陸小娟 李其林 冼衛(wèi)明

暨南大學醫(yī)學院附屬廣州紅十字會醫(yī)院（廣州510220）

白癜風是一種常見的后天性色素脫失性皮膚黏膜病，世界人群發(fā)病率為0.5%～1%［1］。新近研究表明，過度活躍的T淋巴細胞導致自身免疫耐受機制異常，導致黑素細胞被破壞［2］，其中，輔助性T細胞17（Th17）和調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）是近年發(fā)現(xiàn)的白癜風發(fā)病相關的T淋巴細胞亞群，亦是目前研究的熱點之一。因該病對人的外觀產(chǎn)生較大的負面影響，給患者帶來嚴重的心理負擔，故對該病的治療備受醫(yī)療界關注。目前，準分子激光被廣泛應用于治療白癜風，其療效和安全性均優(yōu)于傳統(tǒng)療法［3］。復方甘草酸苷（compound glycyrrhizin，CG）可抑制炎癥反應，具有類固醇樣的作用，而無類固醇樣的副作用，因此可以合理地假設CG在治療白癜風中是有效的。大量學者研究308 nm準分子激光在白癜風免疫調(diào)節(jié)方面的作用機制，但308 nm準分子激光聯(lián)合CG對Th17/Treg細胞亞群的影響尚未見報道。本研究將308 nm準分子光聯(lián)合口服復方甘草酸苷（OCG）用于治療尋常型白癜風，觀察其臨床療效及安全性，并檢測治療前后尋常型白癜風患者外周血Th17/Treg細胞亞群的表達，初步探討其與尋常型白癜風發(fā)病的相關性。

1 對象與方法

1.1研究對象2016年1月至2018年6月，收集我院皮膚科門診就診的166例尋常型白癜風患者，其中男82例，女84例，年齡13～68歲，平均（28.9±13.4）歲，病程1個月～25年，平均（5.2±3.6）年，進展期83例，穩(wěn)定期83例。根據(jù)就診的先后順序隨機分為：聯(lián)合治療組（OCG+308 nm準分子激光）54例，其中進展期28例，穩(wěn)定期26例；對照Ⅰ組（308 nm準分子激光組）57例，其中進展期28例，穩(wěn)定期29例；對照Ⅱ組（OCG）55例，其中進展期27例，穩(wěn)定期28例。3組間年齡、性別、病程、病期等差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。健康對照組來自我院門診部的健康體檢者30例，其中男16例，女14例，年齡14～55歲，平均（30.19±8.67）歲。本研究符合本單位的倫理學標準并得到批準（穗紅院醫(yī)倫審2015-044-01），且已得到患者與家屬的知情同意。健康受試者與患者間在性別和年齡方面差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

1.2納入及排除標準納入標準：符合白癜風的診斷標準［4］，且皮損 ≥ 2處，受累面積＜20%體表面積。排除標準：（1）1個月內(nèi)進行過系統(tǒng)白癜風藥物治療，半個月內(nèi)進行過308 nm準分子照射治療及其他局部治療者；（2）合并嚴重心肺功能不全，嚴重肝腎功能衰竭，合并低鉀血癥、醛固酮增多癥、糖尿病、高血壓、慢性內(nèi)科疾病及伴有其他自身免疫性疾病或嚴重系統(tǒng)疾病者；（3）使用免疫抑制劑及皮質(zhì)類固醇激素類藥物治療；（4）對OCG類藥物過敏及對紫外線照射過敏者；（5）妊娠期、哺乳期婦女；（6）未完成治療及資料不全者。

1.3主要試劑及儀器308 nm準分子激光治療儀（Alma以色列飛頓），流式細胞儀（Beckman Coulter Epics XL美國），CD3-PerCP、CD-FITC、鼠IgGI-PE、IL-17-PE（bioscience美國），RPMI1640培養(yǎng)基（Gibco美國），胎牛血清（Gibco美國）。

1.4治療方案及評定標準

1.4.1治療方案聯(lián)合治療組及對照Ⅰ組用308 nm準分子激光治療儀（Alma，以色列飛頓）治療。聯(lián)合治療組在照射308 nm準分子激光的基礎上，予OCG（批準文號：國藥準字J20130077），50 mg/次，3次/d。對照Ⅱ組僅予OCG，劑量及用法如前。所有患者均連續(xù)治療12周，并注意防護眼睛、生殖器及正常皮膚。

1.4.2療效判定第4、8和12周進行臨床療效評價［5］，并進行不良反應評價。痊愈：白斑全部消退，恢復正常膚色；顯效：白斑部分消退或縮小，恢復正常膚色的面積占皮損總面積≥50%；好轉：白斑部分消退或縮小，恢復正常膚色的面積占皮損總面積＜50%；無效：白斑無變化或范圍擴大。有效率=（痊愈+顯效）/總例數(shù) ×100%。

1.5外周血采集及檢測抽取治療前后所有患者及健康對照者的空腹外周靜脈血5 mL，置于肝素鈉抗凝真空采血管中待檢。

1.5.1Treg細胞亞群檢測肝素抗凝全血，2 500 r/min，離心10 min，密度梯度離心法分離外周血單個核細胞（PBMC）。取1 mL PBMC，調(diào)整PBMC密度為2×106/mL。向待測淋巴細胞懸液同時加入10 μL CD4-FITC、CD25-PC5抗體，4 ℃避光孵育20 min，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌后，加入400 μL固定/穿膜液。置室溫避光40 min后，PBS洗滌，加入800 μL緩沖液，并在室溫避光20 min。重懸后，均分為2管，分別加入FoxP3-PE抗體和同型對照抗體，在室溫下避光孵育30 min，用PBS洗滌1次，加入300 μL PBS重懸并上機分析。

1.5.2Th17細胞亞群檢測肝素抗凝全血用RPMI1640 稀釋后，加入 25 μL PMA、20 μL 離子霉素、4 μL佛波酯（BFA），37 ℃孵育4～6 h。設同型對照管（A管）和檢測管（B管），每管分別加入2.5 μL CD3-PerCP和25 μL CD8-FITC，室溫避光孵育15 min，加入100 μL Fix&Pern中的ReagentA（固定液），室溫避光15 min。清洗后，每管加入100 μL Fix&Pern中的ReagentB（破膜和溶血液）。A管加入2.5 μL的鼠IgGI-PE，B管加入2.5 μL IL-17-PE，在室溫下避光放置15 min，沖洗后加入500 μL PBS重懸并上機分析。

1.6統(tǒng)計學方法使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。定量資料采用t檢驗，定性資料采用χ2檢驗，采用方差分析進行組間比較，數(shù)據(jù)用（x±s）表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1療效觀察聯(lián)合治療組總有效率顯著高于對照Ⅰ組、對照Ⅱ組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；且聯(lián)合治療組進展期、穩(wěn)定期有效率均高于同期對照Ⅰ組、對照Ⅱ組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而對照Ⅰ組、對照Ⅱ組間有效率比較 差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 3組患者臨床療效比較Tab.1 Comparison of clinical effects in three groups of patients 例

2.2不良反應聯(lián)合治療組有1例頭暈，1例胃部不適，3例局部皮膚瘙癢/燒灼感；對照Ⅰ組5例皮膚瘙癢/燒灼感；對照Ⅱ組1例頭暈，2例胃部不適，2例眼瞼水腫。以上不適，未經(jīng)治療均可自行緩解。3組不良反應發(fā)生率經(jīng)χ2檢驗，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.3治療前后Th17、Treg亞群改變（1）治療前，3組患者進展期和穩(wěn)定期的外周血CD4+IL-17A+、CD4+CD25+Foxp3+與健康對照組經(jīng)方差分析差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。進一步多重比較結果示：健康對照組與3組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），3組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05）。（2）治療后，3組進展期和穩(wěn)定期患者外周血CD4+IL-17A+與健康對照組經(jīng)方差分析差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），進一步多重比較結果示：健康對照組與聯(lián)合治療組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），與對照Ⅰ組、對照Ⅱ組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；3組間兩兩比較，聯(lián)合治療組與對照組Ⅰ組、Ⅱ組間均有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），而對照組Ⅰ組和Ⅱ組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。3組進展期患者外周血CD4+CD25+Foxp3+與健康對照組經(jīng)方差分析差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），進一步多重比較結果示：健康對照組與3組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；聯(lián)合治療組與對照Ⅰ組、對照Ⅱ組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而對照Ⅰ組和對照Ⅱ組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。3組穩(wěn)定期患者外周血CD4+CD25+Foxp3+與健康對照組經(jīng)方差分析差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），進一步多重比較結果示：健康對照組與3組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；3組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2、圖1。

3 討論

越來越多的研究證實，白癜風為自身免疫性疾病［6-7］。這表明白癜風可能與其他自身免疫性疾病具有相似的發(fā)病機制。研究表明，CD4+T細胞在白癜風的發(fā)病機制中起重要作用［8］。Th17細胞是近年發(fā)現(xiàn)的一類CD4+效應T細胞，因其高表達特異性促炎因子IL-17而得名，IL-17參與殺傷黑素細胞的炎癥反應，故在白癜風的發(fā)病中發(fā)揮作用［9］。CD4+CD25+T細胞是一群在Treg家族中具有免疫抑制作用的輔助性T細胞，其通過抑制效應T細胞的增殖來維持T細胞穩(wěn)態(tài)，維持自身耐受，其數(shù)量和功能的異常可致多種自身免疫病的發(fā)生，而Treg的免疫功能與Foxp3的持續(xù)表達密切相關。因此，Th17/Treg兩者的平衡或紊亂決定了機體的免疫狀態(tài)。

本研究顯示，治療前白癜風患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg明顯低于健康對照組，而CD4+IL-17A+T高于健康對照組，此結果與國內(nèi)外多項研究結果［10-12］一致。本研究亦映證了白癜風患者體內(nèi)存在Th17/Treg失衡的情況，兩者細胞數(shù)量的改變可能是白癜風免疫發(fā)病機制中的重要因素。既往研究［13］主要探討進展期白癜風患者體內(nèi)Th17/Treg的改變情況。本研究不僅證實進展期白癜風患者存在Th17/Treg失衡的情況，穩(wěn)定期白癜風患者亦存在上述情況。目前已有學者［14］發(fā)現(xiàn)Treg的功能障礙可能與HO-1的表達抑制有關，但引起Th17/Treg失衡的具體機制尚未清楚。筆者推測通過糾正白癜風患者紊亂的Th17/Treg細胞功能，將有助于白癜風患者病情的恢復。

圖1 健康對照組及白癜風患者Th17/Treg流式代表圖Fig.1 Flow chart of Th17/Treg detection in healthy control group and patients with vitiligo

表2 白癜風患者與對照組CD4+IL-17A+T，CD4+CD25+Foxp3+T細胞對比Tab.2 Comparison of CD4+IL-17A+T,CD4+CD25+Foxp3+T cells in patients with vitiligo and control group x ± s，%

通過308 nm準分子激光聯(lián)合OCG治療白癜風患者后發(fā)現(xiàn)：與治療前比，聯(lián)合治療組進展期及穩(wěn)定期患者外周血CD4+IL-17A+T顯著下降，進展期外周血CD4+CD25+Foxp3+顯著上升，與健康對照組比較差異無統(tǒng)計學意義，而穩(wěn)定期CD4+CD25+Foxp3+Treg仍低于健康對照組。表明308 nm準分子激光聯(lián)合OCG可調(diào)節(jié)白癜風患者紊亂的Th17/Treg細胞功能，尤其對Th17細胞亞群的調(diào)節(jié)更為顯著。本研究還顯示：單獨運用308 nm準分子激光或OCG治療白癜風，CD4+IL-17A+T、CD4+CD25+Foxp3+T細胞變化程度不及聯(lián)合治療組。此結果亦反映了聯(lián)合治療能產(chǎn)生更好的協(xié)同作用，更易使Th17/Treg細胞趨于平衡，有效地促進尋常型白癜風病情的好轉。

治療后分析3組的臨床療效，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療組總有效率明顯高于對照Ⅰ組及對照Ⅱ組，且聯(lián)合治療組進展期、穩(wěn)定期的有效率均顯著高于同期的對照Ⅰ組及對照Ⅱ組。觀察治療過程中的不良反應，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療并未增加不良反應的發(fā)生率，提示聯(lián)合治療可起到協(xié)同增效的作用，且不良反應小。308 nm準分子激光起效時間較傳統(tǒng)紫外線短，具有療效顯著，不良反應小，復色時間短等特點［15-16］，其機制可能與308 nm準分子激光可直接誘導皮損處浸潤的病理性T淋巴細胞凋亡及影響多種黏附細胞因子，如腫瘤壞死因子-α、轉化生長因子-β等的釋放間接促進T淋巴細胞的凋亡有關［17-18］。CG 能有效抑制 CD4+和 CD8+細胞及其細胞因子的產(chǎn)生［19］，同時下調(diào)Th17細胞相關因子的表達［20］，因此多年來被用于斑禿及銀屑病等多種皮膚病的治療。研究［21］發(fā)現(xiàn)，醛固酮可直接激活黑素細胞內(nèi)酪氨酸酶的活性，促進黑素的合成。同時可促進黑素細胞內(nèi)合成的黑素轉運到角質(zhì)形成細胞。綜上，可能是308 nm準分子激光聯(lián)合OCG治療白癜風較單純308 nm準分子激光和單純OCG治療更有效的原因之一。

本研究通過308 nm準分子激光聯(lián)合OCG治療白癜風取得了良好的臨床療效，且副作用少，可在臨床中推廣。但仍存在有不足，由于實驗樣本量較小，觀察時間不長，臨床上仍有待大樣本、多中心隨機雙盲的對照研究來進一步證實，提供更加確切的臨床依據(jù)。