王榮榮，張小雨，張嬌嬌，賈玉香，王家東，杜 鵬，鄭 宇，宋 佳*

（1.信陽農(nóng)林學(xué)院 食品學(xué)院，河南 信陽 464000；

2.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院天津市微生物代謝與發(fā)酵過程控制技術(shù)工程中心，天津 300457；

3.信陽農(nóng)林學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，河南 信陽 464000）

燕麥（Avena sativaL.）屬禾本科植物，是集食用、飼用、經(jīng)濟(jì)、生態(tài)與社會(huì)價(jià)值于一體的農(nóng)作物[1-2]。燕麥具有較高的營養(yǎng)價(jià)值，富含淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪酸、維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，同時(shí)富含豐富的膳食纖維，有促腸胃蠕動(dòng)、降血脂、降血糖、抗氧化、減肥、增強(qiáng)免疫力等功效[3-8]。燕麥的抗氧化成分主要是多酚黃酮類物質(zhì)，同時(shí)燕麥中的維生素E（vitamin E，VE）、甾醇、羥基脂肪酸也有一定的抗氧化作用[9-11]。β-葡聚糖作為目前燕麥功能成分研究熱點(diǎn)之一，已被證實(shí)燕麥降血脂和降餐后血糖功能與其富含的β-葡聚糖密切相關(guān)，燕麥中β-葡聚糖具有降低血清膽固醇、調(diào)節(jié)血糖水平、改善腸道菌群、增強(qiáng)免疫力、保護(hù)肝損傷等功能[12-16]。

蘋果（Malus pumilaMill.）中含有糖類、果膠、維生素、礦物質(zhì)及有機(jī)酸等多種成分[17]。蘋果醋是蘋果汁經(jīng)酵母菌、醋酸菌等微生物發(fā)酵而成。近年來研究發(fā)現(xiàn)，蘋果醋具有促進(jìn)新陳代謝、調(diào)節(jié)酸堿平衡、消除疲勞等功能[18]。蘋果醋能清洗消化系統(tǒng)，促進(jìn)關(guān)節(jié)、血管及其他內(nèi)臟等器官長期積累的毒素代謝，還具有降低血脂和促進(jìn)排毒的作用[19]。

本研究將燕麥粉碎后，混合蘋果汁進(jìn)行酒精發(fā)酵，后接種醋酸菌進(jìn)行醋酸發(fā)酵制備燕麥蘋果復(fù)合果醋，通過單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化醋酸發(fā)酵工藝，并利用2,2'-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonat，ABTS）法和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）法對(duì)燕麥蘋果醋黃酮類物質(zhì)抗氧化活性進(jìn)行測定分析，并采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀對(duì)產(chǎn)品中的黃酮類化合物進(jìn)行檢測分析，為產(chǎn)業(yè)化開發(fā)燕麥蘋果復(fù)合果醋產(chǎn)品提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

燕麥、鮮蘋果、蔗糖：市售；活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）CP-A11：天津科技大學(xué)微生物制藥研究室；無水乙醇、甲基叔丁基醚、甲醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉（均為分析純）：天津天力化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖（分析純）：山東西王糖業(yè)有限公司；蛋白胨（生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；硅烷化試劑（N，O-雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（bis（trimethylsilyl）trifluoroacetamide，BSTFA）+1%三甲基氯硅烷trimethylchlorosilane，TMCS）（色譜純）：美國Sigma公司。

GY培養(yǎng)基：1%酵母膏，3%葡萄糖，1%蛋白胨，0.5%碳酸鈣，3.5%vol乙醇。

1.2 儀器與設(shè)備

7890B-5977A型氣質(zhì)聯(lián)用儀：美國安捷倫公司；TG16-WS型高速離心機(jī)：長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；FD-1C-50真空冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康儀器有限公司；200Y粉碎機(jī)：永康市鉑歐五金制品有限公司；HLG-A恒溫振蕩培養(yǎng)箱：太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；HH-2水浴鍋：邦西儀器科技（上海）有限公司；C18固相萃取柱：美國Waters公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 燕麥蘋果復(fù)合果醋加工工藝流程及操作要點(diǎn)

操作要點(diǎn)：取新鮮經(jīng)清洗、去核去皮的蘋果破碎后用螺旋榨汁機(jī)榨汁，過濾得到的蘋果汁與粉碎并過40目篩燕麥按一定比例調(diào)配，并添加適量蔗糖至總糖含量為200～220 g/L，然后按照15%接種量接入已經(jīng)用33～35℃溫水活化30 min的酵母液，25℃靜置發(fā)酵10 d，即得燕麥蘋果復(fù)合果酒，此時(shí)酒精度為8%vol～12%vol，總糖含量為（11.9±1.5）g/L。調(diào)整初始酒度為4%vol～12%vol，將已用GY培養(yǎng)基活化12 h后的醋酸菌按2%～12%接種量接入燕麥蘋果復(fù)合果酒，26～36℃、120～200 r/min條件下恒溫發(fā)酵8 d，可得燕麥蘋果復(fù)合果醋，最后經(jīng)板框壓濾機(jī)壓濾澄，進(jìn)行巴氏消毒（68～70℃、30 min），即得燕麥蘋果復(fù)合果醋。

1.3.2 醋酸發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

以總酸含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別考察影響醋酸發(fā)酵的主要因素：醋酸菌接種量、發(fā)酵溫度、搖床轉(zhuǎn)速及發(fā)酵初始酒精度等單因素對(duì)醋酸發(fā)酵的影響。裝液量為50mL/250mL，每組設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn)，具體考察條件參數(shù)如下所示：考察不同接種量（2%、4%、6%、8%、10%、12%）、不同發(fā)酵溫度（26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃）、不同搖床轉(zhuǎn)速為（120 r/min、140 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min）及不同初始酒精度（4%vol、6%vol、8%vol、10%vol、12%vol）對(duì)總酸含量的影響。

1.3.3 醋酸發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

采用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以接種量（A）、初始酒精度（B）、搖床轉(zhuǎn)速（C）、發(fā)酵溫度（D）為影響因素，以總酸含量（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)4因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)，各因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

1.3.4 抗氧化活性分析

（1）黃酮類物質(zhì)的提取

參照文獻(xiàn)[20]的方法，取燕麥蘋果復(fù)合果醋100 mL于5 000 r/min轉(zhuǎn)速條件下離心，上清液調(diào)pH值至2.0（此時(shí)黃酮類化合物的穩(wěn)定性最好，不易被氧化），通過C18固相萃取柱，控制流速1 mL/min。將C18固相萃取柱置于冷凍干燥機(jī)中凍干除去水分，同時(shí)減少黃酮類物質(zhì)被氧化，用于后續(xù)氣質(zhì)聯(lián)用分析，用等體積的洗脫液（甲基叔丁基醚∶甲醇=3∶2，V/V）洗脫柱填料中的黃酮類物質(zhì)，將收集到的洗脫液氮?dú)獯抵粮?，將得到的黃酮類物質(zhì)干粉分成兩部分，一部分用于后續(xù)的抗氧化試驗(yàn)研究，另一部分加入1 mL硅烷化試劑于50℃反應(yīng)60min，將反應(yīng)液過0.22μm濾膜備用。

（2）ABTS自由基清除率的測定[21]

維生素C（VitaminC，VC）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：將維生素C標(biāo)準(zhǔn)液稀釋成1 mg/100 mL、5 mg/100 mL、10 mg/100 mL、15mg/100mL、20mg/100mL。在96孔板中加入200μLABTS工作液后，加入10 μL各質(zhì)量濃度VC稀釋液，空白組中為10μL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS），混勻，室溫避光孵育5min，測定波長734nm處的吸光度值，以VC質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，ABTS自由基清除率（y）為縱坐標(biāo)，繪制VC標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=4.9089x-3.47534，相關(guān)系數(shù)R2為0.9997。ABTS自由基清除率計(jì)算公式如下：式中：A空白表示空白組的吸光度值，A樣品表示樣品組的吸光度值。

抗氧化活性測定：將復(fù)合果醋黃酮類物質(zhì)溶解后，在96孔板中加入200 μL ABTS工作液后，加入10 μL的上述制備的粗黃酮凍干樣品，混勻，室溫避光孵育5 min，測定波長734 nm處的吸光度值，按照VC標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算燕麥蘋果醋黃酮類物質(zhì)的抗氧化活性，結(jié)果以維生素C等值當(dāng)量（vitamin C equivalent，VCE）表示（mg VCE/L）。

（3）DPPH自由基清除率的測定[22]

取1 mL粗黃酮溶液（0.025 mg/mL、0.050 mg/mL、0.100 mg/mL、0.500mg/mL、1.000mg/mL）于具塞試管中，與0.1mmol/L的DPPH自由基乙醇溶液1mL混合反應(yīng)20min后，355 r/min離心10 min，取上清液在波長517 nm處測定吸光度值，記為Ai，同時(shí)用乙醇作空白對(duì)照，吸光度值記為Ac，以及1mL樣品水溶液和1mL無水乙醇混勻按上述方法測定吸光度值，記為Aj。DPPH自由基清除率計(jì)算公式如下：

1.3.5 燕麥蘋果復(fù)合果醋中黃酮類物質(zhì)檢測[23]

采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）法測定復(fù)合果醋中黃酮類物質(zhì)。GC條件：HP-5色譜柱（30 mm×0.25 mm×1 μm），進(jìn)樣口溫度300℃；載氣為氦氣（He），流速1mL/min；進(jìn)樣量1.5μL，分流比10∶1；升溫程序：初始溫度為60℃，以5℃/min升至300℃。MS條件：電子電離（electronic ionization，EI）源，離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；數(shù)據(jù)采集頻率3 Hz；掃描范圍45～999 m/z。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)樣品至少3次重復(fù)數(shù)據(jù)，采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行方差分析和Tukey's相關(guān)性分析，采用Origin 8.5軟件作圖，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）表示，顯著性差異以P＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 醋酸發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 接種量對(duì)總酸含量的影響

發(fā)酵過程接種量的大小會(huì)影響發(fā)酵時(shí)間的長短，進(jìn)而影響總酸的含量[24]。本試驗(yàn)在發(fā)酵溫度30℃、搖床轉(zhuǎn)速150 r/min、初始酒精度為8%vol條件下，醋酸菌接種量設(shè)置為2%、4%、6%、8%、10%、12%（V/V），發(fā)酵8d后，測定各組總酸含量，結(jié)果見圖1。由圖1可知，總酸含量隨接種量在2%～8%（V/V）范圍內(nèi)增加而增高，并在接種量＞8%（V/V）之后趨于穩(wěn)定。因此，最適醋酸菌接種量為8%（V/V）。

圖1 接種量對(duì)總酸含量的影響Fig.1 Effect of inoculum on total acid content

2.1.2 發(fā)酵溫度對(duì)總酸含量的影響

微生物發(fā)酵過程中各種酶的作用至關(guān)重要，溫度是影響酶活力的重要因素之一。正常情況下，溫度過高或偏低都會(huì)直接影響酶活力[25]。醋酸菌在不同的生長階段對(duì)溫度的敏感性也不同，在接種量為8%、搖床轉(zhuǎn)速150 r/min、初始酒精度為8%vol條件下，發(fā)酵溫度設(shè)置為26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃，發(fā)酵8 d后，測定各組總酸含量，結(jié)果見圖2。由圖2可知，總酸含量隨溫度在26～32℃范圍內(nèi)增加而增高，并在溫度為32℃時(shí)總酸含量最高，溫度高于32℃之后下降。因此，最適發(fā)酵溫度為32℃。

圖2 發(fā)酵溫度對(duì)總酸含量的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on total acid content

2.1.3 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)總酸含量的影響

搖床轉(zhuǎn)速與發(fā)酵液中的溶解氧呈正相關(guān)關(guān)系[26]。對(duì)于醋酸菌等好氧微生物而言，發(fā)酵液中的溶解氧會(huì)影響其自身的生長代謝。在接種量為8%、發(fā)酵溫度為32℃、初始酒精度為8%vol條件下，搖床轉(zhuǎn)速設(shè)置為120 r/min、140 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min，發(fā)酵8 d后，測定各組總酸含量，結(jié)果見圖3。由圖3可知，總酸含量隨轉(zhuǎn)速在120～160 r/min范圍內(nèi)增加而增高，并在轉(zhuǎn)速為160 r/min時(shí)總酸含量最高，轉(zhuǎn)速＞160 r/min之后總酸含量趨于穩(wěn)定。因此，最適轉(zhuǎn)速為160 r/min。

圖3 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)總酸含量的影響Fig.3 Effect of rotational speed on total acid content

2.1.4 初始酒精度對(duì)總酸含量的影響

醋酸菌對(duì)酒精具有一定的耐受性，低酒精濃度下有利于酸的產(chǎn)生，但較高的酒精濃度會(huì)影響醋酸菌的活性[27]。在接種量8%、發(fā)酵溫度32℃、搖床轉(zhuǎn)速160 r/min條件下，初始酒精度設(shè)置為4%vol、6%vol、8%vol、10%vol、12%vol，發(fā)酵8d后，測定各組總酸含量，結(jié)果見圖4。由圖4可知，總酸含量隨初始酒精度在4%vol～8%vol范圍內(nèi)增加而增高，并在初始酒精度為8%vol時(shí)總酸含量最高，初始酒精度＞8%vol之后總酸含量下降。因此，最適初始酒精度為8%vol。

圖4 初始酒精度對(duì)總酸含量的影響Fig.4 Effect of initial alcohol content on total acid content

2.2 醋酸發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

以單因素試驗(yàn)得到對(duì)總酸含量影響較大的4個(gè)因素進(jìn)行4因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2，方差分析見表3。

采用Design-Expert.V8.0.6.1對(duì)表2結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析，經(jīng)分析得到一個(gè)多元二次回歸方程：

Y=6.64-0.058A+0.022B+0.046C-0.33D+0.032AB-0.027AC+0.041AD+0.010BC-0.014BD+6.27E-003CD-0.043A2+9.84E-003B2+0.052C2+0.19D2

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

續(xù)表

注：“**”表示對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01）；“*”表示對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05）。

由表3可知，該回歸方程模型P值＜0.000 1，表明模型極顯著；模型的失擬項(xiàng)的F值和P值分別為2.68和0.177 6，證明失擬項(xiàng)不顯著，表明回歸模型是合適的，可以用來分析和預(yù)測醋酸發(fā)酵工藝條件。模型決定系數(shù)R2為0.937 0，說明93.70%的期望值變化可以用這一多項(xiàng)式解釋。一次項(xiàng)A對(duì)響應(yīng)值的影響顯著（P＜0.05）、一次項(xiàng)D和二次項(xiàng)D2對(duì)響應(yīng)值的影響極顯著（P＜0.01）。由Design-Expert8.06軟件得出最佳醋酸發(fā)酵工藝條件為醋酸菌接種量7.3%、初始酒精度8.9%vol、轉(zhuǎn)速169r/min、發(fā)酵溫度31℃。在此條件下總酸含量理論值為7.34 g/100 mL。為了便于實(shí)際操作，將上述最佳醋酸發(fā)酵工藝條件為接種量7%、初始酒精度9%vol、轉(zhuǎn)速170r/min、發(fā)酵溫度31℃。以此條件進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，最終得到的總酸含量為（7.35±0.04）g/100mL，與理論值基本一致，說明響應(yīng)面法得出的醋酸發(fā)酵工藝條件是可行的。

2.3 燕麥蘋果醋抗氧化活性分析[28-30]

2.3.1 ABTS法分析燕麥蘋果復(fù)合果醋抗氧化活性

利用ABTS法對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行測定可得出不同質(zhì)量濃度粗黃酮與ABTS清除率的關(guān)系，結(jié)果如圖5所示，隨著燕麥蘋果復(fù)合果醋中黃酮物質(zhì)含量的增加，其ABTS自由基清除率逐步升高，同時(shí)依據(jù)1.3方法計(jì)算出燕麥蘋果醋黃酮類物質(zhì)抗氧化活性值為（100.27±3.53）mgVCE/L，能有效清除ABTS自由基，表現(xiàn)出較高的抗氧化活性。

圖5 燕麥蘋果復(fù)合果醋粗黃酮清除ABTS曲線Fig.5 ABTS scavenging curve of flavonoids in oat-apple compound fruit vinegar

2.3.2 DPPH法分析燕麥蘋果復(fù)合果醋抗氧化活性

由圖6可知，DPPH自由基清除能力與燕麥蘋果復(fù)合果醋提取黃酮類物質(zhì)含量呈量效關(guān)系，即隨著黃酮類物質(zhì)含量的增加，DPPH自由基清除能力逐漸增加，表明燕麥蘋果復(fù)合果醋中黃酮類物質(zhì)具有較好的抗氧化活性，清除率可達(dá)（60.21±1.56）%，其DPPH自由基清除率與鄭淑彥[31]利用氯仿/乙酸乙酯萃取枳椇醋得到物質(zhì)的DPPH自由基清除活性一致。

圖6 燕麥蘋果復(fù)合果醋粗黃酮含量清除DPPH曲線Fig.6 DPPH scavenging curve of flavonoids in oat-apple compound fruit vinegar

2.4 燕麥蘋果醋中黃酮化合物GC-MS檢測結(jié)果

通過氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)燕麥蘋果醋中的黃酮類化合物進(jìn)行檢測，總離子流色譜圖見圖7。

圖7 燕麥蘋果復(fù)合果醋黃酮化合物GC-MS分析總離子流圖Fig.7 Total ions chromatogram of flavonoids in oat-apple compound fruit vinegar analyzed by GC-MS

根據(jù)燕麥蘋果醋樣品GC-MS總離子流圖中質(zhì)譜特征、保留參數(shù)，比對(duì)查詢美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（national institute of standards and technology，NIST）11譜庫，得到樣品中黃酮類化合物種類、結(jié)構(gòu)式及特征峰保留時(shí)間，結(jié)果見表4。由表4可知，燕麥蘋果復(fù)合果醋中共檢測到3種黃酮類化合物，分別為木犀草素、山柰酚和槲皮素。實(shí)驗(yàn)研究證明[32-33]，這3種黃酮類化合物具有較高的抗氧化活性。

表4 燕麥蘋果復(fù)合果醋中黃酮類化合物GC-MS分析結(jié)果Table 4 Results of flavonoids in oat-apple compound fruit vinegar analyzed by GC-MS

3 結(jié)論

通過響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)燕麥蘋果醋醋酸發(fā)酵階段影響因素進(jìn)行分析并對(duì)工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，在接種量7%（V/V）、發(fā)酵溫度31℃、轉(zhuǎn)速170r/min、初始酒精度9%vol條件下，總酸含量為（7.35±0.04）g/100mL，比未優(yōu)化前提高19.67%。通過ABTS法對(duì)燕麥蘋果醋黃酮類物質(zhì)抗氧化活性進(jìn)行測定，其抗氧化活性值為（100.27±3.53）mgVCE/L，對(duì)ABTS自由基有較好的清除能力，同時(shí)測定其DPPH自由基清除率可達(dá)（60.21±1.56）%，表明燕麥蘋果醋具有較高的抗氧化活性。并利用GC-MS法從燕麥蘋果醋產(chǎn)品中共檢出3種黃酮類化合物，分別為木犀草素、山柰酚及槲皮素。研究結(jié)果對(duì)燕麥蘋果醋產(chǎn)品開發(fā)提供了技術(shù)支持。