李志琛 劉穎 何徐軍 梅偉群 陳建斌 張華北 歐陽建 錢佳麗

1解放軍第903醫(yī)院內(nèi)分泌科（杭州 310004）；2浙江省人民醫(yī)院浙江省胃腸病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（杭州 310013）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）和糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）兩個(gè)主要微血管并發(fā)癥，其帶來的視力喪失及腎功能衰竭成為嚴(yán)重的公共健康問題。DR、DN的確切發(fā)病機(jī)制尚未明確，DR患者中，較多同時(shí)或先后發(fā)生DN，也有部分僅有DR而未發(fā)生DN，說明單純DR與DR伴DN患者之間存在不同的致病機(jī)制。血漿中具有大量生理功能且豐富多變的蛋白質(zhì)，其組成和含量的變化成為相關(guān)疾病的重要標(biāo)志［1］。目前針對(duì)單純DR與DR伴DN患者之間血漿蛋白質(zhì)組學(xué)差異尚未見報(bào)道。本研究應(yīng)用label-free蛋白質(zhì)組定量技術(shù)，尋找單純DR與DR伴DN患者間差異表達(dá)蛋白，為進(jìn)一步篩選二者間不同的血漿標(biāo)志物提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料選取2012年2月至2012年10月就診于我院的16例T2DM患者，8例DR伴DN患者納入DNDR組，8例單純DR患者納入DR組。DR組男4例，女4例，年齡33歲～69歲，平均（43.32±6.14）歲，糖化血紅蛋白6.10%～7.50%，平均（6.74±0.45）%，DNDR組男5例，女3例，年齡35歲～67歲，平均（44.57±6.35）歲，糖化血紅蛋白6.30%～7.40%，平均（6.89±0.51）%，兩組患者性別、年齡、糖化血紅蛋白差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。所有患者均符合1999年WHO糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）依據(jù)2002年DR國(guó)際分期標(biāo)準(zhǔn)：雙眼眼底彩色照相檢查符合中度以上非增殖性DR或增殖性DR。（2）依據(jù)2012年ADA篩查和診斷標(biāo)準(zhǔn)：測(cè)定即時(shí)尿標(biāo)本的白蛋白/肌酐（urinary albumin/creatinine ratio，ACR）≥ 30 μg/mg，3 個(gè)月內(nèi) 3 次ACR至少有2次升高。符合以上2條標(biāo)準(zhǔn)納入DNDR組；僅符合（1），且ACR＜30μg/mg納入DR組。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）冠心病、高血壓病、惡性腫瘤等慢性疾病患者；（2）T1DM、妊娠糖尿病和特殊類型糖尿?。唬?）嚴(yán)重眼部疾患影響眼底檢查者；（4）青光眼、葡萄膜炎及其他視網(wǎng)膜疾病者；（5）劇烈運(yùn)動(dòng)、發(fā)熱、尿路感染、腎病綜合征等其他原因?qū)е翧CR升高。入組患者均知曉研究方案并簽署知情同意書且經(jīng)903醫(yī)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)。

1.2方法委托華大基因公司對(duì)16例血漿標(biāo)本進(jìn)行質(zhì)檢和蛋白組學(xué)質(zhì)譜檢測(cè)，檢測(cè)的肽段、譜圖數(shù)目、總蛋白均合格。

1.2.1主要試劑和儀器金標(biāo)胰蛋白酶（trypsin gold Promega）購自北京華利世科技有限公司；質(zhì)譜儀（Triple TOF 5600）來自AB CSIEX（美國(guó)）。酶聯(lián)免疫吸附 Human PDI ELISA Kit（ab229894）購自abcam公司（美國(guó)）；CPS1 ELISA Kit（ABIN813029）購自北京4A生物技術(shù)有限公司。

1.2.2檢測(cè)流程取100 μg的血漿，按蛋白質(zhì)提取標(biāo)準(zhǔn)流程操作，用考馬斯亮藍(lán)法定量，12%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。取100 μL蛋白，按蛋白∶酶=20∶1的比例加入胰蛋白酶，設(shè)定37℃酶解4 h，再加胰蛋白酶1次，37℃酶解8 h后對(duì)樣品進(jìn)行液相分離。每個(gè)組分用除鹽柱除鹽后冷凍抽干，再分別復(fù)溶、離心后取上清5 μL，通過色譜儀進(jìn)行分離。掃描的粒子信號(hào)分別記錄后合并轉(zhuǎn)化成數(shù)據(jù)。

1.3生物學(xué)信息分析用Swissprot人的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，同時(shí)搜索人數(shù)據(jù)庫IPI_human_3.87.fasta，兩者數(shù)據(jù)庫相匹配。取兩組樣品豐度值的均數(shù)（mean）和中位數(shù)（median），計(jì)算相應(yīng)的Ratio值。設(shè)定mean和median差異倍數(shù)（上/下調(diào)）均≥2.5倍為差異表達(dá)蛋白。GO注釋分別描述分子功能、細(xì)胞組分和生物過程。以KEGG Pathway為單位，經(jīng)顯著性富集分析確定差異蛋白參與的生化代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析。利用Human IGFBP7 ELISA Kit和CPS1 ELISA Kit檢測(cè)兩組血漿差異蛋白的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1DR與DNDR組間差異表達(dá)蛋白以均數(shù)和中位數(shù)差異倍數(shù)（DR vs DNDR）上/下調(diào)均≥2.5倍為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出差異蛋白17個(gè)，上調(diào)11個(gè)，下調(diào)6個(gè)。見表1。

2.2GO注釋和富集分析差異表達(dá)蛋白涉及22種細(xì)胞過程，細(xì)胞過程（cellular process）和單一生物過程（single-organism process）占比最高；涉及14種細(xì)胞組分，細(xì)胞（cell）和細(xì)胞部分（cell part）占比最高；涉及5種細(xì)胞功能，結(jié)合蛋白（binding）占比最高。見圖1。

圖1 基因本體分析Fig.1 The gene ontology（GO）analysis

2.3Pathway富集分析下調(diào)最明顯的PAPLN蛋白和上調(diào)最明顯的胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白7（Insulin-like growth factor-binding protein 7，IGFBP7）蛋白均未富集到相關(guān)代謝通路。富集到最顯著的代謝通路為丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代謝，氨基甲酰磷酸合成酶1（Carbamoyl phosphate synthetase 1，CPS1）參與其中。見圖2。

表1 DR與DNDR組間差異表達(dá)蛋白Tab.1 The differential proteomics of DR vs DNDR

2.4蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析HSPG2、CPS1、IGFBP7、TLN1、KRT5之間有相互作用（圖3）。

2.5血漿中IGFBP7及CPS1蛋白水平比較ELISA法檢測(cè)結(jié)果IGFBP7在DR組較DNDR組表達(dá)升高，CPS1在DR組較DNDR組表達(dá)降低，兩者差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 血漿中IGFBP7及CPS1蛋白水平比較Tab.2 Comparison of IGFBP7and CPS1 protein level in blood plasma ±s

表2 血漿中IGFBP7及CPS1蛋白水平比較Tab.2 Comparison of IGFBP7and CPS1 protein level in blood plasma ±s

注：與DNDR組比較，*均P＜0.05

組別DR組DNDR組IGFBP7（pg/mL）598.46±5.96*64.76±3.28 PS1（pg/mL）147.25±6.26*538.31±5.78

3 討論

由于生活方式、醫(yī)療保健、診斷水平等的差異，不同的研究DM患者中DR患病率有一定差異，GIUFFRE等［2］調(diào)查40歲以上DM人群DR患病率為34.1%，其中增殖性DR患病率為4.5%。DN患病率與DR程度有關(guān)，研究［3］發(fā)現(xiàn)87%的增殖性DR患者伴有DN。但也有部分患者僅合并DR，而不發(fā)生DN，說明兩者之間的異質(zhì)性決定了臨床表現(xiàn)的不一致性。本研究共篩選出17個(gè)差異蛋白，以均數(shù)和中位數(shù)差異倍數(shù)作為篩選條件，避免了因樣本量少所致的數(shù)據(jù)偏倚，同時(shí)為了避免剔除有意義的蛋白，選擇差異倍數(shù)上下調(diào)2.5倍［4］。通過蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)多種差異蛋白有相互作用，說明兩組患者有不同的蛋白作用網(wǎng)絡(luò)，以下重點(diǎn)討論本研究發(fā)現(xiàn)的需要進(jìn)一步驗(yàn)證的差異蛋白。

本研究中下調(diào)最明顯的蛋白為PAPLN，但未發(fā)現(xiàn)有參與代謝通路。目前對(duì)PAPLN的研究較少，主要研究見于昆蟲類，發(fā)現(xiàn)與幾種細(xì)胞外基質(zhì)成分和ADAMTS酶相互作用，對(duì)胚胎發(fā)育至關(guān)重要［5］。研究［6］發(fā)現(xiàn)，PAPLN水平對(duì)婦女盆腔器官脫垂發(fā)展有影響。本研究中該蛋白在DR組顯著低于DNDR組，其相互關(guān)系需進(jìn)一步研究。上調(diào)最明顯的IGFBP7是一種分泌蛋白，尿IGFBP7是早期診斷腎損傷的生物標(biāo)志物［7］。高血清IGFBP7水平增加了代謝綜合征和胰島素抵抗的風(fēng)險(xiǎn)，且與腰臀比、高密度脂蛋白膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇等代謝相關(guān)參數(shù)顯著相關(guān)［8］。CAI等［9］發(fā)現(xiàn)，IGFBP7可抑制高糖介導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，表明IGFBP7可能對(duì)腎臟具有保護(hù)作用。目前較多的研究IGFBP7可能與腫瘤相關(guān)，包括膽管癌［10］、滑膜肉瘤和脂肪肉瘤［11］等。由此可見IGFBP7為多功能蛋白，本研究中DR組IGFBP7顯著上調(diào)，其機(jī)制是否與其腎臟保護(hù)作用有關(guān)需進(jìn)一步研究。

HSPG2也稱為Perlecan，是一種大型單體硫酸乙酰肝素蛋白多糖，是皮質(zhì)骨腔隙小管系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分。在骨細(xì)胞細(xì)胞體周圍的細(xì)胞周圍空間內(nèi)，基底膜蛋白可以降低流體流動(dòng)阻力，將外部刺激傳遞給骨細(xì)胞胞膜［12］。研究發(fā)現(xiàn)Perlecan在脂蛋白代謝中起重要作用，HSPG2-rs3767140可能與降低的低密度脂蛋白c以及DM患者的高密度脂蛋白c增加有關(guān)［13］。另外，HSPG2被鑒定為系統(tǒng)性硬化癥中內(nèi)皮細(xì)胞損傷的標(biāo)志物［14］。本研究發(fā)現(xiàn)HSPG2蛋白在DR組上調(diào)，GO分析示HSPG2為結(jié)合功能蛋白，并參與ECM受體相互作用的pathway，相關(guān)機(jī)制需進(jìn)一步研究。

圖2 丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代謝通路富集分析圖Fig.2 Map of pathway enrichment analysis of alanine,aspartate and glutamate metabolism

圖3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析圖Fig.3 Analysis chart of protein interaction networks

CPS1是尿素循環(huán)酶，其由碳酸氫鹽，氨和ATP形成氨基甲酰磷酸酯。CPS1缺失會(huì)降低嘧啶與嘌呤的比例，影響S期進(jìn)展并誘導(dǎo)DNA聚合酶停滯和DNA損傷［15］。ELIKTAS 等［16］發(fā)現(xiàn)CPS1敲低減少細(xì)胞生長(zhǎng)，降低與核酸生物合成途徑相關(guān)的代謝物水平。研究［17］發(fā)現(xiàn)甘氨酸和CPS1有相互關(guān)聯(lián)，甘氨酸與代謝健康和胰島素敏感性相關(guān)聯(lián)，因此CPS1和相關(guān)途徑在減肥維持中的可能作用。本研究中CPS1在DR組中明顯下調(diào)，pathway富集分析顯示為最顯著的代謝通路，參與丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代謝，其在DR伴DN中的作用機(jī)制仍待研究。

綜上所述，本研究基于Label-free定量技術(shù)，并結(jié)合生物信息學(xué)，篩選出PAPLN、IGFBP7、CPS1等差異蛋白，兩組患者呈現(xiàn)出不同的差異蛋白表達(dá)趨勢(shì)。上述蛋白具有多種功能，且構(gòu)成相互作用網(wǎng)絡(luò)，為篩選血漿標(biāo)志物和新的干預(yù)靶點(diǎn)提供依據(jù)。ELISA法對(duì)IGFBP7、CPS1進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示與質(zhì)譜分析結(jié)果一致，提示采用Label-free定量技術(shù)是有效和可行的，但本研究樣本量較少，且未進(jìn)行全部差異蛋白的驗(yàn)證，下一步工作需要擴(kuò)大樣本人群，對(duì)重點(diǎn)研究的差異蛋白進(jìn)行驗(yàn)證。