動(dòng)曲線顯示前壁運(yùn)動(dòng)幅度明顯降低，后壁運(yùn)動(dòng)相比假手術(shù)組無明顯變化。見圖1。

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠LVIDd和LVIDs明顯增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；同時(shí)LVAWd和LVAWs，LVPWd和LVPWs也明顯降低(P<0.05或P<0.01)。與模型組比較，地爾硫卓組大鼠LVIDd和LVIDs明顯下降，同時(shí)LVAWd和LVAWs明顯增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠EF、FS、SV與CO明顯下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，地爾硫卓組大鼠EF、FS、SV與CO明顯增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見表2。

2.2 血清NT-proBNP水平變化

與假手術(shù)組比較，模型組動(dòng)物血清NT-proBNP水平明顯升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，地爾硫卓組大鼠血清NT-proBNP水平明顯降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

2.3 心肌梗死后心室重構(gòu)的變化

大鼠心肌缺血后，心臟左心室出現(xiàn)明顯的重構(gòu)，心室壁變薄、塌陷。心肌組織橫切面顯示左心室冠狀動(dòng)脈結(jié)扎部位一下區(qū)域心室壁明顯變薄，左心室腔明顯增大，冠脈結(jié)扎處遠(yuǎn)端的心尖部位心肌重構(gòu)變化不明顯。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心室腔面積與心室腔占心臟面積百分比明顯升高，同時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，地爾硫卓組大鼠心室腔面積與心室腔占心臟面積百分比明顯升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3和圖2。

2.4 心肌組織病理形態(tài)觀察

在心尖部分組織病理觀察中，假手術(shù)組大鼠心肌著色均勻，細(xì)胞形態(tài)及間質(zhì)結(jié)構(gòu)正常，心肌纖維清晰可見，排列整齊。模型組大鼠心肌橫紋消失，肌束斷裂，心肌纖維明顯紊亂，伴有不同程度的心肌細(xì)胞壞死，有大量的炎細(xì)胞浸潤，心肌纖維間可見膠原纖維，以及結(jié)締組織增生。地爾硫卓組大鼠，心肌纖維較紊亂，部分心肌細(xì)胞增大，心肌纖維間有一定的結(jié)締組織增生，心肌纖維化相對(duì)較輕,有少量的炎細(xì)胞浸潤。見圖3。

注：A：假手術(shù)組(左心室長軸B型超聲)；B：假手術(shù)組(左心室短軸M型超聲)；C：模型組(左心室長軸B型超聲)；D：模型組(左心室短軸M型超聲)；E：地爾硫卓組(左心室長軸B型超聲)；F：地爾硫卓組(左心室短軸M型超聲)。圖1 各組大鼠心臟超聲檢測圖Note. A, Sham group (B-model in left ventricular long-axis). B, Sham group (M-model in left ventricular short-axis). C, Model group(B-model in left ventricular long-axis). D, Model group(M-model in left ventricular short-axis). E, Diltiazem group(B-model in left ventricular long-axis). F, Diltiazem group(M-model in left ventricular short-axis).Figure 1 The ultrasound cardiogram results in different groups

Table1Comparison of cardiac structure in the different groups

組別Groupsn劑量(mg/kg)Dose 左室舒張末期內(nèi)徑(mm)LVIDd左室收縮末期內(nèi)徑(mm)LVIDs左室舒張末期后壁厚度(mm)LVPWd左室收縮末期后壁厚度(mm)LVPWs左室舒張末期前壁厚度(mm)LVAWd左室收縮末期前壁厚度(mm)LVAWs假手術(shù)組Sham group10-7.37±1.154.38±1.302.01±0.373.55±0.452.08±0.323.47±0.24模型組Model group8-12.32±1.94??9.79±1.08??1.71±0.39?3.17±0.31?1.07±0.46??2.14±0.33??地爾硫卓組Diltiazem group9109.78±2.17#7.36±1.71#1.88±0.413.25±0.401.45±0.55#2.57±0.29#

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

Note. Compared with the sham group,*P<0.05，**P<0.01. Compared with the model group,#P<0.05,##P<0.01.

表2 各組大鼠心臟功能變化的比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

Note. Compared with sham group,*P<0.05，**P<0.01. Compared with model group,#P<0.05,##P<0.01.

表3 各組大鼠血清NT-proBNP水平及心肌梗死面積變化的比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

Note. Compared with the sham group,*P<0.05，**P<0.01. Compared with the model group,#P<0.05,##P<0.01.

圖2 大鼠心肌缺血后左心室重構(gòu)Figure 2 Ventricular remodeling after myocardial ischemia in the rats

注：A：假手術(shù)組；B：模型組；C：地爾硫卓組。圖3 各組大鼠心肌組織病理形態(tài)(×100)Note. A, Sham group. B, Model group. C, Diltiazem group.Figure 3 Pathological changes in cardiac tissue in the different groups

3 討論

缺血性心力衰竭作為各種心臟病發(fā)展的嚴(yán)重階段，其5年存活率與惡性腫瘤相仿。因此深入探討缺血性心血管疾病病理生理機(jī)制及藥物干預(yù)作用是當(dāng)前研究的重點(diǎn)。大鼠因?yàn)槠鋬r(jià)廉易得、易飼養(yǎng)、對(duì)外來性損傷的耐受性好，基因組、心臟的解剖生理與人類相似等優(yōu)點(diǎn)而成為研究缺血性心力衰竭實(shí)驗(yàn)研究動(dòng)物的首選[4]。本研究選用結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支，誘導(dǎo)左心室前壁急性缺血建立心肌缺血后心力衰竭動(dòng)物模型是缺血性心血管疾病比較常用的研究方法之一[5]。該方法在冠狀動(dòng)脈結(jié)扎位置的選取不當(dāng)易造成大鼠急性心肌缺血范圍過大而導(dǎo)致死亡，這種情況在本研究中也得以證實(shí)。模型建立過程中為了避免死亡率過高，可以在冠狀溝與左心耳下緣在左心室表面投影交叉處，偏心尖部1～2 mm處進(jìn)行冠狀動(dòng)脈的結(jié)扎；其次還應(yīng)在直視下對(duì)搏動(dòng)的心臟稍加固定，確保冠脈結(jié)扎的位置和結(jié)扎線在心肌中適當(dāng)?shù)纳疃群涂缍?。但是在心肌缺血病理變化下如何更好地評(píng)價(jià)動(dòng)物模型心臟的收縮與舒張功能，實(shí)現(xiàn)無創(chuàng)、連續(xù)、直觀觀察，還需要進(jìn)一步研究。

既往研究主要是通過心肌組織染色，病理觀察及導(dǎo)管心室內(nèi)壓測定等方式實(shí)現(xiàn)對(duì)心肌缺血模型和藥物干預(yù)作用的評(píng)價(jià)[6-7]。目前采用超聲心動(dòng)圖檢查已經(jīng)成為評(píng)估大鼠心血管疾病以及心肌病模型的心室結(jié)構(gòu)和功能常用的無創(chuàng)性檢測手段[8]。但是本研究采用新型小動(dòng)物超聲獲取心臟影像的分辨率較高。在心臟結(jié)構(gòu)和功能觀察方面更加清晰、直觀；可以在心臟影像中區(qū)分心臟結(jié)構(gòu)，明顯分辨出心臟瓣膜、心內(nèi)膜、心腔邊緣和心室壁厚度。在本研究中首先能夠清晰的展示大鼠心臟的正常結(jié)構(gòu)，可以分別從M型和B型心臟超聲2個(gè)方面對(duì)大鼠正常心臟長軸和短軸解剖結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行多個(gè)參數(shù)的分析；并通過系統(tǒng)軟件測量獲取3個(gè)甚至5個(gè)以上的與心臟結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的參數(shù)，這較以往大鼠心臟超聲研究更加準(zhǔn)確，全面的反應(yīng)生理或病理狀態(tài)下心臟各方面的改變。隨后通過冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎的方式展示大鼠缺血性心力衰竭心臟長軸M型和B型和短軸M型超聲的特點(diǎn)，這在國內(nèi)許多小動(dòng)物超聲研究中并未有明確的體現(xiàn)出，也與國外相關(guān)的研究方法保持一致[9]。結(jié)果也證實(shí)，大鼠心肌缺血后出現(xiàn)明顯的心功能下降，表現(xiàn)在EF、FS以及SV和CO顯著下降；在心力衰竭發(fā)展過程中心室結(jié)構(gòu)也出現(xiàn)明顯改變，如梗死區(qū)及相關(guān)區(qū)域心室壁變薄、收縮與舒張幅度下降，心室腔擴(kuò)大等。這些在慢性心衰過程中表現(xiàn)出的心臟超聲影像學(xué)方面的變化特點(diǎn)在本研究得以充分的體現(xiàn)，并和心臟整體染色分析結(jié)果都可以相互印證。這也提示心肌缺血后心功能下降，長期外周組織灌注不足，促使腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)激活，出現(xiàn)心室重構(gòu)和擴(kuò)張的改變[10-11]。在心肌組織染色中也證明心肌梗死區(qū)域的心室壁變薄、心室腔擴(kuò)大的變化，這與心臟超聲的結(jié)果具有一致性。在心室重構(gòu)和擴(kuò)張的同時(shí)，心室壁壓力或容量負(fù)荷不斷增加，左室牽張和室壁張力變化誘導(dǎo)心室心肌細(xì)胞NT-proBNP分泌[12-13]。研究顯示，NT-proBNP是心力衰竭的獨(dú)立預(yù)測因子，能比較準(zhǔn)確地反映心力衰竭的嚴(yán)重程度，與心室壁壓力和心臟負(fù)荷升高呈正相關(guān)[14-15]。本研究中大鼠血清NT-proBNP明顯升高也有效支持了缺血性心力衰竭模型評(píng)價(jià)，與已有的研究結(jié)論類似[16]。需要說明的是，本研究主要評(píng)價(jià)大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎誘導(dǎo)左心室前壁急性缺血，導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)與功能的異常變化。為了排除冠狀動(dòng)脈下穿線對(duì)心肌組織損傷的影響，把開胸及心肌穿線手術(shù)本身造成的影響考慮進(jìn)去，采用假手術(shù)組而不是空白組作為對(duì)照則更加符合本研究的目的。目前認(rèn)為地爾硫卓能過抑制心肌缺血后鈣超載而保護(hù)心肌細(xì)胞[17]。本研究也顯示在大鼠心肌缺血后給予地爾硫卓干預(yù)，病理分析心肌細(xì)胞的壞死以及炎細(xì)胞的浸潤明顯減少，血清NT-proBNP明顯下降，均證明缺血性心力衰竭程度有所改善；表現(xiàn)在心臟超聲指標(biāo)中EF、FS以及SV和CO升高，左室內(nèi)徑縮小，心室壁變薄程度降低等。這從藥物干預(yù)角度證實(shí)心臟超聲評(píng)價(jià)缺血性心力衰竭的特點(diǎn)和優(yōu)勢。

綜合上述，本研究采用大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎方法引起心力衰竭，結(jié)合心肌組織染色和心力衰竭血清生物學(xué)標(biāo)志物檢測，分析心臟超聲中不同參數(shù)和心臟影像的變化特點(diǎn)。說明本研究采用高分辨率心臟超聲可以更好的準(zhǔn)確、動(dòng)態(tài)持續(xù)檢測心力衰竭過程中心臟結(jié)構(gòu)和功能變化，這有利于進(jìn)一步客觀觀察其發(fā)展中病理生理特點(diǎn)和藥物干預(yù)的效果。