吳少科 陳曉駟 陳海聰 譚小艷 胡資兵 魏波 黃成碩魏勁松 劉田豐

廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院1骨外科，2VIP病區(qū)（廣東湛江524023）

骨質疏松癥是一種以成骨細胞凋亡加快，破骨細胞增多造成局部骨量大量丟失、骨脆性增加的一種代謝性疾病，同時骨質疏松癥患者的骨折風險度增加。近年來骨質疏松癥的發(fā)病率逐漸增多，有研究報道全球30%的人患有骨質疏松癥，其中60歲以上老人骨質疏松癥的患病率更嚴重，發(fā)病率達到60%以上，然而女性發(fā)病率大于男性［1］。老年人絕經(jīng)后因其雌激素分泌減少，這導致骨量的大量丟失，同時脊柱、髖骨、手腕等部位較易發(fā)生骨折，且發(fā)生骨折后難以愈合，更有甚者會引起死亡，給家庭及社會帶來沉重的經(jīng)濟負擔，因此尋找一種可以有效防治絕經(jīng)后骨質疏松癥的藥物已成為當務之急。積雪草酸是一種五環(huán)三萜酸，具有廣泛的生物學作用。過去積雪草酸主要是用于一些皮膚創(chuàng)傷及慢性潰瘍的臨床治療，近來隨著對積雪草酸藥理活性的研究，發(fā)現(xiàn)積雪草酸還具有治療癡呆癥、腫瘤等老年性疾病的作用［2］。有文獻［3-4］報道積雪草酸對多發(fā)性骨髓瘤細胞的增殖活性具有調節(jié)作用，可以防治骨髓瘤的惡化，同時其能抑制骨基質細胞的脂肪分化。那么積雪草酸能否防治老年人絕經(jīng)后骨質疏松呢？這將是本課題組的研究重點。本課題采用去卵巢大鼠骨質疏松動物模型探討積雪草酸的抗骨質疏松作用，現(xiàn)具體報告如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組42只3個月齡SPF級雌性SD大鼠，由南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供，體質量（257±27.1）g，動物合格證：SCXK（粵）2011-0015。適應環(huán)境飼養(yǎng)1周后，按體質量對等原則隨機分成6組，每組7只，第一組為假手術組，僅切除雙側卵巢附近脂肪組織，且每天給予灌胃生理鹽水［3 mL/（kg·d）］；第二組為去卵巢組，行雙側去卵巢手術后每天給予灌胃生理鹽水［3 mL/（kg·d），建立骨質疏松模型［5］；第三組為低劑量積雪草酸組，行雙側去卵巢手術后每天給予灌胃積雪草酸［80 mg/（kg·d）］；第四組為中劑量積雪草酸組，行雙側去卵巢手術后每天給予灌胃積雪草酸［100 mg/（kg·d）］；第五組為高劑量積雪草酸組，行雙側去卵巢手術后每天給予灌胃積雪草酸［120 mg/（kg·d）］；第六組為陽性對照雌二醇組，行雙側去卵巢手術后每天皮下注射苯甲酸雌二醇0.02 mg/kg。實驗周期為90 d，每周大鼠稱重一次，實驗結束前12 h禁食，用3%戊巴比妥鈉（1.5 mg/kg）行腹腔注射麻醉后右心室徹底抽血分離血清，取右側股骨置于生理鹽水潤濕的紗布中，并用錫紙包裹防止水分蒸發(fā)，用于指標的檢測。

1.2試劑與器材積雪草酸中藥材購于東莞國藥有限公司，羅蓋全購于上海羅氏制藥有限公司，低密度脂蛋白、總膽固醇、甘油三酯測試盒購于南京建成公司；RT-qPCR反逆轉錄試劑盒與SYBR熒光染料購于TaKaRa公司，ALP抗體及內參購于abcam公司，Micro-CT掃描儀（美國Latheta，型號LCT200）、酶標儀（北京普朗醫(yī)療，型號DNM-9606）、微量移液器（美國eppendorf，Research Plus系列）、冷凍離心機（美國eppendorf，型號5415R）等常規(guī)設備均由本試驗室提供。

1.3工作液的制備取積雪草酸中藥材500 mg，先用適量二甲基亞砜充分溶解混勻，再用生理鹽水稀釋、混勻，定容至100 mL，配成濃度為5 mg/mL的積雪草酸工作液，其中二甲基亞砜濃度低于0.1%，常溫避光保存。

1.4大鼠血脂水平的檢測檢測方法按照LDL、TG、TC試劑盒提供的說明書進行操作，樣品準備好后用全波長酶標儀測定，并按說明書提供的計算方法得出血清中的血脂水平。

1.5大鼠股骨Micro-CT掃描將處理好的股骨遠心端（已截斷）標本沿長軸垂直固定于樣品固定器內，vivaCT40選擇掃描參數(shù)：圖像矩陣為1024× 1024，整合時間為200 ms，能量/強度為70 kVp、114 μA、8 W。以0°旋轉，進行掃描，掃描完成后，選取距生長板遠端1.5 mm、層厚3.0 mm的骨組織為松質骨感興趣區(qū)域行三維重組，以最低閾值為170提取圖像信息。獲得重組圖像后，使用Micro CT自帶的軟件進行定量分析。物理參數(shù)分析如下：骨密度、骨體積分數(shù)、結構模型指數(shù)、骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度、骨小梁分離度。

1.6大鼠股骨堿性磷酸酶（ALP）的Real-time PCR檢測首先取出大鼠股骨約0.6 g，放入預冷的研缽中，同時往研缽中倒入液氮，手持研棒迅速將股骨研至細粉。其次將研制股骨粉末用Trizol進行溶解，提取股骨RNA，再參照RT-qPCR反逆轉錄試劑盒方法進行RNA轉錄，最后在SYBR熒光顏料的作用下Real-time PCR擴增儀進行基因相對表達量檢測。ALP及β-actin引物序列見表1。

表1 ALP與β-actin引物序列Tab.1 The internal reference sequences of ALP and beta-actin

1.7大鼠股骨DKK1蛋白的Western Blot測定取出大鼠股骨，參照1.6方法進行液氮研磨，其次將股骨研磨粉末用裂解液進行蛋白提取，參照BCA蛋白測定盒檢測所提取蛋白的含量，并計算相應的量用于進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，其操作步驟依次為：配膠、灌膠、電泳、轉膜、剪膜、封閉、抗體抗原反應、曝光成像、灰度分析。

1.8統(tǒng)計學方法實驗數(shù)據(jù)采用±s表示，對假手術組與去卵巢組之間進行方差分析；去卵巢組與低中高劑量積雪草酸組、去卵巢組與雌二醇組之間進行方差分析；計算比較兩組的F值，查閱F界值表，當P＜0.05，表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1大鼠各周體質量變化大鼠各周的體質量變化見表2。與Sham組相比，OVX組大鼠體質量均較低，且在第2、4、6周差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）；與OVX組比較，L-AA組大鼠體質量在前6周內較小，第6周后較大，其中第2、8周差異具有統(tǒng)計學意義，M-AA組大鼠體質量均較大，其中在第3、10周差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），H-AA組大鼠體質量在前4周較小，在第4周后則較大，其中在第8、10、12周差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），E2組大鼠在實驗期間均較大，其中在第10、12周差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表2 各組大鼠體重變化Tab.2 Changes of body weight in rats of different groups（n=7） x ± s，g

2.2積雪草酸對大鼠血脂水平的影響各組大鼠低密度脂蛋白、總膽固醇、甘油三酯測量結果見表3。與Sham組相比，OVX組大鼠LDL、TC、TG均增高，其中LDL差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與OVX組比較，L-AA組大鼠LDL、TC、TG均降低，其中LDL、TC差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），L-AA組大鼠LDL、TC、TG均降低，其中TG差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），H-AA組大鼠LDL、TC、TG均降低，其中LDL、TG具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），E2組大鼠LDL、TC、TG均降低，其中TG、TC差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.3積雪草酸對大鼠股骨骨微結構的影響各組大鼠股骨干骺段模型指數(shù)、骨密度、骨體積分數(shù)、骨小梁數(shù)量、骨小梁分離度、骨小梁厚度Micro-CT 掃描值見表4，大鼠股骨微結構3D重建見圖1。

表3 各組大鼠血脂水平Tab.3 The level of serum lipid in rats of different groups（n=7） x ± s，mmol/L

圖1 各組大鼠股骨微結構3D重建圖Fig.1 The 3D reconstruction microarchitecture of the femur of different groups

表4 各組大鼠股骨Micro-CT掃描值Tab.4 The result of the femur scanned by Micro-CT in each groups（n=7） x ± s

如表4所示，與Sham組相比，OVX組大鼠SMI、Tb.Sp升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與OVX組相比，L-AA組大鼠BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th升高，SMI、Tb.Sp降低，差異不具有統(tǒng)計學意義，M-AA組大鼠BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th升高，SMI降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），H-AA組大鼠BMD、Tb.N升高差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），E2組大鼠SMI降低，BMD、Tb.Th升高，差異具有統(tǒng)計學意義。從圖1也可以看出，OVX組大鼠股骨骨丟失嚴重，Sham、H-AA、E2這3組大鼠骨量丟失不明顯（P＜0.05），L-AA、M-AA組則存在少量骨丟失。

2.4 積雪草酸對大鼠股骨ALP表達量的影響從大鼠股骨提取的目的基因，然后進行Real-time PCR檢測3次ALP的表達量，檢測結果見表5與圖2。

表5 各組大鼠股骨ALP的相對表達水平Tab.5 The expression level of rat ALP in each groups

圖2 積雪草酸對大鼠股骨ALP表達量的影響Fig.2 Effect of AA on ALP mRNA expression

從圖2可以看出，與Sham組相比，OVX組大鼠ALP表達量降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與OVX組比較，L-AA組大鼠ALP表達量升高，差異不具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），M-AA組大鼠ALP表達量升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），H-AA組大鼠ALP表達量升高，差異不具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），E2組大鼠ALP表達量升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.5 積雪草酸對大鼠股骨DKK1蛋白表達量的影響從大鼠股骨提取的目的蛋白，然后進行Westerm Blot檢測3次DKK1蛋白的表達量，檢測結果見圖3。

圖3 積雪草酸對大鼠股骨DKK1表達量的影響Fig.3 Effect of AA on DKK1 expression

從圖3可以看出，與Sham組相比，OVX組大鼠DKK1表達量升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與OVX組比較，L-AA組大鼠DKK1表達量升高，差異不具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），M-AA組大鼠DKK1表達量升高，差異不具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），H-AA組大鼠DKK1表達量升高，差異不具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），E2組大鼠DKK1表達量升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

3 討論

絕經(jīng)后骨質疏松是老年人骨質疏松發(fā)生的主要原因，主要表現(xiàn)為骨量減少，骨脆性增加。本實驗采用3個月齡大鼠去卵巢進行骨質疏松造模，因為3個月齡大鼠生理狀態(tài)相當于人類青春期，體質量和生殖器發(fā)育已趨穩(wěn)定，骨形成與骨吸收基本處于平衡狀態(tài)［6］；另外大鼠骨質疏松模型是一個逐漸形成的過程，去卵巢后大鼠還需經(jīng)過幾個月飼養(yǎng)，骨質疏松癥才會形成，在去卵巢后幾個月時間里，大鼠骨骺開始封閉，骨代謝變得相對穩(wěn)定，骨小梁面積百分率下降且密度減少，骨小梁間隙增大等，提示骨質疏松癥形成，此時大鼠的生理狀態(tài)相當于婦女的絕經(jīng)期。本實驗在大鼠骨質疏松形成的過程中開始給藥積雪草酸，并且要在骨質疏松形成后與模型組大鼠進行骨質疏松指標檢測，飼養(yǎng)90 d后進行指標觀察。同時在實驗結束后，指標檢測發(fā)現(xiàn)與假手術組大鼠比較，去卵巢組大鼠體質量明顯降低，血清LDL、TC、TG增高，股骨SMI、Tb.Sp指標升高，但BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th指標降低；ALP的表達量降低，ALP作為一種與骨鈣化密切相關的蛋白，是骨形成的重要標記，是評估骨形成和骨轉化的主要指標，因此提高ALP的活性能夠促進成骨細胞的分化，可發(fā)揮抗骨質疏松作用，其表達量降低則說明骨細胞的增殖與分化減弱，加速了骨質疏松的形成；低密度脂蛋白受體相關蛋白5（DKK1）表達量升高，有文獻報道大鼠去卵巢骨質疏松的形成可能與阻斷Wnt傳遞生長刺激信號相關，在Wnt信號通路中，DKK1是低密度脂蛋白受體相關蛋白5的強抑制劑［7］，可抑制LRP5/LRP6，進而阻止成骨細胞的增殖與分化，導致骨形成功能下降。以上表明去卵巢組大鼠骨質疏松模型形成。

雌激素水平的降低是引起絕經(jīng)后骨質疏松發(fā)生的重要原因。有研究發(fā)現(xiàn)在機體骨骼中存在著雌激素和甲狀腺激素受體，在正常情況下雌激素可降低骨骼對甲狀腺激素的敏感性，減少甲狀腺激素對甲狀腺激素受體的結合，增加對降鈣素的敏感性，促進骨膠原生成、抑制骨吸收，促進骨生成［8］。而去卵巢大鼠由于雌激素水平的較低，促進甲狀腺受體與甲狀腺激素的結合，破壞了骨形成與骨吸收的動態(tài)平衡，造成骨質丟失嚴重，骨形成減少，導致了大鼠骨質疏松癥的形成［9］。同時實驗也發(fā)現(xiàn)與OVX組大鼠比較，E2組大鼠SMI均降低，BMD、Tb.Th升高，股骨ALP表達量升高，DKK1表達量降低，這與文獻報道結果相一致。綜上所述雌二醇可以抑制大鼠去卵巢后骨質疏松的形成。

積雪草酸是從藥用植物積雪草中提取的三萜酸，屬于五環(huán)三萜酸類化合物中的烏蘇烷型。有報道證實積雪草酸對實體瘤具有顯著的增殖抑制作用，如多發(fā)性骨髓瘤、乳腺癌細胞、黑色素瘤細胞等。本實驗采用積雪草酸提取液進行研究，分為低中高濃度積雪草酸提取液，結果發(fā)現(xiàn)3種濃度的積雪草酸提取液均可以提升大鼠股骨的BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th、ALP，并減低SMI、Tb.Sp、DKK1。骨質疏松癥是一種以單位體積內骨量減少、皮質骨變薄、骨微結構退化、骨生物力學性能降低、骨脆性增加容易致使骨折發(fā)生的系統(tǒng)性代謝疾病［10］。積雪草酸可以通過增加骨量來調節(jié)去卵巢大鼠骨質疏松癥狀，其主要是通過調節(jié)股骨ALP、DKK1的相對表達量來實現(xiàn)的。同時有研究［4］表明積雪草酸在抗人成骨細胞凋亡方面具有重要作用，正常情況下成骨細胞與破骨細胞是處以一種平衡狀態(tài)，當成骨細胞大量凋亡或者破骨細胞大量增殖時，機體處以一種骨質疏松骨量丟失的狀態(tài)，因此減少成骨細胞凋亡也將有利于減緩骨質疏松癥。綜上所述，積雪草酸可以通過調節(jié)ALP、DKK1，降低成骨細胞的凋亡來防治去卵巢大鼠骨質疏松癥的發(fā)生。去卵巢模擬絕經(jīng)期可以建立骨質疏松癥的動物模型，同時給于積雪草酸能有效地改善大鼠骨質疏松癥，其積雪草酸的防治作用與陽性藥物雌二醇作用相當。