劉曉紅，王菊梅*，閆倫春，單慧明，譚壯忱，楊立波

長期過度飲酒會(huì)使肝細(xì)胞反復(fù)發(fā)生脂肪變性甚至壞死，同時(shí)導(dǎo)致酒精性肝損傷，最終導(dǎo)致肝癌[1]。使用保肝藥物可以有效緩解酒精肝，但是大量使用藥物會(huì)對(duì)腎臟等其他器官造成較大的負(fù)擔(dān)。補(bǔ)充維生素、礦物質(zhì)等可以提高自身免疫力達(dá)到緩解酒精性肝損傷功效[2]。茶花粉水提物的成分復(fù)雜，包含有蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類、脂類、維生素、微量元素及大量的生物活性物質(zhì)[3]，服用茶花粉水提物可以補(bǔ)充蛋白質(zhì)、脂肪充維生素、礦物質(zhì)等有效緩解酒精性肝損傷[4]。目前對(duì)茶花粉水提物成分的研究較多，但有關(guān)茶花粉水提物對(duì)酒精肝的影響的研究相對(duì)較少。本文旨在研究茶花粉水提物對(duì)酒精性肝損傷大鼠模型肝臟組織中膠原蛋白Ⅰ(collagen, type I, alpha 1,COL1A1)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)表達(dá)水平的影響，以期了解茶花粉水提物對(duì)酒精性肝損傷大鼠模型肝臟組織中COL1A1、α-SMA表達(dá)水平的作用機(jī)理，從而為酒精性肝損傷的治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

選取60只雄性SD大鼠，體重200±30 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(京)2017-0022，分12個(gè)籠子飼養(yǎng)，每個(gè)籠子5只。在本院動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室，飼養(yǎng)溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度50%～65%，無噪音條件下自由飲水進(jìn)食。

1.2 藥物與試劑

茶花粉水提物購自揚(yáng)州同人生物工程有限公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶檢測試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶試劑盒購自上海恪敏生物科技有限公司、超氧化物歧化酶試劑盒及丙二醛試劑盒均購自上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司；COL1A1和α-SMA抗體購自武漢博士得生物有限公司；中性福爾馬林、酒精、二甲苯購自天津科密歐有限公司；紅星二鍋頭購自武商量販。

1.3 儀器

BS-124s 型電子天平購自北京賽多斯儀器系統(tǒng)有限公司；TDL-5 型臺(tái)式離心機(jī)購自上海安亭科學(xué)儀器廠；光學(xué)顯微鏡購自東莞市同創(chuàng)儀器有限公司；切片機(jī)購自德國Leica公司；低溫離心機(jī)購自湖南恒諾離心機(jī)有限公司；蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜儀購自美國Bio-Rad公司。

2 方法

2.1 建立模型

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，使用 56°紅星二鍋頭灌胃，第一周灌胃計(jì)量為：6 mL/kg；第二周灌胃計(jì)量為：8 mL/kg；第三周灌胃計(jì)量為：10 mL/kg，第四至十周灌胃劑量為：11 mL/kg。具體造模方法和判斷模型是否成功參考梁惠等[5]研究。

2.2 分組及藥物干預(yù)

60只FPS級(jí)雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組，每組15只，其中45只大鼠制成酒精性肝損傷模型，建立模型和判斷模型是否建立成功參考梁惠等[5]研究。將制成模型的大鼠分為模型組、低劑量茶花粉水提物組和高劑量茶花粉水提物組，剩下15只作為對(duì)照組；低劑量茶花粉水提物組大鼠使用50 mg/kg·d-1的茶花粉水提物灌胃，高劑量茶花粉水提物組大鼠使用100 mg/kg·d-1的茶花粉水提物灌胃，對(duì)照組和模型組分別以等量的生理鹽水灌胃處理，每天一次，持續(xù)21 d。

2.3 檢測項(xiàng)目

2.3 1 測量大鼠肝臟質(zhì)量并計(jì)算肝指數(shù)

使用脊椎脫臼法處死大鼠后，取大鼠肝臟并準(zhǔn)確稱量大鼠肝臟質(zhì)量，計(jì)算大鼠肝指數(shù)。

2.3.2 檢測大鼠血清ALT、AST水平、肝組織SOD、MAD水平

藥物治療結(jié)束后24 h，給予3%戊巴比妥鈉(生產(chǎn)廠家：上海依赫生物科技有限公司；生產(chǎn)批號(hào)：20180212)麻醉，腹主動(dòng)脈取血0.5 mL，使用離心分離血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(glutamic pyruvic transaminase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(glutamic oxaloacetic transaminase，AST)試劑盒子檢測其ALT及AST水平，操作方法嚴(yán)格按照試劑盒子說明書操作。

取大鼠肝組織，在冷生理鹽水中漂洗后濾紙拭干。加入肝組織重量9倍的生理鹽水并置入勻漿器中在冰水中勻漿5 min，使用恒溫離心機(jī)在4℃、3 000 r/min條件下離心10 min。分別吸取0.1 mL上清液，嚴(yán)格按照超氧化物歧化酶(total superoxide disumutase,T-SOD)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒子說明書上的操作方法測定SOD活性和MDA含量。

2.3.3 Western blot 檢測蛋白表達(dá)水平

按照Western blot 檢測方法操作，使用蛋白質(zhì)條帶用掃描儀進(jìn)行掃描，以β-actin為內(nèi)參，應(yīng)用Imagaquent 5.1軟件對(duì)COL1A1和α-SMA蛋白質(zhì)條帶灰度進(jìn)行相對(duì)定量分析。以目的蛋白條帶與 β-actin 灰度比值表示蛋白相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次，取平均值為最終結(jié)果。

2.3.4 HE染色觀察大鼠肝組織

使用HE染色，具體步驟為：使用二甲苯浸泡10～15 min，分別使用100%、95%、80%、70%、50%酒精的酒精依次沖洗2～3 min，使用蒸餾水沖洗1 min后使用蘇木精浸泡10～15 min，再使用蒸餾水沖洗20 min。使用鹽酸酒精分化后再次使用水沖洗10～20 min后使用氨水沖洗一次，在此重復(fù)酒精沖洗過程(100%、95%、80%、70%、50%酒精的酒精依次沖洗2～3 min)，完成后使用伊紅染色30s后使用95%酒精Ⅰ和95%酒精Ⅱ浸泡1～2 min后再次使用100%酒精Ⅰ和100%酒精Ⅱ浸泡10～15 min，分別使用二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ浸泡10～15 min最后中性樹膠封片即可。在電子顯微鏡下使用10×40的倍鏡觀察肝組織情況。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 大鼠肝臟質(zhì)量及肝指數(shù)

由表1可以看出，相比對(duì)照組，模型組大鼠體質(zhì)量無顯著差異(T=0.083,P=0.935)，模型組大鼠肝質(zhì)量(T=5.748,P=0.000)及肝指數(shù)(T=15.257,P=0.000)顯著升高。相比模型組，低劑量茶花粉水提物組大鼠體質(zhì)量無顯著差異(T=0.527,P=0.595)，大鼠肝質(zhì)量(T=4.156,P=0.000)及肝指數(shù)(T=12.952,P=0.000)顯著降低。相比低劑量茶花粉水提物組，高劑量茶花粉水提物組大鼠體質(zhì)量無顯著差異(T=0.540,P=0.592)，肝質(zhì)量(T=0.614,P=0.534)及肝指數(shù)(T=2.738,P=0.016)顯著降低。

3.2 大鼠血清ALT、AST水平及肝組織SOD、MAD水平

由圖1可以看出，相比對(duì)照組大鼠血清ALT(30.21±2.32)U/L、AST(62.36±2.87)U/L、SOD(138.21±6.32)U/mL、MAD(5.81±1.08)mmol/mL，模型組大鼠血清ALT顯著升高(79.32±2.89)U/L(T=52.105,P=0.000)，AST顯著升高(115.35±5.01)U/L(T=35.544,P=0.000)，SOD顯著降低(70.21±29.32)U/mL(T=8.780,P=0.000)；MAD顯著升高(13.01±1.80)mmol/mL(T=18.25,P=0.000)。相比模型組，低劑量茶花粉水提物組ALT顯著降低(53.21±3.21)U/L(T=23.414,P=0.000)，AST顯著降低(80.37±4.01)U/L(T=21.11,P=0.000)，SOD顯著升高(120.32±12.39)U/mL(T=6.097,P=0.000)，MAD顯著降低(9.85±1.70)mmol/mL(T=6.076,P=0.000)。相比低劑量茶花粉水提物組，高劑量茶花粉水提物組ALT顯著降低(44.87±2.49)U/L(T=7.950,P=0.000)，AST顯著降低(74.36±4.65)U/L(T=3.790,P=0.007)，SOD顯著升高(135.28±8.23)(T=3.895,P=0.006)，MAD顯著降低(7.72±2.31)mmol/mL(T=2.876,P=0.007)。

表1 大鼠肝臟質(zhì)量及肝指數(shù)

注：與對(duì)照組相比，**P<0.01；與模型組相比##P<0.01

圖1大鼠血清ALT、AST水平及肝組織SOD、MAD水平 與對(duì)照組相比**P<0.01；與模型組相比##P<0.01;A為各組大鼠ALT含量水平；B為各組大鼠AST含量水平；C為各組大鼠SOD含量水平；D為各組大鼠MAD含量水平

3.3 大鼠肝組織COL1A1和α-SMA蛋白表達(dá)水平

由圖2可以看出，相比對(duì)照組COL1A1和α-SMA蛋白相對(duì)表達(dá)量(0.40±0.11)、(0.51±0.12)，模型組COL1A1蛋白表達(dá)量(1.49±0.17)顯著升高(T=20.184,P=0.000)，α-SMA蛋白表達(dá)量(1.50±0.16)顯著升高(T=19.171,P=0.000)。相比模型組，低劑量茶花粉水提物組COL1A1蛋白表達(dá)量(0.85±0.15)顯著降低(T=10.933,P=0.000)，α-SMA蛋白表達(dá)量(1.15±0.14)顯著降低(T=6.375,P=0.000)。相比低劑量茶花粉水提物組，高劑量茶花粉水提物組COL1A1蛋白表達(dá)量(0.65±0.12)顯著降低 (T=4.032,P=0.004)，α-SMA蛋白表達(dá)量(0.84±0.14)顯著降低(T=6.064,P=0.000)。

圖2大鼠肝組織COL1A1和α-SMA蛋白表達(dá)水平 與對(duì)照組相比**P<0.01；與模型組相比##P<0.01；A為蛋白質(zhì)印記觀察COL1A1和α-SMA蛋白表達(dá)情況；B為COL1A1和α-SMA蛋白相對(duì)表達(dá)情況

3.4 HE染色觀察結(jié)果

對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞較為完整，且細(xì)胞核清晰可見，細(xì)胞核與細(xì)胞漿呈鮮明對(duì)比；模型組大鼠細(xì)胞出現(xiàn)較多的細(xì)胞核壞死，且細(xì)胞出現(xiàn)纖維化狀態(tài)，部分細(xì)胞質(zhì)間出現(xiàn)空隙，低劑量茶花粉水提物組大鼠，細(xì)胞核出現(xiàn)壞死的數(shù)目降低，且細(xì)胞纖維化顯著降低；高劑量茶花粉水提物組大鼠肝細(xì)胞無顯著纖維化，且細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)呈鮮明對(duì)比。

4 討論

近年來，對(duì)花粉水提物的研究越來越多，其中茶花粉水提物因其含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和抗氧化等性質(zhì)受到廣泛的關(guān)注[6]。研究表明：花粉水提物具有降血脂、降血糖、抗動(dòng)脈粥樣硬化、治療前列腺等功效[7-8]。茶花粉水提物中含有多酚和黃酮類化合物，這兩類化合物是天然的抗氧化劑，可以降低人體內(nèi)的過氧化反應(yīng)，對(duì)人體健康有著非常重要的作用[9]。

酒精在肝臟中的分解代謝會(huì)促進(jìn)活性氧的產(chǎn)生，使得ROS在人體內(nèi)大量累積，引發(fā)肝細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化而損傷肝細(xì)胞。夏婷研究表明：氧應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化是酒精引起肝臟損傷的重要原因之一[10]?？寡趸w系主要包括酶系和非酶系兩大類，酶體系中，最主要的是SOD，其含量多少可以直接反應(yīng)氧化應(yīng)激的程度[11]。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠體內(nèi)SOD含量顯著減少，說明其肝臟內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)顯著增強(qiáng)，使用茶花粉水提物處理后，SOD含量顯著增加，說明其氧化應(yīng)激受到了抑制，且隨著茶花粉水提物處理濃度增加，SOD含量顯著升高，說明茶花粉水提物可以降低大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)且隨著使用濃度增加，大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)抑制程度增加。趙高遠(yuǎn)[12]研究表明：SOD可以反映體內(nèi)氧化應(yīng)激能力的強(qiáng)弱，且升高SOD濃度可以有效抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，保護(hù)肝臟組織，與本研究得出的結(jié)論相一致。吳志剛等[13]研究表明:MAD含量增加會(huì)使得肝內(nèi)大量脂質(zhì)沉積并且會(huì)使得機(jī)體的抗氧化能力減弱。肝細(xì)胞膜和線粒體膜受損，引起血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶升高，同時(shí)也會(huì)使得大鼠的肝組織游離脂肪酸水平明顯升高，誘發(fā)肝細(xì)胞死亡導(dǎo)致肝臟炎癥反應(yīng)和細(xì)胞功能障礙[14]。MAD的含量可以反映機(jī)體內(nèi)發(fā)生脂質(zhì)過氧化的程度，使自由基與生物膜中的多不飽和脂肪酸發(fā)生反應(yīng)并使得氧化產(chǎn)物分解，由此可以得知MAD的含量可間接反映出細(xì)胞損傷的程度[15]。本實(shí)驗(yàn)中可以看出，模型組大鼠MAD含量顯著升高，說明肝臟內(nèi)脂質(zhì)增加，且脂質(zhì)氧化程度較高。使用茶花粉水提物處理后大鼠肝組織中MAD含量顯著降低，說明大鼠肝臟組織中的脂質(zhì)水平降低、脂質(zhì)氧化程度也較低，肝臟得到了有效的保護(hù)，且隨著茶花粉水提物處理劑量的增加，脂質(zhì)的氧化反應(yīng)逐漸降低。彭國霞等[16]研究表明：花粉具有較強(qiáng)的抗氧化活性可以明顯改善酒精引起的肝細(xì)胞損傷，與本研究得出的結(jié)論相一致。

圖3HE染色觀察大鼠肝組織(×400) A為對(duì)照組(較為完整)；B為模型組(嚴(yán)重纖維化)；C為低劑量茶花粉水提物組(較輕纖維化)；D為高劑量茶花粉水提物組(無顯著纖維化)

血清ALT、AST活力的大小是檢驗(yàn)肝臟損傷的重要指標(biāo)之一。劉鑫等[17]研究表明：血清ALT、AST活力的大小，直接反映了肝細(xì)胞受損的程度。本實(shí)驗(yàn)中可以看出，模型組大鼠血清ALT、AST活力顯著增加，說明大鼠肝臟受損程度顯著增加。使用茶花粉水提物處理后大鼠血清ALT、AST活力顯著降低，說明茶花粉水提物處理可以有效降低ALT、AST活力保護(hù)肝臟，且隨著茶花粉水提物使用劑量增加，ALT、AST活力進(jìn)一步降低，說明茶花粉水提物可以抑制ALT、AST活力且在一定濃度范圍內(nèi)呈濃度依賴性。趙燕平等[18]通過探討破壁靈芝孢子粉對(duì)大鼠肝臟損傷研究表明：血清ALT、AST活力肝組織炎癥程度關(guān)系密切，與本研究得出的結(jié)論相一致。

酒精還會(huì)損傷產(chǎn)生的細(xì)胞因子或炎性因子刺激肝星狀細(xì)胞的活化[19]，肝星狀細(xì)胞活化后會(huì)伴有NF-kB等轉(zhuǎn)錄因子的激活及c-myb基因表達(dá)的增強(qiáng)，而c-myb蛋白可結(jié)合α-SMA基因調(diào)控區(qū)，表達(dá)平滑肌激動(dòng)細(xì)胞骨架蛋白α-SMA，且α-SMA的表達(dá)程度與肝星狀細(xì)胞活化的程度及數(shù)量呈正相關(guān)[20-21]。α-SMA陽性的肝星狀細(xì)胞出現(xiàn)的NF-kB核轉(zhuǎn)位活性同時(shí)有靶基因的表達(dá)，產(chǎn)生急性期蛋白、黏附因子、生長因子等，加速肝纖維化進(jìn)程[22-23]。肝纖維化發(fā)生的主要變化是星狀細(xì)胞的活化增殖，當(dāng)肝星狀細(xì)胞活化后，儲(chǔ)存的維生素A脂滴含量明顯減少，同時(shí)維甲酸及其受體含量也下降。活化的肝星狀細(xì)胞增殖，并分泌大量膠原和一系列促纖維化細(xì)胞因子，使 COL1A1生成明顯增加，同時(shí)抑制膠原降解因子生成，使膠原降解下降，最終導(dǎo)致膠原沉積，誘發(fā)肝臟纖維化。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠COL1A1和α-SMA蛋白表達(dá)水平顯著增加，使用茶花粉水提物處理后COL1A1和α-SMA蛋白表達(dá)水平顯著降低，說明茶花粉水提物處理可以有效抑制COL1A1和α-SMA蛋白表達(dá)，同時(shí)防止肝臟的纖維化。畢曉娟等[24]研究表明：肝臟內(nèi)的COL1A1和α-SMA蛋白表達(dá)與肝臟纖維化密切相關(guān)，與本研究得出的結(jié)論相一致。

綜上所述，茶花粉水提物可以降低酒精性肝損傷，同時(shí)降低大鼠肝臟組織中COL1A1、α-SMA表達(dá)，有效緩解酒精性肝損傷，其作用機(jī)制可能與茶花粉水提物可以抑制肝臟組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。