■李 媛 孔凡林 畢研亮 刁其玉 屠 焰

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所奶牛營(yíng)養(yǎng)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100081）

對(duì)反芻動(dòng)物而言，氨基酸營(yíng)養(yǎng)不僅支撐動(dòng)物機(jī)體生長(zhǎng)，也是保證瘤胃微生物生長(zhǎng)及瘤胃內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定必不可缺的因素。Lys及Met是反芻動(dòng)物的主要限制性氨基酸，二者也是瘤胃生長(zhǎng)和微生物的蛋白（MCP）合成的必需氨基酸。Guliye 等（2007）[1]研究表明，培養(yǎng)基中去除Met 會(huì)導(dǎo)致瘤胃發(fā)酵效率下降。王洪榮等（2010）[2]指出Met 和Lys 對(duì)瘤胃細(xì)菌和原蟲的生長(zhǎng)具有一定的限制性，其中任一種氨基酸缺乏都會(huì)限制瘤胃細(xì)菌和原蟲的生長(zhǎng)。MCP 主要氨基酸組成除受日糧氨基酸水平影響外，也受瘤胃微生物種類的影響。Rodríguez 等（2000）[3]和周勃等（2000）[4]結(jié)果發(fā)現(xiàn)固相菌中Lys 含量高于液相菌。王洪榮等（2009）[5]進(jìn)一步證實(shí)原蟲、細(xì)菌和微生物的氨基酸組成存在一定的差異，細(xì)菌和微生物的Lys 含量高于原蟲。6 月齡的生長(zhǎng)母牛的瘤胃已基本發(fā)育，瘤胃微生物較豐富，已具備較強(qiáng)的消化功能[6]，此時(shí)小腸的氨基酸便主要來源于瘤胃MCP 和日糧過瘤胃蛋白。但MCP 的氨基酸組成存在不穩(wěn)定性，不能確定其是否滿足生長(zhǎng)母牛對(duì)氨基酸的需要，所以為保證生長(zhǎng)，應(yīng)增加進(jìn)入小腸的日糧真蛋白中氨基酸的量。根據(jù)已知或預(yù)測(cè)的氨基酸適宜模型，通過向日糧中添加過瘤胃氨基酸來實(shí)現(xiàn)日糧氨基酸平衡，可減少瘤胃降解，提升小腸理想真蛋白量及氨基酸吸收率的有效方法。本研究基于以上研究背景，通過扣除理論氨基酸平衡組30%的Lys、Met 及Thr研究其對(duì)瘤胃發(fā)酵及微生物區(qū)系的影響，探究扣除日糧過瘤胃氨基酸水平是否會(huì)對(duì)6～9 月齡生長(zhǎng)母牛瘤胃內(nèi)環(huán)境產(chǎn)生影響，也為6～9 月齡生長(zhǎng)母牛氨基酸適宜模式的建立提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)采用氨基酸部分扣除法，選用Lys、Met 及Thr 3種過瘤胃氨基酸產(chǎn)品。其中過瘤胃Met（蛋氨酸羥基類似物，HMBi）購于安迪蘇有限公司，Met 含量44.4%，過瘤胃率50%；過瘤胃Lys（RPLys）購于亞禾生物有限公司，Lys含量36%，過瘤胃率80%；過瘤胃Thr（RPThr）購于浙江康德權(quán)有限公司，Thr 含量40%，過瘤胃率90%。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與日糧

本試驗(yàn)于2017 年9 月～12 月在山東省銀香偉業(yè)國(guó)際第三牧場(chǎng)開展。隨機(jī)選取72 頭（5.5±0.5）月齡、體重（200±9）kg 的荷斯坦生長(zhǎng)母牛，按體重、日齡相近的原則分為4 組，每組18 頭，每頭為1 個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)以Lys、Met及Thr的水平為試驗(yàn)因子，參照Wang等（1989）提出的氨基酸部分扣除法，采用單因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì)分為理論氨基酸平衡（PC）組、扣除30%Lys（PD-Lys）組、扣除30%Met（PD-Met）組和扣除30%Thr（PD-Thr）組。參照美國(guó)NRC（2001）中體重為250 kg的奶牛生長(zhǎng)母牛日增重1 000 g的營(yíng)養(yǎng)需要量配制基礎(chǔ)全混合日糧（TMR）。在基礎(chǔ)TMR 中分別添加3 種過瘤胃氨基酸以達(dá)到各處理組試驗(yàn)日糧氨基酸的水平。PC 組母牛日糧的氨基酸水平根據(jù)Zinn（1998）[7]等提出的生長(zhǎng)牛Met 需要量公式METR=1.956+0.029 2×ADG×[268-(29.4×0.055 7BW0.75×ADG1.097)÷ADG]+0.112×BW0.75，按體重250 kg及日增重1 kg/d計(jì)算得到小腸Met需要量。并參照仔豬氨基酸適宜比例Lys∶Met∶Thr=100∶30∶65（Chung 等，1992）[8]，確定Lys 及Thr 的添加量。PD-Lys、PD-Met和PD-Thr 組試驗(yàn)日糧中RP-Lys、RP-Met、RP-Thr 添加量分別比PC 組降低30%。各組TMR 的原料組成、營(yíng)養(yǎng)水平及氨基酸水平如表1 和表2 所示。試驗(yàn)期105 d，前15 d為預(yù)飼期，正試期90 d。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)，%）

表2 試驗(yàn)日糧的氨基酸水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)，%）

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)生長(zhǎng)母牛均采用單欄單飼（每頭牛3 m×2.2 m，鋪有稻殼和發(fā)酵牛糞混合墊料），TMR 每日飼喂兩次（8:00 和16:00），自由飲水，TMR 飼喂量根據(jù)采食量變化每30 d 調(diào)整1 次。各組氨基酸添加量根據(jù)生長(zhǎng)母牛日增重及采食量變化每30 d 調(diào)整1次。所有試驗(yàn)牛均按牛場(chǎng)正常的免疫程序進(jìn)行免疫，本次實(shí)驗(yàn)中，于正試期30 d 時(shí)全部牛注射布病疫苗。

1.4 樣品采集和測(cè)定方法

正試期開始及結(jié)束當(dāng)天晨飼后2 h，每組選取接近組平均體重的6頭牛，采用滅菌口腔采樣器采集瘤胃液，立即用便攜pH計(jì)（Testo-206-pH2）測(cè)定瘤胃液pH值，分裝于15 ml離心管及2 ml凍存管中，用于測(cè)定NH3-N、MCP及VFA等發(fā)酵參數(shù)以及瘤胃微生物相關(guān)指標(biāo)。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2016 進(jìn)行初步整理，以SAS 9.4 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。瘤胃微生物組成（門、屬水平）采用單因素方差分析（one-way ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，差異顯著時(shí)采用Duncan's進(jìn)行多重比較。其余數(shù)據(jù)采用Mixed 模型進(jìn)行分析，用LSD 法進(jìn)行多重比較。統(tǒng)計(jì)結(jié)果以（P＜0.05）表示差異顯著，（0.05≤P＜0.10）表示有差異顯著的趨勢(shì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 瘤胃發(fā)酵參數(shù)

由表3 可知，4 個(gè)處理組間全期平均pH 值、NH3-N 濃度和MCP 含量均無顯著差異。其中，瘤胃液pH值均在6.6～7.0 之間，7 月齡時(shí)，PD-Lys 及PD-Met 組瘤胃pH值顯著高于PC組，但8及9月齡pH值各組間差異不顯著（P＞0.05）；扣除3 種氨基酸對(duì)生長(zhǎng)母牛瘤胃液NH3-N 濃度均沒有顯著影響（P＞0.05）；8 月齡時(shí)PD-Met 的MCP 濃度顯著低于PC 組（P＜0.05），9 月齡時(shí)PD-Met的MCP濃度與各組間比沒有顯著差異（P＞0.05），數(shù)值上較PC組低。

表3 部分扣除Lys、Met及Thr對(duì)6～9月齡生長(zhǎng)母牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

表4給出了試驗(yàn)期內(nèi)各處理組瘤胃VFA的變化，其中PD-Met 組全期平均TVFA 濃度顯著低于PC 組（P＜0.05），7月齡時(shí)，PD-Lys及PD-Met組瘤胃TVFA濃度顯著低于PC組（P＜0.05）；但9月齡時(shí)，各處理組間總VFA 濃度無顯著差異（P＞0.05）。9 月齡時(shí)，PD-Lys組、PD-Met 組及PD-Thr 組與PC 組相比，乙酸和丁酸占TVFA 的百分比均無顯著差異（P＞0.05）。但9 月齡時(shí)，PD-Met 組的丙酸含量顯著高于PC 組（P＜0.05），從而導(dǎo)致該組乙丙比顯著低于PC 組（P＜0.05）；PD-Lys 組和PD-Thr 組的丙酸濃度較PC 組比無顯著差異（P＞0.05）。

2.2 瘤胃微生物區(qū)系

從表5 可知，扣除Met 后，瘤胃微生物Shannon、Ace 及Chao 指數(shù)全期平均值較PC 組顯著下降（P＜0.05），此外，PD-Met組9月齡時(shí)生長(zhǎng)母牛瘤胃微生物Ace 及Chao 指數(shù)均顯著低于PC 組（P＜0.05），但扣除Lys 及Thr 未對(duì)生長(zhǎng)母牛微生物多樣性指數(shù)產(chǎn)生顯著影響（P＞0.05）。

圖1 為對(duì)門及屬水平的微生物豐度進(jìn)行主成分分析的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在門及屬水平上PD-Lys 組（Lys）、PD-Met組（Met）、PD-Thr組（Thr）及PC組在PCA圖中距離相近，表明4 個(gè)處理組門、屬水平的物種組成和豐富相似，差異較小未達(dá)到組間顯著分離的程度。

在PCA分析的基礎(chǔ)上，對(duì)門水平物種組成進(jìn)一步分析（見圖2）。結(jié)果表明，擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）及變形菌門（Proteobacteria）為9月齡生長(zhǎng)母牛的3 種主要優(yōu)勢(shì)菌門。此外，PD-Lys（Lys）、PD-Met（Met）及PD-Thr（Thr）與PC 組相比，門水平各菌群組成均沒有顯著差異（P＞0.05）。

圖3給出了試驗(yàn)期內(nèi)，9月齡生長(zhǎng)母牛屬水平的瘤胃微生物組成情況。結(jié)果表明，Prevotella_1 及Ruminococcus_2是主要優(yōu)勢(shì)菌屬?？鄢齅et后，9月齡生長(zhǎng)母牛瘤胃Prevotella_7 的豐度顯著高于PC 組（P＜0.05）。除此外，PD-Lys（Lys）、PD-Met（Met）及PD-Thr（Thr）與PC組相比，各菌群屬水平微生物組成均沒有顯著差異（P＞0.05）。

表4 部分扣除Lys、Met及Thr對(duì)6～9月齡生長(zhǎng)母牛瘤胃揮發(fā)酸濃度的影響

表5 部分扣除Lys、Met及Thr對(duì)6～9月齡生長(zhǎng)母牛瘤胃液微生物多樣性的影響

圖1 門（左）及屬（右）水平物種組成主成分分析

圖2 9月齡生長(zhǎng)母牛瘤胃液微生物門水平組成(top 8)

圖3 9月齡生長(zhǎng)母牛瘤胃液微生物屬水平組成（top 8）

3 討論

3.1 瘤胃發(fā)酵參數(shù)

瘤胃pH 值是酸堿調(diào)控水平的直接體現(xiàn)，影響著瘤胃健康及飼料的消化吸收。當(dāng)pH 值在6.2～7.0 之間時(shí)，瘤胃微生物的活性最高[9]。瘤胃pH 值過高或過低時(shí)均會(huì)增加過瘤胃氨基酸在瘤胃內(nèi)的降解，導(dǎo)致過瘤胃率的下降。本研究中瘤胃pH 值在6.8～7.0之間，能滿足瘤胃微生物有較高的生物活性和過瘤胃要求。楊維仁等（2004）[10]向肉牛瘤胃投入RPMet，未發(fā)現(xiàn)pH 值的變化。Campbell 等（1997）[11]研究也發(fā)現(xiàn)，肉牛日糧中添加不同水平的混合氨基酸，對(duì)瘤胃pH 值沒有影響。但在體外培養(yǎng)條件下，Lys 缺乏會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)液pH 值升高[2]。本研究中，7 月齡時(shí)Lys 及Met 扣除組pH 值和VFA 出現(xiàn)了顯著變化的原因，可能是由于突然更換日糧和扣除蛋氨酸的刺激，影響了生長(zhǎng)母牛的發(fā)酵，但隨著試驗(yàn)周期的延長(zhǎng)和對(duì)日糧的適應(yīng)，生長(zhǎng)母牛的瘤胃發(fā)酵又恢復(fù)穩(wěn)定，8 月齡及9 月齡的pH 值沒有出現(xiàn)顯著變化，進(jìn)一步說明添加或扣除過瘤胃氨基酸未達(dá)到影響生長(zhǎng)母牛瘤胃酸堿調(diào)控的水平。

NH3-N 是合成瘤胃MCP 的主要氮源，濃度應(yīng)不低于2.5 mg/100 ml[12]。本研究中，NH3-N 的濃度范圍在4～11 mg/100 ml 左右，滿足微生物合成MCP 的需要。韓繼福等（2003）[13]研究表明添加RPLys并未改變奶牛的瘤胃內(nèi)環(huán)境，對(duì)奶牛瘤胃NH3-N濃度沒有顯著影響。本研究中，扣除30%的Lys 及Thr 對(duì)本試驗(yàn)中NH3-N及MCP濃度未產(chǎn)生較顯著的影響，可能原因是過瘤胃氨基酸瘤胃降解量較低，不足以影響到瘤胃液NH3-N的含量和MCP的合成量。另外，瘤胃液NH3-N濃度變化反映了微生物對(duì)蛋白的降解速度和瘤胃微生物對(duì)NH3-N 的利用速度。瘤胃微生物的N 代謝是循環(huán)過程，除利用NH3-N 合成MCP 外，近50%的MCP 也會(huì)被降解為NH3-N。所以也可能是MCP的降解和合成間的相互轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致了扣除30%的Lys及Thr后9 月齡生長(zhǎng)母牛NH3-N 含量的相對(duì)穩(wěn)定。燕磊（2005）[14]及Windschitl 等（1988）[15]的研究表明小尾寒羊日糧中添加蛋氨酸羥基類似物，對(duì)瘤胃NH3-N濃度和MCP 含量沒有顯著影響，但Firkins（2015）[16]和Va'zquez-Anon 等（2001）[17]通過研究發(fā)現(xiàn)添加蛋氨酸羥基類似物可打破Met不足對(duì)微生物生長(zhǎng)的限制，增加MCP 的合成效率。本試驗(yàn)中使用的HMBi，50%可被瘤胃壁吸收，在特定酶的作用下轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-Met進(jìn)入肝臟被代謝利用，余下的在瘤胃降解被瘤胃微生物利用，用于改善瘤胃內(nèi)環(huán)境。本研究中扣除30%的Met后，NH3-N 濃度未出現(xiàn)顯著變化，但MCP 合成量有降低的趨勢(shì)，表明扣除HMBi 影響了MCP 的合成速率，但此過程可能并非通過影響瘤胃影響NH3-N 介導(dǎo)MCP的合成，而是直接由Met的量來調(diào)控瘤胃MCP合成代謝，也進(jìn)一步說明Met是MCP代謝的限制性氨基酸。反芻動(dòng)物氨基酸需要模式的研究，可以通過使用過瘤胃氨基酸來減少瘤胃蛋白的降解和調(diào)控MCP 合成量，保證到達(dá)小腸的真蛋白供應(yīng)，以最終實(shí)現(xiàn)理想的氨基酸平衡模式[18]。Maiga 等（1998）[19]等指出過瘤胃氨基酸可提高使小腸代謝氨基酸量，使蛋白質(zhì)利用率提高。本研究中，也是通過添加過瘤胃氨基酸產(chǎn)品來保證平衡組正常氨基酸水平，并在其基礎(chǔ)上扣除相應(yīng)的過瘤胃氨基酸。從本研究生長(zhǎng)母牛瘤胃pH 值、NH3-N及MCP濃度看，扣除過瘤胃氨基酸并未對(duì)瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生較大影響，雖然扣除RPMet后MCP合成量有降低趨勢(shì)，但不顯著，表明小腸吸收的蛋白差異可能并非主要來自于MCP，而是來源于日糧蛋白。Noftsger 等（2005）[20]的研究也指出到達(dá)瓣胃中的N 不受來源于微生物N 的影響。但瘤胃微生物間的復(fù)雜關(guān)系使MCP 的氨基酸含量并不固定，不能確定MCP 合成量與其氨基酸組成的關(guān)系，所以本研究中MCP 的氨基酸組成是否對(duì)到達(dá)小腸的氨基酸量有影響有待進(jìn)一步確定。

在理論氨基酸平衡組的基礎(chǔ)上，扣除瘤胃保護(hù)Lys、Met 及Thr 對(duì)本研究中的瘤胃TVFA 濃度沒有顯著影響。這與Campbell 等（1997）[11]、楊維仁（2004）[10]及Robinson等（2000）[21]提出的日糧過瘤胃Lys水平對(duì)肉牛瘤胃VFA 濃度沒有影響基本一致?？赡苁怯捎贚ys和Thr過瘤胃率較高，對(duì)瘤胃乙酸及丙酸的影響程度均較小，雖然丙酸濃度有所改變，但未出現(xiàn)顯著差異。相較于其余2 種氨基酸，過瘤胃HMBi 過瘤胃率較低，瘤胃降解部分較多，其水平的降低對(duì)瘤胃丙酸濃度和乙丙比的影響顯著。Noftsger 等（2003）[22]研究表明添加蛋氨酸羥基類似物后未影響瘤胃液TVFA含量，但丙酸濃度降低。本研究結(jié)果與之類似，蛋氨酸羥基類似物水平降低導(dǎo)致瘤胃丙酸濃度升高，乙丙比下降。但蛋氨酸羥基類似物影響VFA 的原理尚不明確，因?yàn)镠MBi 在瘤胃水解過程中除生成Met 類似物外，還會(huì)產(chǎn)生異丙醇，而異丙醇對(duì)瘤胃發(fā)酵是否會(huì)產(chǎn)生影響還未見報(bào)道。有學(xué)者提出可能是其通過影響瘤胃微生物的作用，從而影響了瘤胃發(fā)酵，但具體機(jī)制仍不清楚，還需進(jìn)一步探究。

3.2 瘤胃微生物區(qū)系

瘤胃內(nèi)的發(fā)酵過程無法由單一菌完成，需多種細(xì)菌、微生物間相互協(xié)調(diào)，共同作用于飼料底物，所以瘤胃微生物的密度及多樣性尤為重要[23]。日糧和月齡是影響瘤胃微生物的兩個(gè)主要因素。本研究中，微生物多樣性指數(shù)隨月齡變化較大，也表明了隨月齡生長(zhǎng)，瘤胃發(fā)育趨于成熟，瘤胃微生物趨于豐富。不同的氨基酸模式會(huì)引起微生物區(qū)系發(fā)生變化，進(jìn)而使得微生物氨基酸組成發(fā)生變化[24]。本研究中，扣除Lys及Thr 對(duì)瘤胃優(yōu)勢(shì)菌群也沒有顯著影響，表明瘤胃可降解的部分的Lys 及Thr 較少，不足以影響瘤胃微生物區(qū)系及優(yōu)勢(shì)菌群的結(jié)構(gòu)，因而未對(duì)瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生顯著影響。相較于Lys 和Thr，HMBi 的瘤胃降解部分較高，扣除30%的Met 后Ace 及Chao 指數(shù)顯著低于氨基酸平衡組，表明扣除Met 影響了瘤胃微生物的豐富度，但從門水平菌群分布看，扣除Met 對(duì)瘤胃微生物組成并沒有顯著影響。Karnati 等（2007）[25]指出添加HMBi 對(duì)瘤胃微生物總數(shù)和分布沒有產(chǎn)生顯著影響，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)瘤胃和小腸微生物的微生物PCR 條帶分布有相似性[26]。Met 是瘤胃微生物生長(zhǎng)的必須氨基酸，有促進(jìn)瘤胃微生物生長(zhǎng)的作用[27]，其含量高低會(huì)刺激瘤胃分解菌的生長(zhǎng)。普雷沃氏菌屬是目前已知蛋白分解活性最強(qiáng)的瘤胃菌株之一[28]，其生長(zhǎng)需要Met，Met缺少會(huì)抑制普雷沃氏菌的生長(zhǎng)[29]。但在本研究中，扣除Met后，Prevotella_7豐度反而增加，可能是為了加強(qiáng)蛋白分解代謝，以補(bǔ)充Met 的不足。Met 對(duì)Prevotella_7含量影響的原因和機(jī)理尚未見報(bào)道，可能需要進(jìn)一步探索Met、瘤胃丙酸發(fā)酵與瘤胃普雷沃氏菌屬間的關(guān)系。

4 小結(jié)

在理論氨基酸平衡組的基礎(chǔ)上扣除30%的過瘤胃Lys 及Thr 對(duì)瘤胃pH 值、NH3-N 濃度、MCP 含量及總VFA 濃度未產(chǎn)生顯著影響，Lys 和Thr 過瘤胃率較高，未影響瘤胃微生物的N 代謝，進(jìn)一步說明扣除過瘤胃氨基酸引起的小腸的氨基酸含量差異不受MCP影響，主要受日糧氨基酸水平差異影響。本研究中扣除Met 抑制了瘤胃微生物的生長(zhǎng)，MCP 合成量下降，而且Met水平的降低會(huì)引起Prevotella_7豐度增加，丙酸比例升高，表明蛋氨酸羥基類似物在瘤胃內(nèi)的降解部分會(huì)影響瘤胃微生物的生長(zhǎng)及代謝，但機(jī)理和機(jī)制尚不清楚，需要進(jìn)一步探究。此外，MCP 含量和微生物種類是否對(duì)MCP 的氨基酸組成有影響也需進(jìn)一步驗(yàn)證。