靳文 劉云峰 勞鈺 李冬義 陳潔瓊 劉一炫 趙雅紅

1廣東省第二人民醫(yī)院心血管內(nèi)三科（廣州510317）；2南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院（廣州510282）

慢性心力衰竭是各種心臟疾病的嚴(yán)重表現(xiàn)或終末階段，具有發(fā)病率高、致殘率高、病死率高以及反復(fù)發(fā)作等特點(diǎn)，已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)危害公眾健康最為嚴(yán)重的疾病之一［1-3］。近年來，慢性心力衰竭的治療藥物、方法以及手段已發(fā)生顯著變化，突出表現(xiàn)在從傳統(tǒng)的利尿、強(qiáng)心、擴(kuò)血管等短期血流動力學(xué)治療向以神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)為主的治療策略轉(zhuǎn)變［4］。然而，我國慢性心力衰竭的患病率仍然居高不下，主要在于：（1）我國人口老齡化加劇和生活方式轉(zhuǎn)變以及診療技術(shù)的快速進(jìn)步，急性心肌梗死的發(fā)病率逐年升高、存活率獲得改善，顯著促進(jìn)了慢性心力衰竭發(fā)病率升高［4］；（2）心肌梗死后心肌纖維化是慢性心力衰竭的關(guān)鍵病理基礎(chǔ)和不良預(yù)后的重要影響因素，其發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明［5-6］。炎癥反應(yīng)廣泛參與慢性心力衰竭的發(fā)生和發(fā)展［7］。炎性小體是炎性反應(yīng)的初始傳感器，可能在心肌梗死后心肌纖維化中發(fā)揮重要調(diào)控作用。本研究通過構(gòu)建冠狀動脈左前降支結(jié)扎術(shù)構(gòu)建心肌梗死后心肌纖維化小鼠模型，旨在探討黑色素瘤缺乏因子2（absent in melanoma 2，AIM2）炎性小體在心肌梗死后心肌纖維化中的潛在作用。

1 對象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組Aim2-/-小鼠由南方醫(yī)科大學(xué)李杏博士惠贈。Aim2-/-小鼠為C57BL/6品系遺傳背景，本研究以其同窩對照野生型（wild type，WT）小鼠作為對照。本研究嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)動物倫理規(guī)章，嚴(yán)格遵循國際實(shí)驗(yàn)動物評估和認(rèn)可委員會（國際實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)評估認(rèn)證協(xié)會）的認(rèn)證要求，在此基礎(chǔ)上建立小鼠心肌梗死后心肌纖維化模型。本實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)廣東省第二人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。Aim2-/-、WT等小鼠分別予以冠狀動脈左前降支結(jié)扎法制備心肌梗死后心肌纖維化小鼠，分為Aim2-/-小鼠組、WT小鼠組，每組20只小鼠。

1.2 冠狀動脈左前降支結(jié)扎法建立心肌梗死后心肌纖維化小鼠模型Aim2-/-、WT等小鼠行冠狀動脈左前降支結(jié)扎術(shù)構(gòu)建心肌梗死后心肌纖維化模型：行冠狀動脈左前降支結(jié)扎術(shù)，術(shù)后1周即可出現(xiàn)心肌梗死后心肌纖維化。簡要操作如下：小鼠以2%異氟醚吸入誘導(dǎo)麻醉后以1.5%異氟醚維持麻醉。小鼠進(jìn)入麻醉狀態(tài)后固定于手術(shù)臺，備皮，消毒，連接心電圖標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)。經(jīng)口氣管插管，予以小鼠呼吸機(jī)輔助通氣。手術(shù)過程嚴(yán)格遵循無菌操作。于第4肋間開胸，在左心耳下1 mm處，用6-0號尼龍縫線結(jié)扎冠狀動脈左前降支近段。實(shí)時(shí)監(jiān)測心電圖變化。當(dāng)心電圖出現(xiàn)ST段持續(xù)抬高，左前降支支配區(qū)域心肌變蒼白，提示小鼠心肌梗死模型制備成功。關(guān)閉胸腔，逐層縫合組織以及皮膚，術(shù)后予以丁丙諾啡（0.1 mg/kg）腹腔內(nèi)注射止痛。如有脫水現(xiàn)象，予以腹腔注射適量無菌生理鹽水。腹腔注射青霉素15萬單位×3 d。4周后即可出現(xiàn)顯著的心肌梗死后心肌纖維化。

1.3 小鼠存活率和生命體征監(jiān)測每日記錄小鼠死亡事件和時(shí)間，計(jì)算各組小鼠存活率；采用小鼠生命體征監(jiān)護(hù)儀記錄心率、血壓（收縮壓和舒張壓）、呼吸頻率和幅度、血氧飽和度等。連續(xù)4周。

1.4 心臟超聲監(jiān)測小鼠心臟功能各組小鼠均行心臟超聲以監(jiān)測心臟結(jié)構(gòu)和功能。小鼠胸前備皮、10%水合氯醛麻醉固定，使用IE33彩色超聲檢測儀L15-7io模式（深度2.0 cm，速度60 mm/s），經(jīng)左室長軸獲2D，改M型模式，M線平行二尖瓣后基底部，以M型超聲測量以下左心室指標(biāo)：左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）、心排出量（cardiac output，CO）。每只小鼠在每個(gè)切面上檢測2次，每次連續(xù)讀取5個(gè)心動周期，取平均值。

1.5 Masson染色檢測心肌纖維化常規(guī)操作脫蠟；把切片置于Masson染色液泡制4 min；浸泡冰醋酸溶液1 min；置于磷鎢酸染5 min；0.2%冰醋酸洗滌2 min；以亮綠或苯膠藍(lán)液復(fù)染5 min；再把切片置于0.2%冰醋酸浸洗3次；即予中性樹膠把切片面封閉。顯微鏡下隨機(jī)以兩百倍取視野。每個(gè)樣本隨機(jī)取3～5個(gè)視野進(jìn)行分析。

1.6 Western Blot檢測Western Blot檢測心肌梗死后組織AIM2、TGF-β、CollagenⅠ以及IL-1β的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)左心室梗死區(qū)心肌組織AIM2、TGF-1β、CollagenⅠ以及IL-1β的表達(dá)。上述抗體均購買自Abcam公司。測定提取的各組心肌組織細(xì)胞總蛋白濃度，制膠，取100 μg各組組織蛋白樣品上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，用封閉液配制一抗（AIM2、IL-1β、TGF-β、CollagenⅠ）工作液，4℃下與育過夜，次日取膜于室溫下清洗4次，每次5 min。接著以含有二抗的封閉液與膜孵育1 h，室溫下清洗4次，每次5 min。加入化學(xué)發(fā)光底物，顯影，拍照。使用ImageJ軟件進(jìn)行檢測條帶灰度值與GAPDH的比值（磷酸化蛋白以磷酸化蛋白灰度值與相應(yīng)總蛋白灰度值比較）表示各組相應(yīng)蛋白的表達(dá)強(qiáng)度。目的蛋白的相對表達(dá)水平=目的蛋白的灰度值/內(nèi)參蛋白的灰度值。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 組織免疫熒光檢測心肌組織IL-1β和CollagenⅠ的表達(dá)首先將組織切片烤片、脫蠟、水化，抗原微波修復(fù)15 min，PBS清洗3次，37℃下5%BSA封閉40 min后加一抗工作液（IL-1β和CollagenⅠ）4℃孵育過夜后室溫復(fù)溫30 min，PBS清洗3次，每次5 min。接著，在37℃、避光情況下，加入二抗工作液孵育2 h，PBS清洗3次，每次5 min。防淬滅封片劑封片，4℃避光保存。最后在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間樣本的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Aim2-/-小鼠心肌梗死后生存率和心功能獲得改善生存分析結(jié)果顯示：與WT小鼠相比，Aim2-/-小鼠的心肌梗死后生存率獲得顯著改善（P＜0.05）。心臟超聲檢查結(jié)果顯示：與WT小鼠相比，Aim2-/-小鼠的心肌梗死后LVEF和CO增強(qiáng)（P＜0.05）。見圖1。

圖1 Aim2-/-和WT小鼠心肌梗死后生存曲線和心功能變化Fig.1 Survival curve and cardiac function changes after myocardial infarction in Aim2-/-and WT mice

2.2 Aim2-/-小鼠心肌梗死后心肌纖維化減輕Masson染色結(jié)果顯示：與WT小鼠相比，Aim2-/-小鼠的心肌梗死后心肌纖維化程度減輕。見圖2。

圖2 Aim2-/-和WT小鼠心肌梗死后心肌纖維化（Masson染色）Fig.2 Myocardial fibrosis after myocardial infarction in Aim2-/-and WT mice（Masson staining）

2.3 Aim2-/-小鼠心肌梗死后心肌纖維化區(qū)域IL-1β和CollagenⅠ表達(dá)減輕免疫組織熒光檢測結(jié)果顯示：與WT小鼠相比，Aim2-/-小鼠的心肌梗死后心肌纖維化和缺血纖維化組織中IL-1β、CollagenⅠ表達(dá)均減弱。見圖3。

2.4 Aim2-/-小鼠心肌梗死后心肌纖維化組織TGF-β、CollagenⅠ以及IL-1β的表達(dá)減輕Western Blot 檢測結(jié)果顯示：與WT相比，Aim2-/-小鼠的心肌梗死后心肌纖維化組織中TGF-β、IL-1β、CollagenⅠ表達(dá)均減弱。見圖4。

3 討論

AIM2是PHYIN蛋白家族成員，廣泛存在于心肌成纖維細(xì)胞（Cardiac fibroblasts，CFs）［8］，主要定位于細(xì)胞質(zhì)，為損傷相關(guān)分子模式分子雙鏈DNA、線粒體DNA受體，具有兩個(gè)特征性結(jié)構(gòu)域：N端熱蛋白結(jié)構(gòu)域（pyrin domain，PYD）和C端200氨基酸重復(fù)序列的造血干擾素誘導(dǎo)核蛋白（hematopoietic interferon-inducible nuclear proteins with 200 amino acid repeats，HIN-200）結(jié)構(gòu)域，主要通過HIN-200結(jié)構(gòu)域特異性識別細(xì)胞質(zhì)中的雙鏈DNA、mtDNA，釋放PYD而招募接頭蛋白ASC（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD），形成 AIM2炎性小體（AIM2-ASC-Pro-Caspase-l），依賴于半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-1（cysteinyl aspartate specific protease 1，Caspase-1）的活化進(jìn)一步裂解pro-IL-1β、pro-IL-18，產(chǎn)生并分泌IL-1β、IL-18，或裂解gasdermin D（GSDMD），觸發(fā)細(xì)胞焦亡，分泌IL-1β、IL-18等炎癥因子并釋放至細(xì)胞外，快速啟動免疫炎性反應(yīng)［9］。本研究首次發(fā)現(xiàn)Aim2-/-小鼠心肌梗死后存活率和心臟功能（左室射血分?jǐn)?shù)和心排血量）改善（P＜0.05）、心肌纖維化程度減輕，心肌梗死后心肌纖維化組織IL-1β、TGF-β、CollagenⅠ等表達(dá)降低，提示AIM2炎性小體參與調(diào)控心肌梗死后心肌纖維化，可能是心肌梗死后心力衰竭的重要治療靶點(diǎn)。

炎性小體作為心肌梗死炎癥反應(yīng)的初始傳感器，在心肌梗死后心肌纖維化中發(fā)揮重要調(diào)控作用［10］。ASC、Caspase-1是AIM2炎性小體組成和活化的關(guān)鍵分子。已有研究［10］發(fā)現(xiàn)與野生型小鼠相比，ASC、Caspase-1基因敲除小鼠在心肌缺血再灌注損傷后CFs的增殖和炎癥因子分泌等活性顯著降低，心肌梗死后心肌纖維化改善。其次，IL-1β和IL-18是炎性小體活化后分泌的主要炎癥因子，能夠有效促進(jìn)CFs功能活化和心肌纖維化［11-12］。以上研究結(jié)果提示炎性小體成員ASC、Caspase-1是促進(jìn)心肌梗死后心肌纖維化的重要分子。AIM2作為模式識別受體和炎性小體家族重要成員，是否促進(jìn)心肌梗死后心肌纖維化？為此，本研究利用Aim2-/-小鼠及其同窩對照野生型小鼠，采用冠狀動脈左前降支結(jié)扎術(shù)構(gòu)建心肌梗死后心肌纖維化模型，觀察小鼠存活狀況。與WT小鼠相比，Aim2-/-小鼠的存活率以及心臟功能指標(biāo)LVEF和CO顯著改善，提示Aim2-/-小鼠能夠改善心肌梗死后心力衰竭。Masson染色結(jié)果顯示Aim2-/-小鼠心肌梗死后心肌纖維化程度減輕，Western Blot和組織免疫熒光技術(shù)檢測結(jié)果顯示心肌梗死后心肌纖維化組織CollagenⅠ分子表達(dá)降低，提示Aim2-/-小鼠存活率和心臟功能改善與心肌梗死后心肌纖維化減輕密切相關(guān)。

圖3 Aim2-/-和WT小鼠心肌梗死后正常心肌、心肌梗死纖維化、心肌梗死缺血纖維化等組織中CollagenⅠ和IL-1β的表達(dá)Fig.3 Expression of Collagen I and IL-1β in normal myocardium，ischemic myocardial fibrosis and infarcted myocardial fibrosis of Aim2-/-and WT mice after myocardial infarction

心臟固有CFs是構(gòu)成心肌組織的主要細(xì)胞和心臟CFs的最主要來源，遍布于心肌組織，包繞著心肌細(xì)胞并與心肌細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）相連接，具有調(diào)控ECM代謝、合成分泌多種細(xì)胞因子、介導(dǎo)心肌電/機(jī)械信號傳導(dǎo)，參與血管新生等功能［13］。由于能夠耐受心肌缺血，CFs在心肌梗死后早期即可迅速對壞死心肌釋放的損傷相關(guān)分子模式分子作出反應(yīng)，直接表現(xiàn)為CFs增殖、遷移、向肌成纖維細(xì)胞（cardiac myofibroblasts，CMFs）轉(zhuǎn)分化、ECM產(chǎn)生等能力增強(qiáng)，間接表現(xiàn)為通過自分泌和旁分泌大量細(xì)胞因子［如轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor β，TGF-β）、IL（interleukin，IL）-1β］作用于心肌組織中CFs、心肌細(xì)胞、免疫細(xì)胞等各種靶細(xì)胞［13-14］。TGF-β、IL-1β等是介導(dǎo)CFs功能活化的重要因子。其中，TGF-β主要通過TGF-β-Smad2/3信號通路促進(jìn)CFs向CMFs轉(zhuǎn)分化、ECM產(chǎn)生等方式調(diào)控心肌梗死后心肌纖維化［15］。IL-1β通過與其受體結(jié)合介導(dǎo) JNK、p-38MAPK、Erk等信號通路激活NF-κB促進(jìn)CFs的增殖、分化、遷移以及炎癥因子分泌［12，15］?？梢姡珻Fs既是心肌梗死后心肌纖維化過程中的主要作用細(xì)胞，也是炎癥因子重要來源和靶點(diǎn)，在心肌梗死后心肌纖維化過程中發(fā)揮主導(dǎo)作用。本研究中Western Blot和（或）組織免疫熒光技術(shù)檢測結(jié)果顯示：與WT小鼠相比，Aim2-/-小鼠心肌梗死后心肌纖維化組織IL-1β、TGF-β表達(dá)降低，提示Aim2-/-小鼠心肌梗死后心肌纖維化組織CFs的細(xì)胞因子分泌功能減退。

圖4 Aim2-/-和WT小鼠心肌梗死后心肌纖維化組織TGF-β、CollagenⅠ以及IL-1β的表達(dá)Fig.4 Expression of TGF-β，CollagenⅠand IL-1β in myocardial fibrosis tissue of Aim2-/-and WT mice after myocardial infarction

本研究存在的局限性在于針對AIM2炎性小體如何調(diào)控TGF-β促進(jìn)心肌梗死后心肌纖維的機(jī)制尚不清楚。在今后的研究中，將通過體內(nèi)外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討AIM2炎性小體調(diào)控心肌梗死后心肌纖維化的分子機(jī)制。

綜上，本研究結(jié)果提示：AIM2炎性小體是心肌梗死后心力衰竭的重要調(diào)控分子，可能與其促進(jìn)心肌梗死后心肌纖維化的作用密切相關(guān)。