陳永秀 譚曉嫦 黃曉文 麥碧 胡桂英 羅喜平

廣東省婦幼保健院婦科（廣州511400）

子宮內(nèi)膜癌（endometrial carcinoma，EC）是由于子宮內(nèi)膜上皮惡變而產(chǎn)生的常見婦科腫瘤，在女性生殖道惡性腫瘤中所占比例高達(dá)20%～30%［1］。數(shù)據(jù)顯示，2015年我國EC新發(fā)病率約為6.3萬例，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢，且發(fā)病年齡年輕化［2-3］。目前對EC變早期診斷和預(yù)后判斷尚未有較可靠的手段和方法。惡性腫瘤是環(huán)境-基因共同作用的結(jié)果。近年來隨著生物技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，從分子微觀角度揭示腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程促進(jìn)了惡性腫瘤的臨床診治水平［4］。隨著基因組學(xué)測序技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)了人體內(nèi)存在大量的非編碼蛋白的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，其中長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）是重要的組成部分。它是一類長度超過200nt的轉(zhuǎn)錄單元，在許多重要的生物進(jìn)程中起著至關(guān)重要的調(diào)控作用［5-6］。因此，LncRNA的異常表達(dá)可引起機體內(nèi)細(xì)胞功能的異常而導(dǎo)致疾病發(fā)生［7］。研究報道LncRNA與癌癥形成、發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移等過程密切相關(guān)，為惡性腫瘤的臨床診治和預(yù)后評估提供了新的生物標(biāo)志［8］。目前國內(nèi)外關(guān)于LncRNAs與EC關(guān)系的報道不多［9-10］，且很多研究是基于生物信息學(xué)探索LncRNAs影響EC發(fā)生、發(fā)展過程的關(guān)聯(lián)；大部分LncRNAs在EC中的功能機制尚未明確［11］。此外，如何高效可靠地篩選出與EC相關(guān)的LncRNA是一個很具挑戰(zhàn)的難題。在本研究中，筆者前期通過高通量測序技術(shù)檢測EC組織的LncRNA表達(dá)，并結(jié)合TCGA公共數(shù)據(jù)庫的EC表達(dá)譜數(shù)據(jù)，篩選出差異性表達(dá)的LncRNAs。同時，通過生物信息學(xué)分析鑒定在EC發(fā)病中具有潛在功能的特異性分子?；谏鲜鲅芯坎呗?，筆者篩選并初步發(fā)現(xiàn)，LINC00475在癌組織中呈顯著的低表達(dá)狀態(tài)。因此，筆者擬進(jìn)一步擴大臨床樣本檢測LINC00475在EC組織的表達(dá)情況，分析其表達(dá)與EC發(fā)病、臨床進(jìn)展和預(yù)后的關(guān)系，并利用功能學(xué)實驗分析該LncRNA的生物學(xué)功能，闡明該LncRNA潛在的臨床應(yīng)用意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象資料及隨訪本研究的110例EC病例選取于2012年1月至2017年12月在我院行手術(shù)治療并經(jīng)病理學(xué)確診的患者。組織標(biāo)本在手術(shù)切除采集后立即置于液氮中凍存。全部患者手術(shù)前均未接受過化療、分子靶向或激素治療。110例患者的年齡29～77歲，平均（55.3±10.3）歲。根據(jù)2014年國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟分期（FIGO 2014）Ⅰ期和Ⅱ期患者共88例，Ⅲ期和Ⅳ期患者22例。組織病理類型為子宮內(nèi)膜樣腺癌93例、非子宮內(nèi)膜樣腺癌17例。根據(jù)病理分級G1級EC 35例，G2級55例，G3級20例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性患者16例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性患者94例。對本研究病例隨訪采用電話訪問方式，直接聯(lián)系患者本人或其家屬，從病例確診收集后每間隔6個月隨訪一次。隨訪截止日期為2018年6月30日。記錄患者的生存狀況。生存時間為自患者確診之日至隨訪截止日期或死亡的時間，以月為單位計算。觀察終點為患者死亡或隨訪日期截止。在隨訪期間失訪將不納入后續(xù)的生存分析。截止到最后一次隨訪時間，具有完整生存信息并納入預(yù)后分析的病例共87例。參與本實驗患者均簽署知情同意書，并已通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2主要試劑和儀器細(xì)胞培養(yǎng)基1640和胎牛血清購自美國Hyclone公司，轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM3000 Reagent購自美國Invitrogen公司。CCK8試劑盒購自上海碧云天公司，RNA提取試劑Trizol Reagents、SYBR Green PCR Master Mix試劑盒（Takara）均購自大連寶生物公司。Transwell小室和基質(zhì)膠購自美國BD公司，PCR引物由上海生工公司合成。酶標(biāo)儀購自美國熱電公司，實時熒光定量PCR儀購自美國Applied Biosystems公司。倒置顯微鏡來自日本Olympus。

1.3主要實驗方法

1.3.1LINC00475載體構(gòu)建參考UCSC基因組數(shù)據(jù)庫LINC00475轉(zhuǎn)錄本序列，使用primer premier 5.0軟件設(shè)計擴增基因全長的引物，采用in-Fusion技術(shù)克隆入pcDNA3.1表達(dá)載體，表達(dá)載體的酶切位點設(shè)為XhoI/BamHI；T4 DNA連接酶連接，篩選，質(zhì)粒擴增并測序鑒定。

1.3.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染和篩選取對數(shù)生長期的Ishikawa細(xì)胞接種在12孔細(xì)胞板內(nèi)，待細(xì)胞達(dá)到約80%匯合度，用LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑按說明書配置轉(zhuǎn)染體系，將pcDNA3.1-LINC00475和pcDNA3.1空白質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至Ishikawa細(xì)胞，轉(zhuǎn)染6 h后換液培養(yǎng)，G418藥物篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系。細(xì)胞表達(dá)效率利用實時定量熒光PCR法（qPCR）法檢測驗證。

1.3.3qPCR檢測基因表達(dá)用Trizol法常規(guī)提取EC組織總RNA，依照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后保存在4℃冰箱備用。根據(jù)LINC00475基因序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計特異性擴增引物，具體引物信息如下：LINC00475上游引物：CTCATCCATGCCTCCACATT，下游引物：GAGATGCCCAAAAAGCCAAG；β-actin內(nèi)參引物分別是GGCGGCACCACCATGTACCCT和AGGGGCCGGAC TCGTCATACT。qPCR反應(yīng)體系為 25 μL：上下游引物各 0.5 μL，cDNA 模板 2 μL，ddH2O 10 μL，SYBR Green Mix 12 μL。擴增條件：預(yù)變性 95℃5 min，1個循環(huán)；PCR擴增95 ℃ 15 s，60℃ 1 min，40個循環(huán)；溶解曲線：95℃ 5 s；60℃ 1 min。降溫：50 ℃ 30 s，1個循環(huán)。

1.3.4細(xì)胞表型實驗細(xì)胞增殖活性檢測時消化對數(shù)生長期的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞，以500 cells/孔分別種植于96孔細(xì)胞板中。在培養(yǎng)箱孵育24、48、72和96 h后，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗1～2遍，將CCK-8試劑與培養(yǎng)基按體積比為1∶9配制混合液，加入100 μL新配制混合培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱避光繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用全自動酶標(biāo)儀（檢測波長為450 nm）檢測樣品吸光度值，每組細(xì)胞設(shè)置5個復(fù)孔。遷移實驗所用小室為Corning公司孔徑為8 μm的遷移小室，侵襲實驗選用Corning公司的BD BioCoat Matrigel Invasion 8 μm小室。取200 μL細(xì)胞懸液（1×105/mL）于Transwell小室常規(guī)培養(yǎng)24～48 h，取出小室PBS清洗，甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染液染色30 min，用棉簽拭去小室內(nèi)層膜上的未穿透的細(xì)胞，自來水沖洗后置室溫干燥。于100×顯微鏡下隨機選取十個視野，記錄遷移至微孔膜下層的細(xì)胞數(shù)量。檢測細(xì)胞侵襲能力除使用專用于侵襲的小室不同外，其余操作同遷移實驗。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用R 3.2統(tǒng)計軟件進(jìn)行本研究所有數(shù)據(jù)的處理和分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述，基因表達(dá)在癌-癌旁組間比較采用配對t檢驗；采用卡方檢驗進(jìn)行計數(shù)資料及率的比較。Logistic回歸模型分析基因的表達(dá)水平與EC患者臨床病理特征的關(guān)系；采用Spearman進(jìn)行相關(guān)性分析。Kaplan-Meier法繪制生存曲線并以log-rank檢驗不同組間的生存時間差異。Cox比例風(fēng)險回歸模型分析LINC00475表達(dá)對EC預(yù)后的影響，利用rms包建立列線圖預(yù)測模型，采用Bootstrap進(jìn)行內(nèi)部驗證，重復(fù)抽樣1 000次，計算C指數(shù)（C-index）。所有檢驗均為雙側(cè)檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LINC00475在EC組織中的表達(dá)如圖1所示，LINC00475在EC組織中的表達(dá)水平明顯低于對應(yīng)的癌旁正常組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（0.001 2±0.000 6 vs.0.001 8±0.000 9，P＜0.001）。

圖1 LINC00475在EC的表達(dá)情況Fig.1 The relative expression of LINC00475 in EC

2.2 LINC00475表達(dá)水平與EC臨床特征的關(guān)聯(lián)分析進(jìn)一步探討該LncRNA表達(dá)水平與EC病例的臨床病理特征之間的關(guān)系。結(jié)果見表1，LINC00475表達(dá)與年齡、病理類型、FIGO分期、腫瘤分級之間無明顯統(tǒng)計學(xué)關(guān)聯(lián)（P＞0.05），但與EC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)（P=0.030）；以無轉(zhuǎn)移的EC病例作為參照，高表達(dá)LINC00475的患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險明顯下降（OR=0.28，95%CI：0.09～ 0.94）。

2.3 LINC00475表達(dá)對EC預(yù)后的影響筆者通過將EC患者LINC00475表達(dá)量和患者的生存資料進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)LINC00475高表達(dá)患者的中位生存期（median survival time，MST）為 39.6個月，較低表達(dá)組的患者中位生存期（27.2個月）明顯延長，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.004，圖2A）。單因素Cox回歸分析結(jié)果顯示：與低表達(dá)組相比，高表達(dá)LINC00475病例的死亡風(fēng)險顯著下降（HR=0.54，95%CI：0.11～0.92）；多因素校正后（校正年齡、FIGO分期、腫瘤分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等），LINC00475高表達(dá)后降低EC患者死亡風(fēng)險的效應(yīng)仍具有統(tǒng)計學(xué)意義（HR=0.48，95%CI：0.12～ 0.98）。納入FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和LINC00475表達(dá)等變量建立預(yù)測EC患者死亡風(fēng)險的列線圖模型（圖2B），該模型生存預(yù)測的C-index為0.904；應(yīng)用Bootstrap法進(jìn)行重抽樣驗證，其模型的C-index為0.839。

2.4LINC00475表達(dá)對EC細(xì)胞表型的影響見圖3。CCK-8細(xì)胞增殖實驗顯示LINC00475過表達(dá)組細(xì)胞的增殖速率明顯低于空白對照組。兩組細(xì)胞在第4天時的增殖速率為：LINC00475過表達(dá)組（73.8±12.1）%，空白對照組細(xì)胞（116.5±13.4）%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。此外，在Transwell遷移和侵襲實驗中，過表達(dá)LINC00475的內(nèi)膜癌細(xì)胞穿透小室的細(xì)胞數(shù)量均顯著少于空白對照組細(xì)胞［遷移實驗：（38.6±8.3）vs.（62.3±10.9），P ＜ 0.001；侵襲實驗：（30.2 ± 12.6）vs.（48.9± 11.2），P ＜ 0.001］。

表1 LINC00475表達(dá)與EC臨床病理特征的關(guān)系Tab.1 Associations between LINC00475 expression and EC clinicopathological features 例（%）

圖2 LINC00475不同表達(dá)情況下EC患者的生存曲線及列線圖Fig.2 Survival curve and nomogram of EC patients with different LINC00475 expression

3 討論

在本研究中，筆者分析了LINC00475與EC發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)LINC00475在EC組織中低表達(dá)，其異常低表達(dá)能顯著增加EC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險，導(dǎo)致患者生存時間縮短和不良預(yù)后。生物學(xué)實驗證實該LncRNA能夠影響腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移表型。

EC是女性生殖系統(tǒng)最為常見的三大惡性腫瘤類型之一，近年來發(fā)病率在世界范圍內(nèi)的上升趨勢明顯，嚴(yán)重危害婦女健康［12］。EC早期診斷的患者一般預(yù)后較好，5年生存率超過90%［2］。但是臨床上仍有部分患者出現(xiàn)癌灶轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致預(yù)后不良［1］。因此，闡明EC發(fā)病的生物機制，尋找新的診斷和特異性治療靶點對于改善EC的預(yù)后具有至關(guān)重要的作用。近年來大量研究表明，作為基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要分子，LncRNA為研究復(fù)雜疾病的病理生理過程和發(fā)病機制提供了新的途徑［13-15］。LncRNA以RNA的形式在多種層面上，如表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等調(diào)控基因的表達(dá)水平［16-17］。研究已證實，LncRNA與腫瘤的發(fā)生存在密切的關(guān)系，且參與了腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和侵襲等過程［18-19］。LncRNA在EC的發(fā)生發(fā)展中亦扮演著重要角色。XIE等［20］研究發(fā)現(xiàn)LncRNA CCAT2在EC組織中高表達(dá)。該LncRNA可通過海綿吸附miR-216b調(diào)節(jié)Bcl-2、影響PTEN/PI3K/AKT和mTOR信號通路的活化，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的生長及轉(zhuǎn)移。盡管這些研究的結(jié)果表明，LncRNAs有可能在腫瘤形成、進(jìn)展中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用，對于LncRNAs在特定腫瘤中的表達(dá)調(diào)控以及它們參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制仍需進(jìn)一步闡明。

圖3 LINC00475生物學(xué)功能Fig.3 The biological functions of LINC00475

在本研究中，筆者基于前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)提示，探討新發(fā)現(xiàn)的LINC00475與EC發(fā)病和預(yù)后的關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果顯示該LncRNA在內(nèi)膜癌癌組織的表達(dá)水平低于對應(yīng)的癌旁正常組織，且其表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，能顯著增加淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險。生存分析結(jié)果顯示低表達(dá)LINC00475的患者，其生存時間明顯低于高表達(dá)組的EC患者。LINC00475能影響EC發(fā)病和預(yù)后的關(guān)系在基于TCGA公共數(shù)據(jù)庫的生信分析中也得到了一致的結(jié)果，提示LINC00475是參與EC發(fā)生、發(fā)展過程的特異性分子。目前臨床上尚缺乏對EC疾病精準(zhǔn)評估的生物標(biāo)志物。最近有研究報道了LINC00475在胃癌組織中聯(lián)合其他9個LncRNA可作為胃癌發(fā)病的生物標(biāo)志［21］，但未分析其預(yù)測效能。在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)該LncRNA結(jié)合FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素能對EC患者的預(yù)后有良好的預(yù)測效能，提示LINC00475可作為臨床精準(zhǔn)評估EC患者生存預(yù)后的特異生物標(biāo)志物。對于LINC00475在EC腫瘤作用中的分子機制未見報道。筆者在本研究中利用系列功能學(xué)實驗檢測該LncRNA對細(xì)胞表型的效應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高表達(dá)LINC00475后能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等生物學(xué)過程。進(jìn)一步通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，LINC00475能特異性結(jié)合ADAM22基因，并潛在改變ADAM22的表達(dá)。已有報道ADAM22基因參與腫瘤細(xì)胞的粘附、增殖等生物學(xué)過程，且是影響腫瘤化療結(jié)局的靶點［22］，故此，筆者推測低表達(dá)LINC00475通過異常調(diào)控ADAM22的表達(dá)而導(dǎo)致EC患者的預(yù)后不良。但是該LncRNA是在轉(zhuǎn)錄前還是轉(zhuǎn)錄后水平對ADAM22基因進(jìn)行調(diào)控，具體的調(diào)控方式如何；該LncRNA如何通過調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)而影響EC的發(fā)生、發(fā)展，在后續(xù)研究中仍需應(yīng)用系列生物學(xué)實驗進(jìn)一步進(jìn)行驗證。以往的大部分研究都是基于候選基因策略研究特定分子與疾病的關(guān)系。在本研究中，筆者利用高通量數(shù)據(jù)篩選在EC中特異性表達(dá)LncRNA，大大提高了研究的效率；此外，筆者的研究結(jié)果提示LINC00475對EC發(fā)病和預(yù)后具有良好的預(yù)測效果，亦為臨床工作中對EC患者的精確診治及預(yù)后評估提供了潛在的生物標(biāo)志。

綜上所述，本研究報道LINC00475是一個新的在EC中具有抑癌效應(yīng)的非編碼RNA，與EC發(fā)生、臨床轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)，可作為EC發(fā)生發(fā)展過程評估的生物標(biāo)志物。