郭永，許保海，2，涂鵬程，3，裴開(kāi)顏*

(1.國(guó)家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所，北京 100081；2.遵義醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室，遵義 563003；3.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，北京 100730)

20世紀(jì)90年代以來(lái)，以米非司酮為代表的緊急避孕藥物受到越來(lái)越多的關(guān)注，并在基礎(chǔ)及臨床研究中取得了很大的進(jìn)步。米非司酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)與孕酮相似，是一種高效的抗孕激素藥物，可作用于月經(jīng)周期不同時(shí)相，且半衰期較長(zhǎng)，研究人員考慮將其用于常規(guī)避孕。本課題組曾對(duì)米非司酮每周一次口服的臨床效果進(jìn)行了初步研究[1-2]，研究結(jié)果均提示有希望將米非司酮每周一次口服發(fā)展為常規(guī)避孕方法。體內(nèi)外研究均表明米非司酮對(duì)于治療子宮肌瘤[3-4]、子宮內(nèi)膜異位癥[5-6]、子宮內(nèi)膜癌[7]等具有很好的治療作用，但目前適宜劑量和方案尚多在探索之中。因此考慮可以用于特定人群，如子宮肌瘤、子宮內(nèi)膜異位癥患者，發(fā)揮避孕和治療疾病的雙重功效。在進(jìn)行臨床試驗(yàn)之前，需要對(duì)米非司酮避孕新適應(yīng)癥進(jìn)行臨床前研究，評(píng)價(jià)其安全性和有效性，而有關(guān)動(dòng)物體內(nèi)米非司酮多次給藥的藥代動(dòng)力學(xué)研究的報(bào)道較少，因此本文旨在利用前期已建立并確證的LC-MS/MS定量檢測(cè)方法對(duì)米非司酮在Beagle(比格)犬體內(nèi)單次和多次給藥后的藥動(dòng)學(xué)進(jìn)行研究，為米非司酮作為兼有治療作用的避孕藥物申請(qǐng)臨床研究做準(zhǔn)備。

材料和方法

一、動(dòng)物及材料

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：比格犬，雌性，普通級(jí)，8～12 kg，購(gòu)自北京瑪斯生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證為SCXK(京)2016-0001。試驗(yàn)動(dòng)物檢疫觀察14 d，觀察動(dòng)物的外觀體征、行為活動(dòng)、糞便性狀、體重及飲食等指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)有病動(dòng)物及時(shí)剔除。動(dòng)物使用前經(jīng)動(dòng)物管理人員和專題負(fù)責(zé)人檢查認(rèn)可。

動(dòng)物房環(huán)境條件控制室溫18℃～24℃，相對(duì)濕度40%～70%，光照12 h明暗交替。普通飼料為犬維持料，購(gòu)自北京華阜康生物技術(shù)股份有限公司。飲水：飲用純化水，經(jīng)酸化后自由飲用。

2.儀器：API 4000 Qtrap 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Applied BioSystem，美國(guó))，包括：API 4000 Qtrap 三重四極桿質(zhì)譜、配有ESI源、Analyst 1.5.2 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；液相部分為Agilent 1200高效液相色譜，配有G1312A 二元溶劑輸送泵、G1367A 自動(dòng)進(jìn)樣器、G1379A 脫氣機(jī)、G1316A 柱溫箱。

3.試劑：米非司酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：純度>99%，批號(hào)72801608006(秦皇島紫竹藥業(yè))；甲醇(批號(hào)：170237)、甲酸(批號(hào)：174477)、乙腈(批號(hào)：168772)、DMSO(批號(hào)：155977)、甲基叔丁基醚(MTBE，批號(hào)：166804)均為色譜純(Fisher Scientific，美國(guó))。

二、研究方法

1.實(shí)驗(yàn)分組：根據(jù)給藥次數(shù)分為單次給藥組和多次給藥組，單次給藥采用靜脈和灌胃兩種方式給藥。單次靜脈注射1 mg/kg，單次灌胃給藥又分為低、中、高3個(gè)劑量組，分別是1、3、10 mg/kg 米非司酮，多次給藥采用口服灌胃法給藥，劑量為10 mg/kg。每組各3只比格犬。

2.給藥方式和血漿樣本采集：(1)單次靜脈給藥：靜脈注射米非司酮1 mg/kg，給藥前及給藥后15、30 min，1、2、4、8、12、24、48、72、96 h采集血漿樣本；(2)單次灌胃給藥：?jiǎn)未喂辔阜譃榈汀⒅?、?個(gè)劑量組，分別是1、3、10 mg/kg 米非司酮，給藥前和給藥后15、30 min，1、2、4、8、12、24、48、72、96 h采集血漿樣本；(3)多次灌胃給藥：分別于第1、3、5、7、9、11、13、15 天灌胃10 mg/kg 米非司酮，給藥前、后2 h取血，第15天給藥前及給藥后15、30 min，1、2、4、8、12、24、48、72、96 h取血。

血漿標(biāo)本采集后EDTA抗凝，根據(jù)前期穩(wěn)定性考察數(shù)據(jù)結(jié)果[8]，24 h以內(nèi)的血漿保存于-4℃冰箱，24 h以后凍存于-80℃冰箱。

3.米非司酮血漿濃度檢測(cè)：采用LC-MS/MS法，具體操作參照本研究前期方法學(xué)建立結(jié)果[8]。

4.藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的計(jì)算：采用Phoenix WinNonlin軟件處理比格犬單次和多次口服米非司酮后的血藥濃度測(cè)定數(shù)據(jù)，采用非房室模型估算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，繪制藥-時(shí)曲線。藥代動(dòng)力學(xué)主要參數(shù)包括：血漿生物半衰期(t1/2)、血漿藥物濃度達(dá)峰時(shí)間(tmax)、血漿藥物谷濃度(C0)、血漿藥物峰濃度(Cmax)、藥-時(shí)曲線線下面積(AUC)、表觀分布容積(Vz)、穩(wěn)態(tài)表觀分布容積(Vss)、總體清除率(CL)、平均滯留時(shí)間(MRT)、生物利用度(F)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、單次給藥比格犬體內(nèi)米非司酮的藥代動(dòng)力學(xué)研究

單次灌胃1、3、10 mg/kg組比格犬體內(nèi)米非司酮的藥-時(shí)曲線如圖1，其主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)如下，1 mg/kg組的t1/2值和MRT與3 mg/kg組和10 mg/kg組相比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，3 mg/kg組和10 mg/kg之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；AUClast、AUCInf值的增長(zhǎng)比值與給藥劑量不成比例，呈現(xiàn)非線性藥代動(dòng)力學(xué)特征；3組的tmax值相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

圖1 單次給藥比格犬體內(nèi)米非司酮的藥-時(shí)曲線

二、生物利用度

單次靜脈注射1 mg/kg組和灌胃10 mg/kg組比格犬體內(nèi)米非司酮的藥-時(shí)曲線如圖2。單次靜脈給藥主要藥代動(dòng)力學(xué)如下，t1/2為(16.38±0.95)h，C0為(604.59±114.26)ng/ml，AUClast為(577.42±206.74)h·ng·ml-1，AUCInf為(622.72±229.94)h·ng·ml-1，Vz 為(41.64±15.71)L/kg，Vss為(22.31±7.74)L/kg，CL 為(1.78±0.71)ml·min-1·kg-1，MRT為(12.80±1.50)h。生物利用度為52.6%。

三、多次灌胃給予10 mg/kg米非司酮的藥代動(dòng)力學(xué)研究

比格犬隔天一次(第1、3、5、7、9、11、13、15 天)灌胃給予10 mg/kg米非司酮后，用LC-MS/MS法檢測(cè)血漿中米非司酮的濃度，繪制出平均血漿藥物濃度-時(shí)間曲線(圖3)。米非司酮組的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)如下，t1/2(14.08±1.27)h和(32.96±6.96)h，Cmax為(565.33±41.97)ng/ml和(707.67±134.15)ng/ml，AUClast為(3 251.97±845.10)h·ng·ml-1和(5 190.39±2 231.04)h·ng·ml-1，AUCInf為(3 282.69±846.15)h·ng·ml-1和(5 626.17±2 655.38)h·ng·ml-1，MRT為(14.84±2.92)h和(26.09±8.85)h。單次灌胃10 mg/kg給藥組和多次給藥組的tmax、Cmax、AUClast、AUCInf、MRT等主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。多次灌胃給米非司酮10 mg/kg后，分別檢測(cè)第1、3、5、7、9、11、13和15 天的0 h和2 h的血藥濃度，結(jié)果顯示，比格犬體內(nèi)的血藥濃度保持穩(wěn)定(圖3)。

組 別例數(shù)t1/2(h)tmax (h)Cmax (ng/ml)單次灌胃1 mg/kg34.83±2.990.50±0.0081.97±5.143 mg/kg318.27±2.45*0.67±0.29122.17±41.2610 mg/kg314.08±1.27*0.50±0.00565.33±41.97多次灌胃10 mg/kg332.96±6.96#1.33±0.58#707.67±134.15組 別例數(shù)AUClast(h·ng·ml-1)AUCInf(h·ng·ml-1)MRT (h)F單次灌胃1 mg/kg3191.73±44.05202.69±51.604.19±2.9032.5#3 mg/kg3495.21±156.96*#532.56±162.27*#15.67±2.20*27.6#10 mg/kg33 251.97±845.10*3 282.69±846.15*14.84±2.92*52.6多次灌胃10 mg/kg35 190.39±2 231.045 626.17±2 655.3826.09±8.85NA

注：與單次1 mg/kg組相比較，*P<0.05；與單次10 mg/kg組相比較，#P<0.05

圖2 單次靜脈注射1 mg/kg組和灌胃10 mg/kg組比格犬體內(nèi)米非司酮的藥-時(shí)曲線

圖3 比格犬多次灌胃給予10 mg/kg米非司酮的藥-時(shí)曲線圖

討 論

目前報(bào)道的生物樣本中米非司酮的分析測(cè)定方法主要有HPLC法[9-11]和RIA[12]。這兩種方法試劑價(jià)格昂貴、步驟繁瑣；RIA 法因存在放射性污染，且操作較為煩瑣，不宜推廣使用；HPLC雖然測(cè)定較為準(zhǔn)確，但仍存在標(biāo)本流動(dòng)相配置復(fù)雜，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，最低定量下限較高等問(wèn)題[13-14]。本研究采用前期優(yōu)化后的建立的LC-MS/MS法[8]進(jìn)行比格犬血漿中的米非司酮藥代動(dòng)力學(xué)研究，線性范圍寬(1 000倍)，靈敏度可達(dá)1.0 ng/ml，血漿中米非司酮的線性范圍均為1～1 000 ng/ml，樣品回收率高。

單次靜脈給藥后，t1/2(16.38±0.95)h，AUClast為(577.42±206.74) h·ng·ml-1，AUCInf為(622.72±229.94)h·ng·ml-1，CL為(1.78±0.71)ml·min-1·kg-1，MRT為(12.80±1.50)h。另外不同濃度灌胃給藥組結(jié)果相比發(fā)現(xiàn)，1 mg/kg組的t1/2值和MRT與3 mg/kg組和10 mg/kg組相比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，1、3和10 mg/kg單次灌胃給藥后，米非司酮在比格犬體內(nèi)呈現(xiàn)非線性藥代動(dòng)力學(xué)特征。結(jié)果提示，不同濃度米非司酮藥物的吸收速度無(wú)明顯差異，但隨著劑量的增加，不存在線性關(guān)系。有研究采用RIA法進(jìn)行口服10 mg/kg米非司酮人藥代動(dòng)力學(xué)的研究，結(jié)果顯示Cmax為(1.41±0.31)μmol/L，平均tmax為1 h，t1/2為(19.6±4.55)h[12]，趙恒利等[15]采用LC-MS/MS法測(cè)定10 mg米非司酮人藥代動(dòng)力學(xué)的研究結(jié)果為Cmax為(476.4±223.1)μmol/L，tmax為(1.04±0.80)h，t1/2為(20.61±6.50)h。本研究與其相比較，結(jié)果有些差異，這可能是米非司酮在動(dòng)物體內(nèi)代謝非?？?，半衰期很短，與人體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果有一定差異[16-17]。

本研究結(jié)果顯示，比格犬單次和多次灌胃給予10 mg/ml劑量的米非司酮后，血藥濃度分別在0.5 h和1 h達(dá)到峰值，多次給藥后達(dá)峰時(shí)間稍微延長(zhǎng)，這可能是食物的影響，使得藥物的吸收錯(cuò)后。但單次給藥組和多次給藥組的tmax、Cmax、AUClast、AUCInf、MRT等主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。另外多次灌胃給米非司酮10 mg/kg后，分別檢測(cè)第1、3、5、7、9、11、13、15 天的0 h和2 h的血藥濃度，結(jié)果顯示比格犬體內(nèi)的血藥濃度保持穩(wěn)定，但t1/2和MRT明顯延長(zhǎng)、AUC明顯增加，提示米非司酮在比格犬體內(nèi)有一定蓄積。結(jié)果也提示單次給藥后血藥濃度低于多次給藥后的血藥濃度，我們推測(cè)一方面因?yàn)樯形催_(dá)到穩(wěn)態(tài)血藥濃度，另一方面是由于多次灌胃未能像單次給藥禁食過(guò)夜，因此口服藥物在胃腸道里，食物對(duì)藥物吸收的影響所致。