王君蓮 宋曉暉 吳波 柴建蘭

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢兒童醫(yī)院（武漢市婦幼保健院）婦產(chǎn)科（武漢430071）

宮頸癌是最常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病呈年輕化的趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅女性生殖健康［1］。研究宮頸癌細(xì)胞中的關(guān)鍵分子的調(diào)控機(jī)制，對(duì)深入了解宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展過程及靶向治療具有重要意義。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（LncRNA）是一類超過200個(gè)核苷酸的長(zhǎng)鏈非編碼RNA，大量研究證實(shí)LncRNA與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展顯著相關(guān)［2］。LncRNA在宮頸癌中的研究尚處于初級(jí)階段，有望成為宮頸癌診斷和治療的重要靶點(diǎn)［3］。LINC00662是一種新發(fā)現(xiàn)的LncRNA，參與調(diào)控口腔鱗狀細(xì)胞癌、肺癌、胃癌等腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能［4-6］。LINC00662在宮頸癌中的表達(dá)情況和作用機(jī)制研究未見報(bào)道。本研究通過檢測(cè)宮頸癌組織和細(xì)胞系中LINC00662表達(dá)量，分析LINC00662在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及機(jī)制，旨在為宮頸癌的分子靶向治療提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 對(duì)象和方法

1.1研究對(duì)象

1.1.1組織樣本收集2016年11月至2018年3月在我院行外科手術(shù)的患者被切除的宮頸癌組織和配對(duì)的癌旁組織（距離腫瘤邊緣＞2 cm）39例，所有患者術(shù)前未進(jìn)行放、化療治療。采集的樣本于液氮保存，均被病理組織學(xué)診斷為宮頸癌。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意，所有患者均簽署了知情同意書。

1.1.2細(xì)胞系與試劑人宮頸癌細(xì)胞系（Hela、C33A、HCC94、SiHa）和人正常宮頸上皮細(xì)胞系H8均購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞資源中心。載有LINC00662的質(zhì)粒和陰性對(duì)照質(zhì)粒購(gòu)自上海吉瑪公司。Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑、DMEM/F12培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS）購(gòu)自美國(guó)Life Technologies公司。CCK-8試劑盒購(gòu)自上海東仁化學(xué)科技公司。qPCR相關(guān)試劑盒購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司。Transwell小室購(gòu)自美國(guó) Corning公司。一抗 β-Tubulin、DIRAS3、Cyclin D1、Cyclin A2、ZEB-1和ZEB-2抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染Hela、HCC94、SiHa細(xì)胞系傳代培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基，C33A、H8細(xì)胞系傳代培養(yǎng)于DMEM/F12培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在6孔培養(yǎng)板中接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCC94細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組（轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒）和觀察組（轉(zhuǎn)染載有LINC00662的質(zhì)粒），依據(jù)Lipofectamine 3000試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.2.2生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)LINC00662的靶基因采用DIANA TOOLS軟件預(yù)測(cè)LINC00662可靶向結(jié)合的微小RNA（miRNA）。采用TargetScan Release 3.1軟件預(yù)測(cè)對(duì)應(yīng)的miRNA可靶向結(jié)合的基因。

1.2.3熒光實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）抽提組織和細(xì)胞總RNA依據(jù)PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA行qPCR檢測(cè)。LINC00662上游引物為 5′-AGGACAGAATCTCCGTGGAC-3′，下游引 物 為 5′-TTGATCTTTTAGATTTCTGTCACACTC-3′；U6上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；GAPDH上游引物為 5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游引物為 5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′；miR-409-5p上游引物為 5′-GGGAGGTTACCCGAGCAACT-3′，下游引物為 5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；DIRAS3上游引物為 5′-GATTACCGCGTCGTGGTAGTC-3′，下游引物為 5′-TCAATGGTCGGCAGGTACTCA-3′。以GAPDH為內(nèi)參檢測(cè)LINC00662和DIRAS3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量，以U6為內(nèi)參檢測(cè)miR-409-5p的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）轉(zhuǎn)染操作48 h后，收集兩組并提取細(xì)胞總蛋白。每組上樣50 μg蛋白量至聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后采用5%脫脂牛奶封閉，分別加入一抗4℃孵育過夜。二抗室溫孵育2 h。在凝膠成像系統(tǒng)發(fā)光顯影。

1.2.5CCK-8檢測(cè)HCC94細(xì)胞增殖能力轉(zhuǎn)染操作48 h后，收集并調(diào)整細(xì)胞密度至2×104個(gè)/mL。以每孔200 μL接種至96孔板，分別在接種后第1、2、3、4、5 d，分別加入 15 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)。4 h后吸去培養(yǎng)基，每孔加150 μL二甲基亞砜，采用酶聯(lián)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處每孔的吸光度（A）值。

1.2.6Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HCC94細(xì)胞侵襲能力將Matrigel基質(zhì)膠均勻鋪在Transwell上室，培養(yǎng)箱內(nèi)凝固。下室加600 μL新鮮培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染操作48 h后，重懸細(xì)胞并調(diào)整密度至2×105個(gè)/mL。在上室內(nèi)加細(xì)胞懸液200 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出上室，甲醇固定10 min，結(jié)晶紫溶液染色10 min，棉簽擦去未穿過濾膜細(xì)胞。光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選4個(gè)視野計(jì)細(xì)胞總數(shù)并取平均數(shù)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)計(jì)量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用兩樣本獨(dú)立t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1LINC00662在宮頸癌組織中的差異表達(dá)qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，LINC00662在癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)量是宮頸癌組織的0.32倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01，圖1）。

圖1 LINC00662在宮頸癌組織和配對(duì)的癌旁組織中的表達(dá)Fig.1 The expression of LINC00662 in cervical cancer and para-carcinoma tissues

2.2LINC00662在宮頸癌細(xì)胞系中的差異表達(dá)qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常宮頸上皮細(xì)胞系相比，LINC00662在宮頸癌細(xì)胞系中的表達(dá)均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖2）。

圖2 LINC00662在宮頸癌細(xì)胞系和正常宮頸上皮細(xì)胞中的表達(dá)Fig.2 The expression of LINC00662 in normal cervical epithelial cell and cervical cancer cell lines

2.3生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)LINC00662靶向結(jié)合的miRNA及靶基因本研究采用DIANA TOOLS和TargetScan Release 3.1軟件預(yù)測(cè)分析（圖3），LINC00662可靶向結(jié)合miR-409-5p，miR-409-5p可靶向結(jié)合DIRAS3 mRNA。

圖3 LINC00662靶向結(jié)合miR-409-5p的序列區(qū)域，miR-409-5p靶向結(jié)合DIRAS3 mRNA的序列區(qū)域Fig.3 The complementary binding sequence of LINC00662 and miR-409-5p,the complementary binding sequence of miR-409-5p and DIRAS3 mRNA

2.4LINC00662、miR-409-5p和DIRAS3 mRNA在兩組細(xì)胞中的表達(dá)qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，觀察組HCC94細(xì)胞LINC00662的表達(dá)明顯增加（P＜0.01），miR-409-5p的表達(dá)明顯減少（P＜0.01），DIRAS3 mRNA的表達(dá)明顯增加，提示高表達(dá)LINC00662可增加miR-409-5p的表達(dá)，降低DIRAS3 mRNA的表達(dá)。

2.5高表達(dá)LINC00662的細(xì)胞中DIRAS3蛋白的表達(dá)Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示（圖4），高表達(dá)LINC00662后，DIRAS3蛋白表達(dá)明顯增加，細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白Cyclin D1和Cyclin A2表達(dá)明顯減少，細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白ZEB-1和ZEB-2表達(dá)明顯減少。

圖4 高表達(dá)LINC00662對(duì)HCC94細(xì)胞DIRAS3蛋白及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of upregulated LINC00662 on the expression of DIRAS3 protein and related proteins in HCC94 cells

2.6高表達(dá)LINC00662可抑制細(xì)胞增殖能力CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示（圖5），接種后第3天開始，觀察組HCC94細(xì)胞吸光度顯著低于對(duì)照組HCC94細(xì)胞（P＜0.05），表明高表達(dá)LINC00662可抑制HCC94細(xì)胞增殖能力。

圖5 高表達(dá)LINC00662表達(dá)對(duì)HCC94細(xì)胞增殖能力的影響Fig.5 Effect of upregulated LINC00662 on the proliferation of HCC94 cells

2.7 高表達(dá)LINC00662可抑制細(xì)胞侵襲能力Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖6），對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯高于觀察組穿膜細(xì)胞數(shù)（P＜0.01），提示高表達(dá)LINC00662可抑制HCC94細(xì)胞的侵襲能力。

圖6 高表達(dá)LINC00662表達(dá)對(duì)HCC94細(xì)胞侵襲能力的影響Fig.6 Effect of upregulated LINC00662 on the invasion ability of HCC94 cells

3 討論

宮頸癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因參與的復(fù)雜生物學(xué)過程，要求從多種分子水平對(duì)其機(jī)制進(jìn)行研究［7］。近年來隨著對(duì)LncRNA的研究的越來越多，LncRNA的功能研究對(duì)于探索腫瘤的發(fā)生機(jī)理和尋求腫瘤治療靶點(diǎn)具有重要的臨床意義［8］。LIU等［2］發(fā)現(xiàn)LncRNA SNHG1在宮頸癌組織中表達(dá)明顯上調(diào)，可促進(jìn)腫瘤的增殖、遷移和侵襲。YANG等［9］的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，宮頸癌中LncRNA GAS5表達(dá)明顯下調(diào)，高表達(dá)LncRNA GAS5可通過干擾miR-196a和miR-205的表達(dá)，抑制宮頸癌的進(jìn)展。既往的研究表明，LINC00662在口腔鱗狀細(xì)胞癌、肺癌、胃癌等［4-6］多種腫瘤具有明顯的調(diào)控作用，表明LINC00662參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。關(guān)于LINC00662在宮頸癌中的功能尚不清楚。

本研究結(jié)果顯示，相較癌旁組織和正常宮頸上皮細(xì)胞系，LINC00662在宮頸癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)均明顯減少，表明LINC00662可能在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中具有一定的調(diào)控作用。LncRNA通過“海綿作用”吸附下游miRNA，抑制miRNA表達(dá)，是lncRNA發(fā)揮調(diào)控作用的重要機(jī)制之一［10］。本研究采用DIANA TOOLS軟件分析顯示，LINC00662可靶向結(jié)合 miR-409-5p。YU 等［11］研究發(fā)現(xiàn)，miR-409-5p在乳腺癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)顯著增加，低表達(dá)miR-409-5p具有抑制乳腺癌進(jìn)展的作用，發(fā)揮明顯的癌基因作用。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)LINC00662后，miR-409-5p的表達(dá)明顯減少，表明LINC00662可通過吸附miR-409-5p抑制其表達(dá)。微小RNA（miRNA）主要通過結(jié)合下游基因mRNA，干擾mRNA翻譯或者直接導(dǎo)致其降解，從而發(fā)揮抑制基因表達(dá)的作用。采用TargetScan Release 3.1軟件分析顯示，miR-409-5p可靶向結(jié)合 DIRAS家族 GTP酶 3（DIRAS family GTPase 3，DIRAS3）基因。DIRAS3基因定位為1號(hào)染色體lp31區(qū)域，由1個(gè)內(nèi)含子和2個(gè)外顯子組成，屬于Ras超家族成員［12］。DIRAS3在人體組織內(nèi)廣泛表達(dá)，在多種腫瘤組織中表達(dá)減少［13］。DIRAS3低表達(dá)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切，具有明顯的抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用［14］。本研究結(jié)果顯示，miR-409-5p的表達(dá)明顯減少后，DIRAS3 mRNA的表達(dá)明顯增加，提示miR-409-5p可能具有抑制DIRAS3表達(dá)的作用。DIRAS3蛋白具有抑制腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移的作用。本研究通過Western Blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DIRAS3蛋白表達(dá)增加后，細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白Cyclin D1和Cyclin A2表達(dá)明顯減少，細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白ZEB-1和ZEB-2表達(dá)明顯減少，均提示宮頸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力下降。為進(jìn)一步研究LINC00662在宮頸癌中的生物學(xué)功能，本研究通過CCK-8實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌HCC94細(xì)胞中高表達(dá)LINC00662后，HCC94細(xì)胞增殖能力和侵襲能力降低，說明LINC00662可能通過降低miR-409-5p、促進(jìn)DIRAS3基因的表達(dá)，參與調(diào)控宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展。

本研究首次發(fā)現(xiàn)LINC00662在宮頸癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)量明顯減少。宮頸癌細(xì)胞中，高表達(dá)LINC00662可明顯抑制其下游靶點(diǎn)miR-409-5p的表達(dá)，從而促進(jìn)DIRAS3基因的表達(dá)，抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。高表達(dá)LINC00662在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，可能成為宮頸癌治療的潛在靶點(diǎn)。