盧建軍，楊 帆*，楊 婧，陳良強(qiáng)，劉延峰，王和玉，王 莉

（1.貴州茅臺酒股份有限公司 技術(shù)中心，貴州 仁懷 564500；

2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122）

白酒中關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)的微生物溯源是白酒研究的一項(xiàng)重要工作，其研究成果的應(yīng)用對白酒產(chǎn)量和品質(zhì)的保障和提升具有明顯的作用[1-4]。但白酒釀造過程是開放的多菌種混合固態(tài)發(fā)酵體系，其復(fù)雜的微生物結(jié)構(gòu)和風(fēng)味組成使得對產(chǎn)目標(biāo)風(fēng)味物質(zhì)微生物的溯源十分困難。目前主要是通過可培養(yǎng)手段大量獲得微生物資源并逐個(gè)進(jìn)行功能驗(yàn)證開展溯源研究[5-8]，但該過程存在工作量大，目標(biāo)性差，篩選結(jié)果不可預(yù)知等不足。

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，針對微生物的研究手段已經(jīng)從細(xì)胞水平轉(zhuǎn)向了分子水平的研究[9]。在此過程中關(guān)于核酸、蛋白質(zhì)等生物信息數(shù)據(jù)大量積累，形成了包含有眾多生物資源信息的數(shù)據(jù)庫，依據(jù)資源信息類別與研究用途不同，生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫可分為15個(gè)大類[10]。目前數(shù)據(jù)庫中的生物信息資源已被廣泛應(yīng)用于微生物研究領(lǐng)域，為微生物鑒定、基因水平溯源、化合物合成及致病基因研究提供了有力支持[11-12]。迄今為止，利用生物信息數(shù)據(jù)資源指導(dǎo)風(fēng)味物質(zhì)的微生物溯源尚鮮見報(bào)道。

高級醇是我國傳統(tǒng)白酒的芳香組分之一，能夠襯托酒體酯類香氣，但含量過高又會引起酒體辛辣，使人上頭易醉[13]。正丙醇作為高級醇的重要組成部分，其含量已成為我國酒精類食品檢測的一項(xiàng)重要指標(biāo)[14]。目前關(guān)于白酒中產(chǎn)正丙醇微生物研究主要集中在酵母菌[15-17]與芽孢桿菌[14，18]，而白酒中其他微生物代謝產(chǎn)正丙醇的相關(guān)研究報(bào)道較少。該研究擬利用生物信息數(shù)據(jù)資源對白酒中產(chǎn)正丙醇微生物進(jìn)行溯源，并對菌株進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其產(chǎn)正丙醇能力。通過篩選白酒釀造中高產(chǎn)正丙醇的優(yōu)勢微生物，明確釀造過程中產(chǎn)正丙醇的微生物種類及組成，為白酒中正丙醇的調(diào)控奠定研究基礎(chǔ)，為后期工藝控制提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

布赫內(nèi)氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri）、面包乳桿菌（Lactobacillus panis）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、橋乳桿菌（Lactobacillus pontis）、耐酸乳桿菌（Lactobacillus acetotolerans）、戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentose）：茅臺微生物菌種庫保存。

正丙醇（色譜純）、叔戊醇（色譜純）：美國Sigma公司；氯化鈉（分析純）：上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；MRS肉湯培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KS4000i搖床：德國艾卡公司；380R離心機(jī)：德國Hettich公司；LRH-250恒溫培養(yǎng)箱：上海飛越實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；JAR GASSING SYSTEM厭氧培養(yǎng)罐：英國DWS公司；IEC61010-1超凈工作臺：新加坡藝思高科技有限公司；CL-32L全自動蒸汽滅菌器：日本ALP株式會社；G1888A-7890A-5975C頂空-氣相色譜-質(zhì)譜（headspace-gas chromatographymass spectrometry，HS-GC-MS）聯(lián)用儀：美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 代謝通路與關(guān)鍵酶查詢

利用京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫對目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行比對，明確其代謝通路及參與反應(yīng)的酶，確定目標(biāo)物質(zhì)代謝所需關(guān)鍵催化酶。具體步驟：（1）利用KEGG COMPOUND DATABASE（代謝物及其他小分子化合物數(shù)據(jù)庫）檢索目標(biāo)風(fēng)味物質(zhì)，并篩選包含目標(biāo)風(fēng)味物質(zhì)的Entry編號選項(xiàng)；（2）通路選項(xiàng)中確定目標(biāo)風(fēng)味物質(zhì)的代謝圖譜，并獲取該代謝途徑的可視化圖譜；（3）結(jié)合代謝途徑所涉及相關(guān)酶信息及其文獻(xiàn)報(bào)道，確定催化反應(yīng)的關(guān)鍵酶。

1.3.2 關(guān)鍵酶表達(dá)微生物查詢

通過美國國家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnologyinformation，NCBI）數(shù)據(jù)庫獲得催化酶微生物信息，確定產(chǎn)目標(biāo)物質(zhì)潛在的微生物種屬。

1.3.3 乳酸菌發(fā)酵液制備

分別挑取不同供試菌株，于50mLMRS肉湯培養(yǎng)基中，37℃靜置厭氧培養(yǎng)至對數(shù)期，制備種子液備用。分別接種1 mL種子液于MRS肉湯培養(yǎng)基中，37℃靜置厭氧培養(yǎng)5～7 d，檢測發(fā)酵液中正丙醇含量。

1.3.4 正丙醇含量測定

采用頂空-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀法測定發(fā)酵液中的正丙醇含量，具體方法為：（1）樣品前處理：于20 mL頂空瓶中加入2gNaCl和5mL菌體發(fā)酵液，加入3 μL叔戊醇乙醇溶液作為內(nèi)標(biāo)。（2）頂空條件：孵育室溫度70℃，孵育時(shí)間10min，振搖頻率高，定量環(huán)溫度100℃，傳輸線溫度130℃，進(jìn)樣體積3mL，GC循環(huán)時(shí)間22min。（3）氣相色譜分析條件：DB-WAX色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），進(jìn)樣口溫度230 ℃，分流比30∶1，載氣為氦氣（He），流速為0.8 mL/min。柱溫采用程序升溫：起始溫度40℃，保持1 min后以1℃/min升溫至45℃，然后以35℃/min升溫至220℃，保持7 min，運(yùn)行時(shí)間18 min。（4）質(zhì)譜分析條件：電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，接口溫度250℃。掃描質(zhì)量范圍33～350 amu。采集模式：選擇離子掃描（selected ion monitoring，SIM），溶劑延遲2 min。SIM參數(shù)：組1為1-丙醇，繪圖離子為59。（5）正丙醇定性、定量方法：采用標(biāo)準(zhǔn)譜圖比對和標(biāo)準(zhǔn)品比對，對目標(biāo)物進(jìn)行定性，內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 催化產(chǎn)正丙醇關(guān)鍵酶

通過在KEGG代謝網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫中對正丙醇產(chǎn)生途徑查詢，發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)生途徑為丙酸代謝途徑（Map00640）中由丙醛代謝產(chǎn)生正丙醇，其代謝通路如圖1所示。

從圖1可以看出，在丙酸代謝途徑中，正丙醇存在一條代謝通路，為1,2-丙二醇在丙二醇脫水酶的作用下生成丙醛，從而丙醛在1,3-丙二醇脫氫酶和1-丙醇脫氫酶的作用下代謝產(chǎn)生正丙醇。

相關(guān)報(bào)道指出[19-20]，在大腸桿菌（Escherichia coli）和谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）中導(dǎo)入丙二醇脫水酶與醇脫氫酶，能夠代謝丙二醇產(chǎn)生正丙醇。因此結(jié)合代謝通路確定丙二醇脫水酶、1,3-丙二醇脫氫酶和1-丙醇脫氫酶為催化產(chǎn)生正丙醇的關(guān)鍵酶。

2.2 關(guān)鍵酶表達(dá)微生物

通過在NCBI數(shù)據(jù)庫中查詢能夠表達(dá)上述3種關(guān)鍵酶的微生物，在NCBI數(shù)據(jù)庫中能夠分別表達(dá)上述3種酶的微生物種屬，如表1所示。

表1 NCBI中表達(dá)關(guān)鍵酶的微生物Table 1 Microorganisms expressing key enzymes in NCBI

發(fā)現(xiàn)共計(jì)17個(gè)微生物屬能夠同時(shí)表達(dá)上述3種關(guān)鍵催化酶，具體如表2所示，表2中所示微生物種屬為供試菌株的篩選提供范圍。

表2 同時(shí)表達(dá)3種關(guān)鍵酶的微生物屬Table 2 Genera of microorganisms simultaneously expressing 3 key enzymes

2.3 供試菌株選擇

針對不同香型白酒微生物研究表明，上述17個(gè)微生物屬除李斯特菌屬（Listeria）和甲烷嗜桿菌屬（Metakosakonia）未見報(bào)道外，其余15個(gè)微生物屬分別在不同香型白酒釀造中有檢出，其中乳桿菌屬（Lactobacillus）與芽孢桿菌屬（Bacillus）微生物占絕對優(yōu)勢地位[21-31]；且豐度較高的微生物對白酒風(fēng)味具有明顯的貢獻(xiàn)作用[27]。柏永昊等[14，18]研究發(fā)現(xiàn)，白酒中存在能夠代謝產(chǎn)正丙醇的Bacillus屬微生物；而關(guān)于白酒中Lactobacillus屬微生物代謝產(chǎn)正丙醇的研究尚未見報(bào)道。為進(jìn)一步確認(rèn)白酒釀造過程中正丙醇的優(yōu)勢微生物來源，本研究以Lactobacillus屬微生物為研究對象驗(yàn)證其產(chǎn)正丙醇的能力。

挑選6株已保藏且報(bào)道的在不同香型白酒釀造過程占優(yōu)勢地位的Lactobacillus屬微生物作為實(shí)驗(yàn)菌株[32-37]，驗(yàn)證其代謝產(chǎn)正丙醇的能力。具體種屬為布赫內(nèi)氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri）、面包乳桿菌（Lactobacillus panis）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、橋乳桿菌（Lactobacillus pontis）、耐酸乳桿菌（Lactobacillus acetotolerans）、戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentose），編號分別為Lac1～Lac6。

2.4 乳酸菌產(chǎn)正丙醇結(jié)果分析

2.4.1 發(fā)酵液中正丙醇含量分析方法的建立

依據(jù)HS-GC-MS方法對發(fā)酵液進(jìn)行分析，通過譜庫譜圖比對和標(biāo)準(zhǔn)品比對，確認(rèn)可檢出內(nèi)標(biāo)物質(zhì)叔戊醇和目標(biāo)物質(zhì)正丙醇。采用HS-GC-MS法測得的發(fā)酵液的總離子流色譜圖見圖2。

圖2 乳桿菌發(fā)酵液正丙醇含量HS-GC-MS分析的總離子流圖Fig.2 Total ion chromatogram of fermentation broth of Lactobacillusdetected by HS-GC-MS

將配制好的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行靜態(tài)頂空氣-相色譜-質(zhì)譜分析，數(shù)據(jù)分析后得到正丙醇標(biāo)準(zhǔn)曲線，并以正丙醇與叔戊醇的峰面積比值為x，發(fā)酵液中正丙醇含量為y，計(jì)算得到該標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程y=24.965 5x+0.301 1，其線性范圍為0.79～159.12 mg/L，線性關(guān)系良好（R2=0.999 9），平均加標(biāo)回收率為102.70%。以信噪比為10為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算得到該方法的定量限為0.386 mg/L。

2.4.2 正丙醇含量分析

將制備好的6株供試菌株種子液1mL分別接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，以不接菌作為空白對照（CK），37℃厭氧發(fā)酵5～7 d，其發(fā)酵液中正丙醇含量檢測結(jié)果如圖3所示。

圖3 乳桿菌發(fā)酵液中正丙醇含量Fig.3 1-propanol content in fermentation broth ofLactobacillus

由圖3可知，接種6株Lactobacillus屬微生物的發(fā)酵液均有正丙醇的檢出，其中面包乳桿菌（Lactobacillus panis）發(fā)酵液檢出量最高，其含量為263.7 mg/L，是目前已有文獻(xiàn)報(bào)道的白酒產(chǎn)正丙醇的酵母菌[15]與芽孢桿菌[18]純菌發(fā)酵液中正丙醇含量的3.6倍與4.5倍。該結(jié)果表明白酒釀造過程中存在能夠代謝產(chǎn)正丙醇的乳桿菌屬微生物。

3 結(jié)論

本研究闡述了一種目標(biāo)風(fēng)味物質(zhì)微生物溯源的新方法。通過KEGG數(shù)據(jù)庫明確目標(biāo)風(fēng)味物質(zhì)代謝途徑及其催化的關(guān)鍵酶；并利用NCBI數(shù)據(jù)庫確定表達(dá)關(guān)鍵酶的微生物種類信息，同時(shí)對樣品進(jìn)行微生物群落結(jié)構(gòu)分析，對比樣品微生物群落結(jié)構(gòu)與表達(dá)關(guān)鍵酶微生物信息，將分類地位相同的微生物作為目標(biāo)菌株；以此微生物種屬開展篩選與功能研究。該方法具有工作量小、目的性強(qiáng)等優(yōu)勢，同時(shí)也可為其他食品發(fā)酵過程中產(chǎn)特征風(fēng)味物質(zhì)的微生物溯源提供新思路。

本研究利用上述方法開展白酒中產(chǎn)正丙醇微生物的補(bǔ)充溯源，發(fā)現(xiàn)在純菌發(fā)酵條件下，研究的6株乳桿菌屬（Lactobacillus）均能代謝生成正丙醇，其中面包乳桿菌（Lactobacillus panis）正丙醇產(chǎn)量最高，為263.7 mg/L，顯著高于已報(bào)道的白酒釀造過程中酵母菌與芽孢桿菌的正丙醇產(chǎn)量。該研究結(jié)果表明，乳酸桿菌是白酒釀造過程中正丙醇的另一重要微生物來源，但由于白酒釀造體系中復(fù)雜的微生物組成、發(fā)酵環(huán)境與營養(yǎng)條件對微生物的代謝產(chǎn)物種類與含量均有重要影響，因此，乳桿菌屬微生物在釀造過程中的正丙醇代謝能力及貢獻(xiàn)仍需進(jìn)一步探索，這將為調(diào)控白酒中正丙醇的含量奠定理論基礎(chǔ)。