歐惠算，張靈枝，王維生

（1.廣東省粵東高級(jí)技工學(xué)校，廣東汕頭 515041；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東廣州 510642）

六堡茶屬于黑茶類，產(chǎn)自廣西省梧州市蒼梧縣，已有1500多年的歷史。康熙時(shí)期的《蒼梧縣志》中就有關(guān)于六堡茶品質(zhì)的記載：“味醇隔宿而不變，茶色香味俱佳”[1]。六堡茶具有獨(dú)特的檳榔香味和濃郁的地域特色[2]。近年來(lái)，黑茶中的微生物成為海內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)，金花菌是黑茶特別是茯磚茶中的優(yōu)勢(shì)菌，其使茯磚茶口感香醇，散發(fā)出淡淡的菌花香，深受人們喜愛(ài)[3]。陳椽[4]提出，金花菌能夠分泌淀粉酶催化茶葉中的淀粉轉(zhuǎn)化為單糖，還可分泌氧化酶催化多酚類化合物氧化，從而消除茶葉枝梗的粗老氣味，使茶湯呈紅棕色，滋味也更加醇厚并帶有甜味。研究表明，“金花菌”也是六堡茶的優(yōu)勢(shì)菌[5]。歐惠算等[6]在六堡茶中分離純化得到的金花菌通過(guò)分子生物學(xué)方法對(duì)菌株進(jìn)行DNA序列分析，并通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析得出該金花菌為阿姆斯特丹散囊菌。研究表明阿姆斯特丹散囊菌類能產(chǎn)生降低血脂的活性物質(zhì)[7]。

研究利用從六堡茶中分離得到的阿姆斯特丹散囊菌接種至六堡茶毛茶茶湯中，進(jìn)行單一菌株液態(tài)發(fā)酵，對(duì)發(fā)酵過(guò)程中茶多酚類、黃酮類、氨基酸、可溶性糖、茶色素、咖啡堿以及兒茶素類含量的變化規(guī)律進(jìn)行分析，為探究后發(fā)酵過(guò)程中阿姆斯特丹散囊菌對(duì)六堡茶品質(zhì)成分的影響，從而為改善六堡茶的加工關(guān)鍵技術(shù)、提高六堡茶品質(zhì)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 茶樣與菌種

茶樣為2015年秋用蒼梧縣群體種鮮葉原料加工而成的毛茶。供試菌株是從中茶茶廠六堡茶分離純化得到的阿姆斯特丹散囊菌，實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

試劑：三氟乙酸、甲醇、兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品（EGCG、ECG、EC、EGC、C、CG、GC、GCG）、GA 標(biāo) 準(zhǔn) 品 、咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品：上海源葉生物科技有限公司。茚三酮、氯化亞錫、硫酸亞鐵、酒石酸鉀鈉、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、AlCl3·6H2O、 乙酸乙酯、 正丁醇、95%乙醇、谷氨酸、蒽酮、濃硫酸等（均為分析純）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種的活化

將保存于4℃的阿姆斯特丹散囊菌菌株取出，于28℃活化培養(yǎng)24 h，用接種環(huán)挑取菌絲在20%蔗糖查氏培養(yǎng)基（CZA20S）上培養(yǎng)120 h。

1.3.2 茶湯培養(yǎng)基的制備

將六堡毛茶樣品粉碎（過(guò)40目篩），稱取8.33 g茶葉（精確至0.01）于錐形瓶中，在沸水浴中浸提30 min，每5 min攪拌一次、浸提后用脫脂棉過(guò)濾于500 mL容量瓶，用蒸餾水定容。然后分裝到100 mL錐形瓶中，每瓶裝100 mL，121℃高壓滅菌20 min后取出，冷卻備用。

1.3.3 孢子懸液的制備

于超凈工作臺(tái)上，用接種鏟取2 cm2長(zhǎng)勢(shì)茂盛的阿姆斯特丹散囊菌分成7小塊加入茶湯培養(yǎng)基中，于30℃，120 r/min的恒溫?fù)u床培養(yǎng)144 h。

1.3.4 液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)

用移液槍分別吸取1 mL阿姆斯特丹散囊菌孢子懸浮液接種到毛茶茶湯培養(yǎng)基中，于30℃、120 r/min的恒溫?fù)u床里發(fā)酵192 h，每48 h取一次樣[8]。設(shè)未加菌株的茶湯為對(duì)照CK。

1.3.5 指標(biāo)測(cè)定

茶多酚總量：GB/T 8313—2008茶葉中茶多酚含量的檢測(cè)方法測(cè)定；黃酮類化合物總量：三氯化鋁比色法測(cè)定；氨基酸：GB/T 8314—2013方法測(cè)定；茶色素：分光光度計(jì)法測(cè)定[9]；水溶性糖：蒽比色法；兒茶素組分、沒(méi)食子酸（GA）、咖啡堿：高效液相色譜法，色譜分析條件為色譜柱：Agilent TCC18（4.6×250 mm）；檢測(cè)波長(zhǎng)：278 nm；柱溫箱：35℃；流動(dòng)相：A相0.05%三氟乙酸；B相色譜級(jí)甲醇；C 相超純水；流速：0.8 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL，采用外標(biāo)法測(cè)定含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與作圖

使用Excel 2003軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算整理，用GraphPad Prism軟件作圖，應(yīng)用其中的Twoway ANOVA方法進(jìn)行顯著性分析，數(shù)值呈現(xiàn)使用平均數(shù)±SEM 值[10]。

2 結(jié)果與分析

在阿姆斯特丹散囊菌菌株液態(tài)發(fā)酵192 h后，與空白對(duì)照相比，發(fā)酵茶湯顏色較為清澈。研究表明淀粉、果膠、蛋白質(zhì)、咖啡堿、茶多酚類等是形成茶湯沉淀的主要物質(zhì)，其中酯型兒茶素比非酯型兒茶素更容易參與茶乳酪的形成[11]。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，阿姆斯特丹散囊菌代謝的酶使茶湯中大量的酯型兒茶素降解為非酯型兒茶素，淀粉水解為小分子單糖，果膠裂解，蛋白質(zhì)水解為氨基酸，從而使沉淀物被分解，茶湯渾濁度降低，亮度提高。

2.1 茶湯發(fā)酵過(guò)程中茶多酚含量的變化動(dòng)態(tài)

由圖1可以看出，阿姆斯特丹散囊菌液態(tài)發(fā)酵過(guò)程中，茶多酚含量不斷降低，其中在發(fā)酵192 h時(shí)，阿姆斯特丹散囊菌發(fā)酵液的茶多酚含量與空白對(duì)照相比，具有極顯著差異（p＜0.0001）。茶多酚含量降低了47.14%。其原因除了分泌的氧化酶把茶多酚氧化外，還可能是菌絲生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中消耗吸收了部分茶多酚[12-13]。

圖1發(fā)酵過(guò)程中茶多酚含量的變化Fig.1 Changes of tea polyphenol content during fermentation

2.2 茶湯發(fā)酵過(guò)程中黃酮類含量的變化動(dòng)態(tài)

從圖2可以看出，在液態(tài)發(fā)酵過(guò)程中，阿姆斯特丹散囊菌發(fā)酵液的黃酮含量不斷降低，在發(fā)酵進(jìn)行了144 h后，發(fā)酵液的黃酮類含量與空白對(duì)照相比具有顯著性差異（p＜0.05）；在發(fā)酵進(jìn)行到192 h的時(shí)候，發(fā)酵液的黃酮含量與空白對(duì)照相比，具有極顯著性差異（p＜0.0001），與發(fā)酵前相比，黃酮類含量降低了41.23%。其原因可能是阿姆斯特丹散囊菌在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中分泌胞外酶以及有機(jī)酸促使黃酮類物質(zhì)發(fā)生酶促氧化和酸水解等一系列生化反應(yīng)[8]，同時(shí)黃酮類氧化產(chǎn)物還可與咖啡堿形成絡(luò)合物，反應(yīng)過(guò)程中形成的新物質(zhì)有助于茶葉醇和滋味的形成[14]。而對(duì)照組的黃酮類總量的增加可能是由于大部分黃酮類物質(zhì)是以糖苷形式存在，在高溫滅菌環(huán)境下迅速水解，含量較低。茶湯發(fā)酵過(guò)程中酯型兒茶素分解為簡(jiǎn)單型兒茶素，有機(jī)酸含量增加，淀粉部分水解為葡萄糖，促使黃酮類與糖重新結(jié)合，含量增加。

圖2發(fā)酵過(guò)程中黃酮類含量的變化Fig.2 Changes of flavonoids content during fermentation

2.3 茶湯發(fā)酵過(guò)程中氨基酸含量的變化動(dòng)態(tài)

從圖3可以看出，隨著發(fā)酵時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，阿姆斯特丹散囊菌發(fā)酵液的氨基酸含量不斷降低。在發(fā)酵進(jìn)行了96 h后，發(fā)酵液的氨基酸含量與空白對(duì)照相比，具有顯著性差異 （p＜0.05）；在144 h之后，發(fā)酵液的氨基酸含量與空白對(duì)照相比具有極顯著差異（p＜0.0001），與發(fā)酵前相比，氨基酸含量降低了45.60%。究其原因，一方面可能是在發(fā)酵中，氨基酸作為氮源被阿姆斯特丹散囊菌吸收利用；此外，氨基酸的氧化降解，如茶氨酸與茶多酚氧化產(chǎn)物結(jié)合生成暗色聚合物，也可能使氨基酸含量下降[15-16]。

2.4 茶湯發(fā)酵過(guò)程中可溶性糖含量的變化動(dòng)態(tài)

從圖4可以看出，隨著發(fā)酵的不斷進(jìn)行，阿姆斯特丹散囊菌發(fā)酵液的可溶性糖含量不斷下降，且其在96 h時(shí)與空白對(duì)照相比有顯著性差異（p＜0.05），在 144 h、192 h 時(shí)候，與空白對(duì)照相比，發(fā)酵液的可溶性糖含量均有極顯著性差異 （p＜0.0001）；與發(fā)酵前相比，可溶性糖含量降低了24.83%。其原因是菌絲體的生長(zhǎng)繁殖，需要消耗大量的可溶性糖作為碳源和能量來(lái)源，這也是阿姆斯特丹散囊菌在分離純化時(shí)候需要在20%蔗糖查氏培養(yǎng)基上才能生長(zhǎng)茂盛的原因。另一方面，糖類物質(zhì)在微生物發(fā)酵作用下，與兒茶素生成糖苷化兒茶素[15]，所以發(fā)酵液中可溶性糖含量不斷減少。

圖3發(fā)酵過(guò)程中氨基酸含量的變化Fig.3 Changes of amino acids content during fermentation

圖4發(fā)酵過(guò)程中可溶性糖含量的變化Fig.4 Changes of soluble sugar content during fermentation

2.5 茶湯發(fā)酵過(guò)程中茶色素含量的變化動(dòng)態(tài)

茶色素是茶多酚的氧化產(chǎn)物，其保健功效越來(lái)越受到大家的關(guān)注。研究表明，茶色素可以通過(guò)抑制癌細(xì)胞增殖周期，從而促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡[17]；茶黃素可以抑制腫瘤侵染過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白[18]；茶紅素則可以抑制DNA復(fù)合物的形成[19]。

圖5發(fā)酵過(guò)程中茶色素含量的變化Fig.5 Changes of tea pigments content during fermentation

從圖5可以看出，在液態(tài)發(fā)酵過(guò)程中，阿姆斯特丹散囊菌發(fā)酵液的茶黃素含量是先增加后減少，主要是發(fā)酵前期由茶多酚類物質(zhì)氧化形成，而在發(fā)酵后期，茶黃素進(jìn)一步氧化形成茶紅素，在48h、96 h與144 h時(shí)，茶黃素含量相對(duì)空白對(duì)照，都有極顯著性差異（p＜0.0001）；在發(fā)酵之前，茶紅素的初始含量占茶色素的5.66%，在發(fā)酵過(guò)程中，茶紅素含量總體呈減少的趨勢(shì)，在96 h、144 h與196 h均有極顯著性差異（p＜0.0001），一部分茶紅素進(jìn)一步氧化聚合形成茶褐素，另一部分可能是阿姆斯特丹散囊菌在生長(zhǎng)過(guò)程中消耗了；發(fā)酵液茶褐素的含量呈總體增加的趨勢(shì)，但是與空白對(duì)照相比，沒(méi)有顯著性差異（p＞0.05）。對(duì)照組的茶紅素與茶褐素含量比實(shí)驗(yàn)組的高，原因是茶湯冷卻放久后會(huì)自動(dòng)氧化形成茶色素，湯色變深，同時(shí)由于對(duì)照組中沒(méi)有菌株，不會(huì)消耗茶色素。

2.6 茶湯發(fā)酵過(guò)程中咖啡堿含量的變化動(dòng)態(tài)

從圖6可以看出，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，阿姆斯特丹散囊菌發(fā)酵液咖啡堿含量相對(duì)于空白對(duì)照，具有極顯著性差異（p＜0.0001），咖啡堿含量呈先上升后下降再上升再下降的動(dòng)態(tài)變化。在192 h發(fā)酵結(jié)束時(shí)，咖啡堿總量增加了28.00%。微生物生長(zhǎng)中碳源能提供微生物所需的能量，氮源是組成生物體核酸、蛋白質(zhì)的重要元素，茶湯中的氮源主要是蛋白質(zhì)或其降解產(chǎn)生的氨基酸類[20]，咖啡堿屬于雜環(huán)化合物，其結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，微生物對(duì)其利用率較低[21-22]。但試驗(yàn)中咖啡堿含量總體呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，可能是因?yàn)榘l(fā)酵過(guò)程中，菌株分泌出大量水解酶和氧化酶，把大分子蛋白質(zhì)、酯型兒茶素等物質(zhì)降解，從而使咖啡堿與這些大分子物質(zhì)的結(jié)合的沉淀解散，從而咖啡堿的含量增加。

圖6發(fā)酵過(guò)程中咖啡堿含量的變化Fig.6 Changes of caffeine content during fermentation

2.7 茶湯發(fā)酵過(guò)程中兒茶素類含量的變化動(dòng)態(tài)

由表1可得，在發(fā)酵過(guò)程中，阿姆斯特丹散囊菌發(fā)酵液的兒茶素各組分含量變化較大。酯型兒茶素：表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）、沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（GCG）、表兒茶素沒(méi)食子酸酯（ECG）、兒茶素沒(méi)食子酸酯（CG）的含量呈不斷下降趨勢(shì)，與空白對(duì)照相比，都具有極顯著性差異（p＜0.0001），隨著發(fā)酵時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，除了兒茶素沒(méi)食子酸酯（CG）還少量存在外，其他酯型兒茶素已經(jīng)基本檢測(cè)不到。說(shuō)明酯型兒茶素在發(fā)酵過(guò)程中分解為非酯型兒茶素。非酯型兒茶素，包括兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、沒(méi)食子兒茶素（GC）、表沒(méi)食子兒茶素（EGC）總體呈增加趨勢(shì)，與空白對(duì)照相比，都達(dá)到了顯著性差異（p＜0.05）。沒(méi)食子酸含量也呈先增加后減少的趨勢(shì)，說(shuō)明隨著菌絲體的不斷增加，兒茶素組分被消耗利用了。發(fā)酵液的兒茶素總量呈不斷減少的趨勢(shì)，在192 h發(fā)酵結(jié)束時(shí)減少了8.63%。在這里值得注意的是，與其他茶類相比，六堡茶的兒茶素含量普遍偏低，可能是由于品種原因，或者是因?yàn)槊杓庸r(shí)，具有漚堆和高溫汽蒸過(guò)程，兒茶素?fù)p耗了。

表1 發(fā)酵過(guò)程中兒茶素含量的組分變化（單位：μg/mL）Table 1 Change of catechins content during fermentation （Unit： μg/mL ）

3 討論

試驗(yàn)利用單一菌株液態(tài)發(fā)酵的形式，探究阿姆斯特丹散囊菌對(duì)六堡茶品質(zhì)成分的影響。結(jié)果表明，在整個(gè)液態(tài)發(fā)酵液過(guò)程中，其茶多酚、黃酮類、氨基酸、可溶性糖的含量均不斷減少，與滅菌的空白對(duì)照組相比，均具有極顯著性差異 （p＜0.0001），茶黃素含量先增加后減少，茶紅素含量總體呈減少的趨勢(shì)，而茶褐素含量呈總體增加的趨勢(shì)。主要是因?yàn)椤敖鸹ň碑a(chǎn)生的胞外酶能分解茶葉中的蛋白質(zhì)、多糖，及把茶多酚氧化為茶色素等，使決定茶葉品質(zhì)的物質(zhì)之間比例更加協(xié)調(diào)[23]。發(fā)酵液的咖啡堿含量呈總體上升的趨勢(shì)，兒茶素總含量下降，酯型兒茶素分解為非酯型兒茶素，EGCG、ECG、GCG在發(fā)酵后期幾乎檢測(cè)不到，沒(méi)食子酸與非酯型兒茶素的含量呈先增加后減少的趨勢(shì)，且與空白對(duì)照相比，均有極顯著性差異 （p＜0.0001）。結(jié)果證明在發(fā)酵過(guò)程中，阿姆斯特丹散囊菌對(duì)六堡茶品質(zhì)成分的轉(zhuǎn)化產(chǎn)生了關(guān)鍵作用。本研究對(duì)進(jìn)一步探明六堡茶品質(zhì)轉(zhuǎn)化形成的機(jī)理、改善六堡茶加工技術(shù)具有一定的參考價(jià)值。