袁巧玲，范 穎，寧玲忠，蘇建明，雷紅宇

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，長沙 410128）

伏馬毒素B1（FB1）屬于一種煙曲霉毒素，是串珠鐮刀菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物[1]。其主要污染玉米、大豆、小麥等糧食作物及其制品[2]。FB1已經(jīng)被證明在所有伏馬毒素中毒性最強(qiáng)。該毒素?zé)岱€(wěn)定性較好，成為危害畜禽健康的一個重要原因[3]。伏馬毒素可引起人類食管癌和神經(jīng)管型缺陷病、馬與兔的腦組織損傷、靈長類動物動脈粥樣硬化、豬肺水腫等[4]。隨著國內(nèi)外毒理學(xué)研究工作者的不斷探索，該毒素對人類、植物以及動物的毒性作用與機(jī)制逐漸地被挖掘。但是目前還沒有詳盡的證據(jù)支撐其是否對體外培養(yǎng)的豬腎上皮細(xì)胞具有增殖抑制效應(yīng)。因此，本文以豬腎上皮細(xì)胞為體外研究模型，探究PK15細(xì)胞染毒FB1后對其細(xì)胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑

FB1購于Sigma公司；豬腎上皮細(xì)胞PK15由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院饋贈。

1.2 MTT檢測細(xì)胞增殖

取PK15細(xì)胞懸液，接種于96孔板，預(yù)培養(yǎng)過夜。將培養(yǎng)基更換為含有FB10、10、20、40 μg·mL-1的新鮮培養(yǎng)基。培養(yǎng)24和48 h時，棄去培養(yǎng)基，依次加入100 μL·孔-1的新鮮培養(yǎng)基（含MTT溶液10 μL），避光培養(yǎng)4 h后棄上清，加二甲基亞砜150 μL，混勻。10 min后，于酶標(biāo)儀490 nm處檢測各孔吸光度，計算細(xì)胞相對活力。

1.3 qPCR檢測周期相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平

PK15細(xì)胞在染毒處理48 h后，根據(jù)TRIZOL試劑盒（全氏金生物科技有限公司）說明書，提取細(xì)胞總RNA。測定RNA濃度，反轉(zhuǎn)錄得cDNA。將cD?NA稀釋，加入熒光定量qPCR的其他反應(yīng)試劑。將反應(yīng)體系放入熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增并分析數(shù)據(jù)。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2－ΔΔCT法計算目的基因的相對水平。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0進(jìn)行處理，兩組間比較為t檢驗，多組間的比較應(yīng)采用單因素方差分析，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 FB1對PK15細(xì)胞活力的影響

MTT檢測細(xì)胞活力的結(jié)果見圖1。

由圖1可知，F(xiàn)B1作用于PK15細(xì)胞24 h后，細(xì)胞活力未出現(xiàn)下降變化，但是當(dāng)FB1作用時間增加到 48 h 時，40 μg·mL-1FB1組中細(xì)胞活力顯著下降。表明FB1能降低PK15細(xì)胞活性，抑制細(xì)胞的增殖。

2.2 FB1對PK15細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)的影響

qPCR檢測結(jié)果見圖2。

圖1 FB1對PK15細(xì)胞活性的影響

圖2 FB1對PK15細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)水平的影響

由圖2可知，與對照組相比，F(xiàn)B1處理組中細(xì)胞核增殖抗原PCNA（圖2 C）與細(xì)胞周期蛋白Cyclin B（圖2 A）和Cyclin D（圖2 B）的mRNA表達(dá)水平顯著下降，而細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子P21（圖2 D）和P27（圖2 F）的mRNA表達(dá)水平顯著增加。

3 討 論

FB是一種常見的霉菌毒素，對畜牧業(yè)存在很大的威脅。有研究報道，F(xiàn)B能降低畜禽的生長性能[5]。但是由于毒物的獲得問題，當(dāng)前國內(nèi)外對該毒素的動物體內(nèi)毒性研究多集中在FB這一類化合物上的探索，而非單一的高純度FB1。這也很難闡明其毒性的產(chǎn)生是否與FB1有直接關(guān)聯(lián)，甚至很難確定FB1是否在發(fā)揮主導(dǎo)的毒性作用。另外，腎臟是動物的主要排泄器官，也是多種毒素主要攻擊的對象。該臟器的嚴(yán)重?fù)p傷對動物的泌尿系統(tǒng)會產(chǎn)生不可忽視的危害。因此本研究探索了FB1對豬腎上皮細(xì)胞PK15增殖的影響，研究證實，高濃度的FB1處理PK15細(xì)胞48 h顯著地抑制了該細(xì)胞的增殖。

細(xì)胞增殖是細(xì)胞的基本生物學(xué)特性，異常的細(xì)胞增殖或過度增殖都可能會影響細(xì)胞的生理功能。腎上皮細(xì)胞是構(gòu)成腎臟的基本結(jié)構(gòu)單元。腎上皮細(xì)胞的增殖受到抑制，與腎臟疾病有一定關(guān)聯(lián)，影響腎臟的代謝和排泄功能。細(xì)胞周期蛋白調(diào)控細(xì)胞的增殖，一個完整的細(xì)胞周期需要由不同的細(xì)胞周期相關(guān)蛋白參與[6]。目前已發(fā)現(xiàn)的與細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)的分子主要包括3大類：細(xì)胞周期蛋白（Cyclin B、Cyclin D和Cyclin E等），細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK-2等），細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子（P21、P27等）。其中CDKs是調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的核心，Cyclins對CDKs具有直接調(diào)控作用，P21與P27等對細(xì)胞增殖具有負(fù)性調(diào)控作用，共同構(gòu)成細(xì)胞周期調(diào)控的分子基礎(chǔ)[7]。PCNA是細(xì)胞增殖核抗原，在細(xì)胞增殖的啟動上發(fā)揮重要作用[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)B1顯著抑制了PCNA的mRNA表達(dá)，細(xì)胞周期蛋白Cyclin B和Cyclin D的mRNA表達(dá)顯著下降，推測細(xì)胞增殖受到抑制可能與細(xì)胞在G1到S的進(jìn)程中受到阻滯有關(guān)。同時也發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子P21和P27的表達(dá)顯著增加。研究證實，伏馬毒素對其他動物細(xì)胞存在抑制細(xì)胞增殖作用，即FB15~20 μg·mL-1可使人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖阻滯在G0/G1期，導(dǎo)致細(xì)胞增殖受到抑制[9]。綜上所述，F(xiàn)B1可通過調(diào)控周期調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，抑制豬腎上皮細(xì)胞的增殖。