鄭家雷 莫緩緩 楊楊 蘇方 方向 孫國(guó)平

1蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科（安徽蚌埠233003）；2中國(guó)科技大學(xué)附屬第一醫(yī)院老年消化科（合肥233001）；3安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科（合肥230022）

胃癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類(lèi)的健康。近年來(lái)，隨著幽門(mén)螺桿菌的根除和人們良好飲食習(xí)慣的形成，胃癌的發(fā)病率有所下降；但發(fā)病率仍高居全球腫瘤第四位，病死率位居第三位［1-2］。我國(guó)是胃癌高發(fā)國(guó)家之一，中國(guó)癌癥數(shù)據(jù)（2015年度）報(bào)告指出，我國(guó)每年胃癌預(yù)估新發(fā)病例近70萬(wàn)，死亡病例約50萬(wàn)，發(fā)病率和病死率在惡性腫瘤中均高居第二位［3］?；煵粌H能夠有效提高進(jìn)展期胃癌患者的治愈率和生存質(zhì)量，而且能延長(zhǎng)患者的生存期［4］；但是作為胃癌常見(jiàn)的化療藥物鉑類(lèi)是是高致吐藥物，發(fā)生消化道不良反應(yīng)的機(jī)率極高；常見(jiàn)的的臨床癥狀，如惡心嘔吐、腹脹、便秘及腹瀉等明顯影響到患者的生存質(zhì)量，甚至影響化療進(jìn)程。近年來(lái)研究認(rèn)為化療所致的這些消化道不良反應(yīng)可能與失調(diào)的腸道菌群有密切聯(lián)系［5］。因此，在胃癌患者的化療方案中能否通過(guò)加入益生菌調(diào)節(jié)腸道菌群數(shù)量變化，減少化療藥物所致的胃腸道不良反應(yīng)，目前此類(lèi)研究較少見(jiàn)。本研究通過(guò)對(duì)進(jìn)展期胃癌患者化療前后腸道主要菌群數(shù)量的變化以及化療后生存質(zhì)量、營(yíng)養(yǎng)狀況和不良反應(yīng)進(jìn)行觀察和分析；探討雙歧桿菌對(duì)進(jìn)展期胃癌患者化療后的腸道菌群數(shù)量、生存質(zhì)量、營(yíng)養(yǎng)狀況和不良反應(yīng)的影響。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象選取2015年7月至2017年6月于蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科收治的82例中晚期胃癌患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡≥18歲且≤75歲；（2）所有患者均經(jīng)病理及臨床確診的進(jìn)展期胃癌患者；（3）初診擬行化療，既往未行手術(shù)及化療；（4）入選前1個(gè)月內(nèi)未使用過(guò)益生元、益生菌和抗生素；（5）糞便常規(guī)檢查無(wú)異常，且無(wú)腸道菌群紊亂癥狀如腹脹、腹瀉。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）既往曾行手術(shù)及化療；（2）有腸道菌群紊亂癥狀如腹脹、腹瀉；（3）1個(gè)月內(nèi)使用抗生素；（4）有免疫系統(tǒng)疾病、糖尿病、肥胖等代謝疾病者；（5）伴有嚴(yán)重心腦血管疾病、全身多臟器功能衰竭及嚴(yán)重感染性疾病不能耐受化療者。

1.2研究分組納入研究對(duì)象根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為對(duì)照組42例及觀察組40例。對(duì)照組患者使用FOLFOX6化療方案，具體方案為：奧沙利鉑85 mg/m2靜脈滴注 2 h，d1；亞葉酸鈣 200 mg/m2，靜滴2 h，d1-2；亞葉酸鈣結(jié)束后即刻5-FU 400 mg/m2，靜脈推注，d1；5-FU 2.4 g/m2，微量泵持續(xù)靜推46 h，d1-2。2周方案，2周期后療效評(píng)估（準(zhǔn)確記錄滴注開(kāi)始和結(jié)束時(shí)間、藥物、藥量等）?；熎陂g均予常規(guī)止吐等對(duì)癥治療。觀察組患者予以對(duì)照組同樣化療并口服雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊（上海信宜藥廠(chǎng)有限公司）至化療結(jié)束停止；雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊用法用量參照說(shuō)明書(shū)予以2粒，口服，2次/d。所有患者均接受至少2個(gè)周期化療。

1.3主要試劑及儀器主要試劑：大便基因組提取試劑盒（TIANGEN）、Taq plus PCR Master-Mix、SYBR Green I Mastex、引物合成（上海生工）。主要儀器：紫外分光光度計(jì)（日立公司），實(shí)時(shí)定量PCR儀（美國(guó)Applied Biosystems公司）、低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）、電子天平（國(guó)產(chǎn)）、移液器（德國(guó)Eppendorf公司）。

1.4研究方法（1）標(biāo)本采集：所有研究對(duì)象化療前后均使用無(wú)菌凍存管留取中段糞便1次，3 g以上，凍存于-20℃冰箱。（2）大便標(biāo)本DNA提?。喝?.5 g糞便，使用北京天根生化科技有限公司的細(xì)菌DNA提取試劑盒提取糞菌DNA。提取的大便菌群DNA繼續(xù)放入-20℃冰箱內(nèi)凍存。（3）引物設(shè)計(jì)與合成：參照既往文獻(xiàn)和相關(guān)報(bào)道，應(yīng)用Gene Bank數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，篩選出特異性強(qiáng)的引物信息，由上海生工生物公司合成，見(jiàn)表1。（4）待測(cè)大便樣品：16S rDNA的定量分析，提取的糞菌的DNA分別進(jìn)行6種細(xì)菌的16S rDNA熒光定量PCR，每次實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)ddH2O代替DNA模板的陰性試驗(yàn)和標(biāo)準(zhǔn)品校正，每個(gè)樣品均同時(shí)做2個(gè)平行復(fù)孔。（5）反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件：優(yōu)化反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件，進(jìn)行SYBR Green為熒光染料的實(shí)時(shí)定量PCR。見(jiàn)圖1。

表1 腸內(nèi)6種目標(biāo)菌群的特異性引物序列Tab.1 Sequences of specific primers for seven target intestinal flora

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)輸入SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)法比較組間差異；計(jì)數(shù)資料用例數(shù)表示，應(yīng)用χ2比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1納入研究病例的一般資料對(duì)照組及觀察組在性別比例、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、家族史等基線(xiàn)資料間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。

圖1 熒光定量PCR溶解曲線(xiàn)Fig.1 Fluorensece quantitive PCR dissolution curve

2.2 雙歧桿菌對(duì)胃癌患者化療前后腸道菌群的影響對(duì)照組胃癌患者化療后腸道糞便中雙歧桿菌及乳酸桿菌數(shù)量明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而擬桿菌菌數(shù)量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；腸桿菌、腸球菌及葡萄菌組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表3。

表2 納入研究病例的一般資料Tab.2 General Information of subjects included in study x±s

觀察組胃癌患者化療后腸道糞便中雙歧桿菌、乳酸桿菌數(shù)量較前增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而葡萄球菌數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；腸桿菌、腸球菌及擬桿菌組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表3?；熀笥^察組胃癌患者大便中雙歧桿菌及乳酸桿菌數(shù)量較對(duì)照組明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而擬桿菌及葡萄球菌數(shù)量明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 雙歧桿菌對(duì)胃癌化療患者腸道菌群的影響Tab.3 Influence of bifidobacterium on intestinal flora in patients with gastric cancer undergoing chemotherapy x± s，LogN/g濕便

2.3 雙歧桿菌對(duì)胃癌患者化療療效的影響在化療療效方面，化療后觀察組40例胃癌患者中4例完全緩解，13例部分緩解，14例穩(wěn)定，9例進(jìn)展，近期有效率（CR+PR）為42.5%；對(duì)照組42例胃癌患者中3例完全緩解，13例部分緩解，16例穩(wěn)定，10例進(jìn)展，近期有效率（CR+PR）為38.1%；兩組間有效率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 雙歧桿菌對(duì)胃癌患者化療后不良反應(yīng)的影響在消化道不良反應(yīng)方面，化療后觀察組胃癌患者食欲減退、腹脹、腹瀉及便秘的發(fā)生率均明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩組間惡心、嘔吐及腹痛組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表4。觀察組未出現(xiàn)3級(jí)以上嘔吐及腹瀉，而對(duì)照組分別有3例。

2.5 雙歧桿菌對(duì)胃癌患者化療后實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的影響化療后觀察組胃癌患者肝功能損害、前白蛋白減少及大便隱血的發(fā)生率均明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；但兩組間白細(xì)胞減少、貧血、血小板減少及白蛋白減少的發(fā)生率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表5。

2.6 雙歧桿菌對(duì)胃癌患者生存質(zhì)量及營(yíng)養(yǎng)狀況的影響化療后觀察組胃癌患者生存質(zhì)量評(píng)分明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；化療后觀察組胃癌患者營(yíng)養(yǎng)評(píng)估得分及營(yíng)養(yǎng)不良的發(fā)生比例均明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表6。

表4 雙歧桿菌對(duì)胃癌患者化療后胃腸道不良反應(yīng)的影響Tab.4 Influence of bifidobacterium on gastrointestinal adverse reaction with gastric cancer undergoing chemotherapy例

表5 雙歧桿菌對(duì)胃癌患者化療后實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的影響Tab.5 Influence of bifidobacterium on laboratory indicators with gastric cancer undergoing chemotherapy 例

表6 雙歧桿菌對(duì)胃癌患者化療后生存質(zhì)量及營(yíng)養(yǎng)狀況的影響Tab.6 Influence of bifidobacterium on quality of life and nutritional status with gastric cancer undergoing chemotherapy x±s

3 討論

中國(guó)癌癥數(shù)據(jù)（2015年度）報(bào)告顯示我國(guó)胃癌新發(fā)病例和死亡病例均占全世界的40%以上［3］；由于早期胃癌診斷十分困難，大部分胃癌患者臨床確診時(shí)已處于中、晚期，目前國(guó)內(nèi)新診斷胃癌患者90%左右為進(jìn)展期［6］。以化療、放療、靶向治療結(jié)合的綜合治療在一定程度可以延長(zhǎng)患者生存期，改善其生活質(zhì)量；另一方面可以提高進(jìn)展期胃癌的治愈率［7］。鉑類(lèi)和5-FU等均是胃癌化療的基礎(chǔ)藥物，且兩者聯(lián)合應(yīng)用具有顯著的協(xié)同作用，但是聯(lián)合化療的療效和獲益已達(dá)到一定極限［8］，因?yàn)槲赴┞?lián)合化療的不良反應(yīng)，如腹瀉、便秘、腹脹、骨髓抑制及惡心嘔吐等，輕則影響患者生存質(zhì)量、加重或?qū)е聽(tīng)I(yíng)養(yǎng)不良，重則影響到患者化療進(jìn)程甚至危及生命［9］。

腸道內(nèi)益生菌群在體內(nèi)具有潛在抑制結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的作用［10-11］。目前沒(méi)有相關(guān)研究提示胃癌的發(fā)生、發(fā)展與腸道中的某特定菌群有直接或間接的關(guān)系，但有研究［12］認(rèn)為健康受試者大便菌群與胃癌患者有差異，說(shuō)明化療前胃癌患者的腸道菌群已屬紊亂狀態(tài)。STRINGER等［13］研究發(fā)現(xiàn)接受不同化療方案出現(xiàn)胃腸道不良反應(yīng)的不同惡性腫瘤患者的糞便中乳酸桿菌、雙歧桿菌的數(shù)量均明顯下降。本研究也發(fā)現(xiàn)，化療后的對(duì)照組雙歧、乳酸桿菌的數(shù)量減少，而擬桿菌數(shù)量上升，表明FOLFOX6方案可抑制胃癌患者腸道有益菌群的生長(zhǎng)，促進(jìn)條件菌群的生長(zhǎng)，導(dǎo)致腸道菌群紊亂加重。而陳春華等［14］的研究結(jié)果顯示，失調(diào)的腸道菌群會(huì)導(dǎo)致腹瀉、嘔吐、惡心等并發(fā)癥，甚至?xí)霈F(xiàn)嚴(yán)重的腸菌移位感染，常規(guī)的止吐及止瀉治療效果有限。但本研究結(jié)果顯示兩組間惡心、嘔吐及腹痛的發(fā)生率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且觀察組未出現(xiàn)3級(jí)以上嘔吐及腹瀉，而對(duì)照組分別有3例。提示胃癌使用FOLFOX6方案化療同時(shí)額外補(bǔ)充益生菌能減少3級(jí)以上消化道不良反應(yīng)發(fā)生的趨勢(shì)，此結(jié)論有待擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步證實(shí)。

本研究在觀察組胃癌患者化療過(guò)程中全程予以雙歧桿菌乳桿菌常規(guī)劑量口服；化療后觀察組患者腸道糞便中雙歧桿菌較化療前有所升高，葡萄球菌則明顯降低；且觀察組的雙歧桿菌、乳酸桿菌明顯高于對(duì)照組，而擬桿菌及葡萄球菌數(shù)量則明顯減少。研究結(jié)果顯示補(bǔ)充外源性雙歧桿菌乳桿菌能夠糾正胃癌患者化療所致的腸道菌群失調(diào)，提示對(duì)胃癌患者化療所致的腸道菌群紊亂具有預(yù)防作用。雙歧桿菌是一種具有抗腸道酶類(lèi)消化和抗胃酸作用的重要益生菌，通過(guò)其細(xì)胞壁黏附于腸黏膜上皮細(xì)胞，并調(diào)節(jié)腸道黏膜免疫反應(yīng)；一方面維護(hù)了腸黏膜穩(wěn)定的屏障功能，另一方面保證腸黏膜通透性處于正常水平［15］。許春進(jìn)等［12］在胃癌患者化療過(guò)程中加用益生菌，可糾正腸道菌群紊亂，降低消化道不良反應(yīng)的發(fā)生率，且未增加明顯其他不良反應(yīng)。

本試驗(yàn)在胃癌患者化療全程中常規(guī)劑量口服雙歧桿菌乳桿菌，在消化道不良反應(yīng)方面，化療后觀察組患者食欲減退、腹脹、腹瀉及便秘的發(fā)生比例明顯低于對(duì)照組；提示胃癌患者化療全程中額外補(bǔ)充口服雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊可通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群失調(diào)降低化療所致的消化道不良反應(yīng)。在生存質(zhì)量及營(yíng)養(yǎng)狀況方面，化療后觀察組胃癌患者生存質(zhì)量評(píng)分、營(yíng)養(yǎng)評(píng)估得分及營(yíng)養(yǎng)不良的發(fā)生比例均明顯高于對(duì)照組。因此，胃癌FOLFOX6化療過(guò)程中輔以雙歧桿菌可以減少患者胃腸道不良反應(yīng)，改善患者的生存質(zhì)量；并且可以提高患者對(duì)化療的耐受性，促進(jìn)患者完成化療周期。MARTIN等［16］研究認(rèn)為增加腸道內(nèi)益生菌雙歧和乳酸菌數(shù)量，可促進(jìn)腸粘膜屏障的恢復(fù)，通過(guò)增加益生菌群數(shù)量增強(qiáng)其抗炎作用，同時(shí)減少條件菌群如腸桿菌的數(shù)量降低內(nèi)毒素的產(chǎn)量，從而減輕肝功能損害。本研究在實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)方面，化療后治療組胃癌患者肝功能損害、前白蛋白減少及大便隱血的發(fā)生率均明顯低于對(duì)照組；提示雙歧桿菌乳桿菌在胃癌患者化療過(guò)程中可通過(guò)調(diào)節(jié)患者腸道菌群改善化療導(dǎo)致的肝功能損害、前白蛋白合成以及腸道黏膜損傷。在生存質(zhì)量及營(yíng)養(yǎng)狀況方面，研究結(jié)果顯示化療后治療組胃癌患者的生存質(zhì)量及營(yíng)養(yǎng)評(píng)分優(yōu)于對(duì)照組；考慮主要原因可能一方面與患者消化道不良反應(yīng)減少而攝入增加有關(guān)，另一方面與腸道菌群紊亂的糾正有關(guān)，因?yàn)槿梭w很多必須氨基酸的合成及脂質(zhì)的吸收均與腸道菌群有關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明FOLFOX6方案可抑制胃癌腸道菌群的正常生長(zhǎng)，進(jìn)一步降低腸內(nèi)益生菌群數(shù)量，加重益生和條件菌群的比例失調(diào)；口服雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊可增加化療過(guò)程中胃癌患者腸道內(nèi)益生菌數(shù)量，降低條件菌數(shù)量，從而預(yù)防和糾正菌群失調(diào)。由于本實(shí)驗(yàn)樣本量小，隨訪(fǎng)時(shí)間短、且未進(jìn)行多中心臨床研究，結(jié)果一定程度上存在偏倚，研究結(jié)論還待進(jìn)一步重復(fù)驗(yàn)證。